Name: En Vitro Generación de células dendríticas murinas plasmocitoide de común linfoide Progenitores utilizando el sistema de alimentación AC-6 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Aprende a generar células dendríticas plasmocitoide in vitro a partir de progenitores linfoide común utilizando el sistema de alimentación AC-6 con Flt3 ligando. Este método eficiente permite producir grandes cantidades de pDCs para investigar su desarrollo y aplicaciones terapéuticas en enfermedades autoinmunes.

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Estamos muy agradecidos a los Dres. Markus Manz y Irving Weissman para proporcionar reactivos. También reconocemos el servicio prestado por el análisis de citometría de flujo y Cell Sorting Core Instalación de la Primera y Segunda Laboratorio Core en la Universidad Nacional de Taiwán Facultad de Medicina y Hospital NTU, respectivamente. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología, Taiwán (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) y los Institutos Nacionales de Investigación de la Salud, Taiwán (INDH-EX102-10256SI y INDH-EX103-10256SI).

C57BL / 6 ratones de tipo salvaje se compraron desde el Centro Nacional de Animales de Laboratorio (NLAC), Taiwán. Todos los ratones fueron criados y mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos. Protocolos y procedimientos de uso de animales fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Nacional de Taiwán Colegio de Medicina (Número de Permiso: 20120075). Además, los investigadores hicieron todo lo posible para reducir el potencial de dolor, sufrimiento o angustia en los animales, mientras que la realización de experimentos. Todos los procedimientos descritos se llevaron a cabo a temperatura ambiente, mientras que el uso de guantes. 1. Preparación de 6-CA células Feeder Nota: El AC-6,21 (AC-6 en corto) línea celular estromal 18 (proporcionado por Weissman I., Universidad de Stanford) debe mantenerse en RPMI suplementado con suero inactivado por calor 15% bovino fetal (FBS). Para servir como células alimentadoras, AC-6-γ células son irradiadas con 3000 rad (30 Gy) un día antes de que el co-cultivo para evitar su proliferación. Nota ªAC-6 células tienden a perder su capacidad de diferenciación de apoyo si se deja de hacinamiento durante el mantenimiento, o si su número pasaje es más de 20. <ol><li> Wash AC-6 células una vez con 1 ml de fosfato solución salina tamponada de Dulbecco (DPBS) y quitar DPBS por aspiración. Tratar AC-6 células con 0,8 ml de solución de tripsina (0,05% de tripsina y EDTA 0,5 mM en DPBS) durante 3-5 min a 37 ° C, 5% de CO 2 y luego se detiene la reacción mediante la dilución con 10 volúmenes de medio de cultivo a hacer suspensión de células individuales. </li><li> Semilla AC-6 células en 5.9x10 4 células / pocillo en placas de 12 pocillos y se incuban a 37 ° C, 5% de CO 2 O / N. Nota: La densidad del AC-6 células es muy importante ya que una menor densidad favorecerá la generación de los CDC. La siembra a una densidad de 5.9x10 4 células / pocillo permitirán AC-6 para llegar a la confluencia al día siguiente, que es óptima para la derivación de PDC de CLPs. </li><li> Irradiar AC-6 células a 3000 rad (30 Gy) utilizando γ-irradiador. Nota: La dosis utilizada para irradiar AC-6 está optimizado para evitar que las células proliferen y, sin embargo mantenerlos viables tiempo suficiente para proporcionar las citoquinas y contacto célula-célula necesarios para la diferenciación de los países en desarrollo de CLPs. </li><li> Aspirar medio y reemplazar con 1 ml de RPMI completo (RPMI con inactivado por calor 10% de FBS, 50 mg / ml de gentamicina y 50 mM β-mercaptoetanol). </li></ol> 2. Las células Isolate BM a partir de ratones <ol><li> Sacrificar los ratones por asfixia con CO2 y dislocación cervical. Coloque los ratones en una bandeja de disección y esterilizar con etanol al 70%. Hacer una incisión en la mitad del abdomen y retirar la piel de la parte distal del ratón incluyendo la piel que cubre las extremidades inferiores. </li><li> Diseccionar los ratones en una campana semi-estéril. Para liberar el fémur y la tibia, cortar el fémur arriba y tibias por debajo de la articulación de la rodilla. Separar los músculos de los huesos utilizando tijeras y colocar los huesos en una placa de Petri de 6 cm que contiene 5 ml de RPMI completo. </li><li> Mover a una campana de cultivo estéril. Llene una jeringa de 3 ml conectada a una aguja 27G con RPMI completo. Cortar los dos extremos de los huesos con unas tijeras, e inserte la aguja 27G para limpiar la médula de los huesos inyectando suavemente RPMI completo una vez desde cada extremo. </li><li> Preparar una suspensión de células por pipeteo suave de las células arriba y abajo de 3-5 veces en la placa de cultivo utilizando la jeringa sin la aguja. </li><li> Centrifugar las células durante 5 min a 500 xg y decantar el sobrenadante. </li><li> Lisar células rojas de la sangre con 1 ml de tampón ACK (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO3, EDTA 0,1 mM) incubando durante 1 min y detener la reacción diluyendo con 10 volúmenes de RPMI completo. Permitir que las células en reposo durante 5 minutos con el fin de precipitar por grupos de células muertas y restos de tejido por la gravedad. Nota: No se pare más de 5 minutos ya que esto dará lugar a la pérdida de células debido a la sedimentación de células viables. </li><li> Lentamente decantar el sobrenadante que contiene células a un nuevo tubo de escombros dejandoatrás en tubo original. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 500 xg para sedimentar las células, a continuación, retirar y desechar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células totales BM (típicamente 4-6 x 10 7 BM células se obtienen de un ratón) en 100 l de tampón FACS (PBS 1x + 2% de FBS + 1 mM EDTA). </li></ol> 3. FACS análisis y clasificación de CLPs <ol><li> Añadir anti-CD16 / 32 (clon de hibridoma sobrenadante 2.4G2, 50 l / reacción ó 1-2 g / reacción) en las células en tampón FACS (paso 2.9) durante 1-2 min con el fin de bloquear los receptores de Fc. Nota: Anti-CD16 / 32 también se denomina bloque de Fc, que se añade para evitar la unión no específica de anticuerpos a células que expresan receptores de Fc, incluyendo los granulocitos, monocitos y linfocitos B. </li><li> Simultáneamente teñir las células con los siguientes anticuerpos marcados con colorante fluorescentes (por 4x10 7 células) durante 15 min en hielo, evitando la luz ambiente. Anticuerpos: marcadores de linaje PE-conjugados (0,2 g cada uno) incluyendo anti-CD3 (17A2), anti-CD8 (53-6,7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1 / 70), anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119), y anti-MHC-II (RMIN-4), 0,2 g anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 g anti-Sca-1-FITC (D7), 0,4 g anti-M-CSFR-APC (AFS98), y 0,2 g anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34). </li><li> Lavar las células con 3 ml de tampón FACS, y centrifugar durante 5 min a 500 x g. </li><li> Resuspender las células en 300 L de tampón FACS y celdas de filtración a través de un filtro de células 40 M. </li><li> Lave el tubo con un tampón adicional 100 l FACS para recuperar las células restantes y filtrar en un tubo estéril FACS de clasificación utilizando el mismo filtro de células. </li><li> Realizar análisis de citometría de flujo inmediatamente después de la tinción utilizando filtros y tensiones adecuadas para la detección de señales. Utilice 488 nm láser para detectar los anticuerpos marcados con PerCP-Cy5.5 FITC,, 561 nm láser para detectar el PE y los anticuerpos PE-Cy7 labelded y 633 nm laser para detectar el anticuerpo marcado con APC. </li><li> Clasificar CLPs de acuerdo con los siguientes marcadores lin - c-kit int Sca-1 int M-CSFR - IL-7Rα + (como manchado en el paso 3.2) utilizando un clasificador de células. Recoger las células clasificadas en un tubo de 15 ml que contiene 8 ml de RPMI completo como un colchón. </li><li> Registre el número absoluto de células clasificadas como se muestra por el clasificador de células al final de la carrera. Típicamente, 5x10 4 CLPs se pueden obtener de la BM de un ratón. </li></ol> 4. cocultivo CLPs y AC-6 <ol><li> Centrifugar las células clasificadas desde el paso 3.7 durante 10 minutos a 500 x g, separar el sobrenadante y resuspender el botón celular suficiente RPMI completo para obtener una densidad celular alrededor de 5x10 4 células / ml. Seed 500 células / pocillo en la placa de 12 pocillos que contiene células alimentadoras preparados en el paso 1.4. </li><li> Añadir 100 ng / ml FL 19 (hu-Flt3L-Ig generado en la casa usando un sistema de expresión proporcionado por M. Manz, UniversiHospital de Ty Zürich, Suiza) y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 con el monitoreo visual periódica del desarrollo DC bajo un microscopio. Nota: disponible comercialmente FL humana recombinante o el ratón FL se pueden utilizar como un sustituto para hu-Flt3L-Ig para apoyar el desarrollo DC. </li><li> Recoger las células en el sobrenadante a 12 días y lavar los pocillos una vez con 0,5 ml de medio RPMI completar la combinación de los sobrenadantes resultantes. Añadir 0,5 ml de medio fresco y desechar las células adherentes con un raspador de células. </li><li> Combinar el medio que contiene células de ambas partes y centrifugar durante 5 min a 500 x g. </li><li> Sobrenadante y resuspender las células en tampón FACS Decantar 50 l. Añadir 50 l anti-CD16 / 32 hibridoma sobrenadante y se incuba durante 1-2 minutos para bloquear los receptores Fc. </li><li> Enumerar y manchar todas las células con los siguientes anticuerpos (0,05 g cada uno) anti-CD11c-APC (N418), anti-CD11b-FITC y anti-B220-PE. </li><li> Lavar y centrifugar las células como describird en el paso 3.3. </li><li> Resuspender las células en 100 l de tampón FACS, puerta de CD11c + y analizar para el CDC (CD11c + CD11b + B220 -) y PDC (CD11c + CD11b - B220 +) 17. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí se describe un sistema de cultivo in vitro para la generación de DCs robusta, y PDC, en particular, a partir de un pequeño número de CLPs. La singularidad de este sistema de cultivo se debe a la utilización de AC-6 células, una línea celular estromal, como alimentadores. Este enfoque ha sido demostrado para proporcionar no sólo las citoquinas, tales como IL-7, SCF, M-CSF y FL 20, sino también el contacto célula-célula 21 necesario para apoyar el desarrollo DC. AC-6 células se han util...

Las células dendríticas (DC) son células presentadoras de antígeno profesionales que desempeñan un papel importante en el control de las respuestas inmunitarias 1. Mientras que los países en desarrollo son heterogéneos, que se pueden clasificar en dos poblaciones, convencional DC (CDC) y los DC plasmocitoides (PDC) 2,3. Además de los órganos linfoides, CDCs y PDC también se encuentran en tejidos incluyendo pulmón, intestino, piel y 2. La morfología de los CDC y PDC difiere, con CDC expositoras proyecciones dendríticas como y la forma de PDC son como células más plasma. Además, el marcador DC ratón común, CD11c, está más altamente expresado en CDC que en PDC. Por otra parte, CDC puede ser dividida en CD11b + CD24 - CDC y CD11b - CD24 + CDC, los cuales expresan mayores niveles de MHC de clase II y moléculas coestimuladoras que hacen PDC 2. PDC maduros, por otro lado, se ha demostrado para expresar selectivamente Siglec-H y BST2 4. Functionally, CDCs son mejores células presentadoras de antígenos que son PDC; sin embargo, PDC pueden producir una gran cantidad de interferón de tipo I sobre la infección por el virus o la estimulación inflamatoria 5. Ambos CDC y PDC son de corta duración, y por lo tanto, deben ser constantemente repuestos de progenitores dentro de la médula ósea (MO) 6,7. La transferencia adoptiva de células progenitoras mieloides comunes (CMPS) y progenitores linfoides comunes (CLPS) en ratones letalmente irradiados demuestra que CDCs y PDC pueden ser generados a partir de ambos linajes 8-10. Sin embargo, no es un subconjunto de PDC que expresan RAG1 / 2 y poseen segmentos DJ reordenados el locus IgH en 11,12. Estas células también comparten similitudes moleculares con linfocitos B, incluyendo la expresión del marcador B220, los receptores de ácido nucleico de detección (TLR7 / TLR9), y factores de transcripción (SPIB y BCL11A) 13, todas las características que se cree firmas del linaje linfoide. Por lo tanto, CLPs pueden ser buenas opciones para la generación in vitro de PDC, debido a la similitud linaje. Si bien la frecuencia de ambos CDCs y PDC en humanos y ratones es muy baja 6, países en desarrollo, en particular los CDC, se puede generar in vitro a partir BM o progenitores en presencia de citoquinas, tales como GM-CSF 11,14 o ligando Flt3 (FL ) utilizando sistemas de alimentación libre de 11,15,16. Desafortunadamente, sin embargo, no es posible producir un gran número de PDC in vitro utilizando FL 11,15,16. Anteriormente hemos demostrado que la PDC se pueden generar de manera eficiente in vitro a partir CLPs utilizando el sistema de alimentación AC-6 17. La ventaja de usar la línea celular estromal AC-6 en el sistema de cultivo es que proporciona contacto célula-célula y la secreción de citocinas que soportan la generación de un gran número de PDC de CLPs. Aunque la producción con este sistema es bastante robusto, i se requiere la replicación cuidadosa de los procedimientos descritos a continuaciónorden n para asegurar la generación eficiente de PDC.

<table><tbody><tr><td>Anti-ratón Ly6g/Ly6c (PE), clon RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108408</td><td>marcador</td></tr><tr>de linaje<td>Anti-ratón NK1.1 (PE), clon PK136</td><td>Biolegend</td><td>108708</td><td>marcador de linaje</td></tr><tr><td>Anti-ratón&nbsp; CD11b (PE), clonM1/70</td><td>Biolegend</td><td>101208</td><td>marcador de linaje</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD19 (PE), clon eBio1D3</td><td>Biolegend</td><td>115508</td><td>marcador de linaje</td></tr><tr><td>Anti-ratón B220 (PE), clon RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td>marcador de linaje/FACS</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD3 (PE), clon 17A2</td><td>Biolegend</td><td>100308</td><td>marcador de linaje</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD8a (PE), clon 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100707</td><td>marcador de linaje</td></tr><tr><td>Anti-ratón MHC-II (PE), clon NIMR-4</td><td>Biolegend</td><td>107608</td><td>marcador de linaje</td></tr><tr><td>Anti-ratón Ter119 (PE), clon TER-119</td><td>Biolegend</td><td>116208</td><td>marcador de linaje</td></tr><tr><td>Anti-ratón Thy1.1 (PE), clon HIS51</td><td>eBioscience</td><td>12-0900-83</td><td>marcador de linaje</td></tr><tr><td>Anti-ratón M-CSFR (APC), clon AFS98</td><td>Biolegend</td><td>135510</td><td>FACS</td></tr><tr><td>C-Kit antiratón (PerCP/Cy5.5), clon 2B8</td><td>Biolegend</td><td>105824</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-ratón Sca-1 (FITC), clon D7</td><td>Biolegend</td><td>108106</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-ratón IL-7Ra (PE/Cy7), clon A7R34</td><td>Biolegend</td><td>135014</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD11c (PerCP/Cy5.5), clon N418</td><td>Biolegend</td><td>117328</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Antiratón CD11b (FITC), clon M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101206</td><td>FACS</td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Clasificador de células</td></tr><tr><td>FACS tubo de clasificación&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td>Software de análisis de flujo</td></tr></tbody></table>

en vitro generación de células dendríticas murinas plasmocitoide de común linfoide progenitores utilizando el sistema de alimentación ac-6

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Células dendríticas plasmacitoides (PDC) son potentes interferón de tipo I (células productoras de IFN-I) que se activan en respuesta a la infección o durante las respuestas inflamatorias. Por desgracia, el estudio de la función PDC se ve obstaculizada por su baja frecuencia en los órganos linfoides, y los métodos existentes para la generación in vitro DC favorecen predominantemente la producción de los CDC sobre PDC. Aquí presentamos un enfoque único para generar eficientemente PDC de progenitores linfoides comunes (CLPS) in vitro. Específicamente, el protocolo descrito detalles cómo purificar CLPs desde la médula ósea y generar PDC por cocultivo con AC-6 células alimentadoras gamma-irradiado en presencia de ligando de Flt3. Una característica única de este sistema de cultivo es que los CLPs migran por debajo de las células AC-6 y se convierten en células de adoquines en la zona de formación de, un paso crítico para la expansión de PDC. Morfológicamente distintos países en desarrollo, a saber, PDC y CDC, se generaron después de aproximadamente 2 semanas con una composición de 70-90% PDC en condiciones óptimas. Típicamente, el número de PDC generados por este método es más o menos 100 veces del número de CLPs sembradas. Por lo tanto, este es un sistema novedoso con el que para generar robustamente el gran número de PDC necesarias para facilitar estudios adicionales en el desarrollo y la función de estas células.

Un total de 4-6x10 7 células BM normalmente están aislados de los fémures y tibias de un solo 6/8 semanas de edad, de tipo salvaje C57BL / 6 mouse. Para resolver CLPs, células totales BM se tiñeron con anticuerpos conjugados con PE contra marcadores de linaje (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, Ter119, y MHC-II), anti -c-Kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC y anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analizados y ordenados con un clasificador de células. La estrategia de clasificación de CLP se mues...

En este estudio presentamos un sistema de cultivo in vitro que puede generar eficientemente pDCs mediante el co-cultivo de progenitores linfoides comunes con células alimentadoras AC-6 en presencia de ligando Flt3.

En Vitro Generación de células dendríticas murinas plasmocitoide de común linfoide Progenitores utilizando el sistema de alimentación AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un método eficiente para generar células dendríticas plasmocitoides o PDCs para el estudio de su desarrollo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como ¿cómo se regula el desarrollo de las PDCs? La principal ventaja de esta técnica es que permite el uso de un pequeño número de células progenitoras para generar eficientemente grandes cantidades de PDCs.Las implicaciones de esta técnica apuntan hacia el tratamiento de enfermedades autoinmunes asociadas a PDC, como el lupus sistémico, la atetosis y la psoriasis. Hoy, demostrará el procedimiento Xang, un excelente estudiante del laboratorio. El día anterior a la recolección de células de médula ósea, siembre 5,9 × 10⁴ células de la línea celular estromal AC6 por pocillo en los pocillos individuales de placas de 12 pocillos e incube las placas a 37 °C y 5 % de dióxido de carbono durante la noche. A la mañana siguiente, irradie con rayos gamma las células AC6 a 3000 rad y sustituya el medio de cultivo por un mililitro de medio completo.A continuación, coloque el número adecuado de ratones adultos de tipo silvestre C57 black six en una bandeja de disección y esterilice los animales con etanol al 70%. Luego, traslade la bandeja a una campana semiestéril y realice incisiones en la región media del abdomen de cada animal, retirando la piel de las partes distales, incluyendo las extremidades inferiores, para exponer los fémures y tibias. Corte el fémur por encima y las tibias por debajo de las articulaciones de la rodilla, y use tijeras para separar los músculos de los huesos a medida que se van recolectando. Coloque los huesos en una placa de Petri de seis centímetros que contenga cinco mililitros de RPMI completo y transfiera la placa de Petri a una campana de cultivo estéril.Ahora, llene una jeringa de tres mililitros equipada con una aguja de calibre 27 con RPMI completo y use tijeras para cortar ambos extremos de cada hueso. Introduzca la aguja en cada hueso y lave la médula con una inyección suave de RPMI completo una vez desde cada extremo. Luego, sin la aguja, aspire y dispense suavemente las células de tres a cinco veces en la placa de cultivo para obtener una suspensión de células individuales.Después de centrifugar las células, lice las células rojas con un mililitro de un tampón CK, deteniendo la reacción con 10 volúmenes de RPMI completo. Después de un minuto, deje que los agregados de células muertas y los restos se sedimenten durante cinco minutos y luego vierta cuidadosamente el sobrenadante en un nuevo tubo. Luego, tras centrifugar nuevamente las células, suspendemos las células totales de médula ósea en 100 microlitros de tampón fax para analizar los precursores linfoides comunes o CLPs mediante citometría de flujo.A continuación, bloquee las células con anti-CD16/32 durante uno o dos minutos, seguido de la tinción simultánea de las células con el cóctel de anticuerpos adecuado. Después de 15 minutos en hielo, lave las células con tres mililitros de tampón fax y re suspenda el botón en 300 microlitros de tampón fax fresco. Luego, filtre la suspensión celular a través de un filtro de 40 micrómetros y separe inmediatamente las células en un citómetro de flujo utilizando los filtros y voltajes adecuados.Recolecte las células de interés en un tubo de 15 mililitros que contenga ocho mililitros de RPMI completo. Para generar una población altamente enriquecida de PDCM, es fundamental separar la población adecuada de CLP de las células de médula ósea recolectadas para su cultivo in vitro con un sistema de alimentación Z seis. Al finalizar la clasificación, centrifugue las células y re suspenda el botón celular de CLP con suficiente RPMI completo para obtener una densidad celular de aproximadamente cinco veces 10 a la cuarta células por mililitro.A continuación, siembre 500 células por pocillo en la placa de 12 pocillos que contiene las células alimentadoras AC seis y suplemente los cultivos en co-cultivo con 100 nanogramos por mililitro de ligando FL tres; luego incube las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono, con un monitoreo visual periódico del desarrollo de las células dendríticas o CD bajo un microscopio. En el día 12, recolecte las células del sobrenadante del co-cultivo y lave cada pocillo una vez con medio RPMI completo de medio mililitro, reuniendo el sobrenadante resultante y los lavados. A continuación, añada medio fresco de medio mililitro a cada pocillo y utilice un raspador celular para desprender las células adherentes.Combine las células desprendidas con las células en suspensión y centrifugue la suspensión celular resultante. Re_suspenda el sedimento en 50 microlitros de tampón fax. Luego cuente las células y tiñalas para la expresión de CD11c, CD11b y B220 tras el bloqueo de FC.Como se acaba de demostrar, las células en co-cultivo pueden analizarse para detectar la presencia de CD11c convencional, CD11b positivo, B220 negativo y células dendríticas plasmocitoides CD11c positivo, CD11b negativo, B220 positivo, un total de cuatro a seis veces 10 a la séptima. Las células de médula ósea se aíslan típicamente de los fémures y tibias de un ratón C57 negro seis de tipo silvestre de seis a ocho semanas de edad, obteniéndose comúnmente cinco veces 10 a la cuarta CLP de un solo ratón C57 negro seis. Tras la clasificación mediante citometría de flujo, como se acaba de demostrar, entre los días tres y cuatro de co-cultivo con células alimentadoras AC6, comienzan a aparecer células formadoras de áreas empedradas, con células dendríticas plasmocitoides de forma redondeada que aparecen suspendidas encima de las células formadoras de áreas empedradas.Al octavo día, el número de dc citoplasmáticos alcanza su punto máximo alrededor de los días 12 a 14, momento en el cual las células comienzan a sufrir apoptosis tras su completo desarrollo y su número empieza a disminuir gradualmente. Las colonias de dc convencionales aparecen más tarde, entre el sexto y octavo día, y son adherentes con una morfología alargada similar a un huso. El análisis por citometría de flujo demuestra que las co-cultivos son 91% CD11c positivos, CD11b negativos, B220 positivos dc plasmacitoides, y 6% CD11c positivos, CD11b positivos, B220 negativos dc convencionales, lo que revela una expansión de cien veces del número de dc plasmacitoides respecto a la población original de CLP mediante este método.Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que la célula a c seis esté en buenas condiciones y de que la densidad de C sea la correcta antes de añadir el clp tras un desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en biología de DC superaran la limitación de utilizar un pequeño número de proyectores para estudiar el desarrollo de DC a partir de diferentes proyectores. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar PC in vitro a partir de CLP utilizando un sistema C seis BEAT.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra el procedimiento para la diferenciación de células dendríticas mieloides de la médula ósea de ratón. El aislamiento de la tibia y el fémur de ratón, y el procesamiento de la médula ósea se demuestran. Imágenes que demuestran la morfología celular, antes y después de la diferenciación, y figuras que representan el fenotipo celular y la IL-12 después de la maduración de la producción con CpG se muestran.

Cultura de células dendríticas mieloides a partir de precursores de médula ósea

La presentación de antígenos en los órganos linfoides secundarios por las células dendríticas es fundamental para el inicio de la célula T mediada por la respuesta inmune adaptativa. Aquí se demuestra la cultura de la médula ósea procedentes de células dendríticas murinas, la activación, y el etiquetado de dos fotones de imágenes.

Generación de médula ósea procedentes de células murinas dendríticas para su uso en dos fotones de imágenes

Este video describe un protocolo para la generación de células dendríticas--células presentadoras de antígenos clave que activan las células T-- a partir de la médula ósea de un ratón adulto.

Generación de células dendríticas derivadas de la médula ósea: un método para generar células dendríticas a partir de médula ósea de ratón

Fuente: Cruz-Adalia, A., et al. Las células T capturan bacterias por transinfección de células dendríticas. J. Vis. Exp. (2016).Este video demuestra la transinfección bacteriana a través de interacciones entre células T específicas de antígeno y células dendríticas. Las células dendríticas infectadas por bacterias que presentan péptido de ovoalbúmina se incuban con células T, ya sea directamente o separadas por una membrana. El contacto directo permite la formación de sinapsis inmunológicas, lo...

Transinfección bacteriana in vitro de células T mediante la formación de sinapsis inmunológicas

Este video muestra un ensayo in vitro para generar células dendríticas plasmocitoides (pDCs) a partir de células progenitoras linfoides comunes (CLPs). Al cocultivar CLPs purificadas con células alimentadoras irradiadas con γ en presencia de ligando (FL) de tirosina quinasa-3 similar a Fms, las CLP se diferencian en pDC no adherentes, cuya presencia se confirma mediante citometría de flujo.

Generación in vitro de células dendríticas plasmocitoides a partir de progenitores linfoides comunes

Este protocolo describe los procedimientos experimentales para evaluar la diferenciación de las células dendríticas plasmacitoides en las placas de Peyer a partir de progenitores comunes de células dendríticas, usando técnicas que implican el aislamiento mediada por FACS de células, la transferencia génica hidrodinámica, y análisis de flujo de subconjuntos inmunes en las placas de Peyer.

Evaluar el desarrollo de las células murino plasmocitoide dendríticas en las placas de Peyer Usando la transferencia adoptiva de Progenitores Hematopoyéticas

Existen distintos subconjuntos de células dendríticas como poblaciones raras en los órganos linfoides y, por lo tanto, son difíciles de aislar en número y pureza suficientes para los experimentos inmunológicos. Aquí describimos un método de alta eficiencia y alto rendimiento para el aislamiento de todos los principales subconjuntos actualmente conocidos de células dendríticas esplénicas de ratón.

Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

Las células dendríticas inmaduras pueden diferenciarse selectivamente en células dendríticas tolerogénicas o maduras para regular el equilibrio entre inmunidad y tolerancia. Este trabajo presenta un medio para generar a partir de células dendríticas inmaduras derivadas de monocitos (moDCs), in vitro tolerogénicas y moDCs maduras que difieren en fenotipos metabólicos.

Generación de inmaduras, maduras y tolerogénico células dendríticas con diferentes fenotipos metabólico

Aquí, presentamos un protocolo para desarrollar y caracterizar células dendríticas tolerogénicas (TolDCs) y evaluar su utilidad de la inmunoterapia.

Desarrollo y caracterización funcional de células dendríticas tolerogénicas murino

Este artículo describe un método novedoso para generar antígenos tumorales inducidos por células madre pluripotentes inducidas por antígenos timáticos (iTE) por un sistema de cultivo timico tridimensional (3D). iTE son un subconjunto homogéneo de células T estrechamente relacionadas con células T ingenuas con la capacidad de proliferación, formación de la memoria y supresión tumoral.

Un sistema de cultivo timático tridimensional para generar emigrantes timémicos específicos de células madre pluripotentes inducidos por la murino

Aquí presentamos un protocolo para el aumento in vivo de la inducción de células T reguladoras intestinales. En este protocolo, las células dendríticas están diseñadas para producir localmente altas concentraciones de la vitamina D activa (1,25-dihidroxivitamina D o 1,25[OH]2D) y la vitamina A activa (ácido retinoico o RA) de novo.

En Vivo Aumento de la Inducción de Células T Regulatorias Gut-Homing

Aprende a generar células dendríticas plasmocitoide in vitro a partir de progenitores linfoide común utilizando el sistema de alimentación AC-6 con Flt3 ligando. Este método eficiente permite producir grandes cantidades de pDCs para investigar su desarrollo y aplicaciones terapéuticas en enfermedades autoinmunes.

En Vitro Generación de células dendríticas murinas plasmocitoide de común linfoide Progenitores utilizando el sistema de alimentación AC-6 (Video) | JoVE Journal

En Vitro Generación de células dendríticas murinas plasmocitoide de común linfoide Progenitores utilizando el sistema de alimentación AC-6

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