En Vitro Generación de células dendríticas murinas plasmocitoide de común linfoide Progenitores utilizando el sistema de alimentación AC-6

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un método eficiente para generar células dendríticas plasmocitoides o PDCs para el estudio de su desarrollo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como ¿cómo se regula el desarrollo de las PDCs? La principal ventaja de esta técnica es que permite el uso de un pequeño número de células progenitoras para generar eficientemente grandes cantidades de PDCs.

Las implicaciones de esta técnica apuntan hacia el tratamiento de enfermedades autoinmunes asociadas a PDC, como el lupus sistémico, la atetosis y la psoriasis. Hoy, demostrará el procedimiento Xang, un excelente estudiante del laboratorio. El día anterior a la recolección de células de médula ósea, siembre 5,9 × 10⁴ células de la línea celular estromal AC6 por pocillo en los pocillos individuales de placas de 12 pocillos e incube las placas a 37 °C y 5 % de dióxido de carbono durante la noche. A la mañana siguiente, irradie con rayos gamma las células AC6 a 3000 rad y sustituya el medio de cultivo por un mililitro de medio completo.

A continuación, coloque el número adecuado de ratones adultos de tipo silvestre C57 black six en una bandeja de disección y esterilice los animales con etanol al 70%. Luego, traslade la bandeja a una campana semiestéril y realice incisiones en la región media del abdomen de cada animal, retirando la piel de las partes distales, incluyendo las extremidades inferiores, para exponer los fémures y tibias. Corte el fémur por encima y las tibias por debajo de las articulaciones de la rodilla, y use tijeras para separar los músculos de los huesos a medida que se van recolectando. Coloque los huesos en una placa de Petri de seis centímetros que contenga cinco mililitros de RPMI completo y transfiera la placa de Petri a una campana de cultivo estéril.

Ahora, llene una jeringa de tres mililitros equipada con una aguja de calibre 27 con RPMI completo y use tijeras para cortar ambos extremos de cada hueso. Introduzca la aguja en cada hueso y lave la médula con una inyección suave de RPMI completo una vez desde cada extremo. Luego, sin la aguja, aspire y dispense suavemente las células de tres a cinco veces en la placa de cultivo para obtener una suspensión de células individuales.

Después de centrifugar las células, lice las células rojas con un mililitro de un tampón CK, deteniendo la reacción con 10 volúmenes de RPMI completo. Después de un minuto, deje que los agregados de células muertas y los restos se sedimenten durante cinco minutos y luego vierta cuidadosamente el sobrenadante en un nuevo tubo. Luego, tras centrifugar nuevamente las células, suspendemos las células totales de médula ósea en 100 microlitros de tampón fax para analizar los precursores linfoides comunes o CLPs mediante citometría de flujo.

A continuación, bloquee las células con anti-CD16/32 durante uno o dos minutos, seguido de la tinción simultánea de las células con el cóctel de anticuerpos adecuado. Después de 15 minutos en hielo, lave las células con tres mililitros de tampón fax y re suspenda el botón en 300 microlitros de tampón fax fresco. Luego, filtre la suspensión celular a través de un filtro de 40 micrómetros y separe inmediatamente las células en un citómetro de flujo utilizando los filtros y voltajes adecuados.

Recolecte las células de interés en un tubo de 15 mililitros que contenga ocho mililitros de RPMI completo. Para generar una población altamente enriquecida de PDCM, es fundamental separar la población adecuada de CLP de las células de médula ósea recolectadas para su cultivo in vitro con un sistema de alimentación Z seis. Al finalizar la clasificación, centrifugue las células y re suspenda el botón celular de CLP con suficiente RPMI completo para obtener una densidad celular de aproximadamente cinco veces 10 a la cuarta células por mililitro.

A continuación, siembre 500 células por pocillo en la placa de 12 pocillos que contiene las células alimentadoras AC seis y suplemente los cultivos en co-cultivo con 100 nanogramos por mililitro de ligando FL tres; luego incube las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono, con un monitoreo visual periódico del desarrollo de las células dendríticas o CD bajo un microscopio. En el día 12, recolecte las células del sobrenadante del co-cultivo y lave cada pocillo una vez con medio RPMI completo de medio mililitro, reuniendo el sobrenadante resultante y los lavados. A continuación, añada medio fresco de medio mililitro a cada pocillo y utilice un raspador celular para desprender las células adherentes.

Combine las células desprendidas con las células en suspensión y centrifugue la suspensión celular resultante. Re_suspenda el sedimento en 50 microlitros de tampón fax. Luego cuente las células y tiñalas para la expresión de CD11c, CD11b y B220 tras el bloqueo de FC.

Como se acaba de demostrar, las células en co-cultivo pueden analizarse para detectar la presencia de CD11c convencional, CD11b positivo, B220 negativo y células dendríticas plasmocitoides CD11c positivo, CD11b negativo, B220 positivo, un total de cuatro a seis veces 10 a la séptima. Las células de médula ósea se aíslan típicamente de los fémures y tibias de un ratón C57 negro seis de tipo silvestre de seis a ocho semanas de edad, obteniéndose comúnmente cinco veces 10 a la cuarta CLP de un solo ratón C57 negro seis. Tras la clasificación mediante citometría de flujo, como se acaba de demostrar, entre los días tres y cuatro de co-cultivo con células alimentadoras AC6, comienzan a aparecer células formadoras de áreas empedradas, con células dendríticas plasmocitoides de forma redondeada que aparecen suspendidas encima de las células formadoras de áreas empedradas.

Al octavo día, el número de dc citoplasmáticos alcanza su punto máximo alrededor de los días 12 a 14, momento en el cual las células comienzan a sufrir apoptosis tras su completo desarrollo y su número empieza a disminuir gradualmente. Las colonias de dc convencionales aparecen más tarde, entre el sexto y octavo día, y son adherentes con una morfología alargada similar a un huso. El análisis por citometría de flujo demuestra que las co-cultivos son 91% CD11c positivos, CD11b negativos, B220 positivos dc plasmacitoides, y 6% CD11c positivos, CD11b positivos, B220 negativos dc convencionales, lo que revela una expansión de cien veces del número de dc plasmacitoides respecto a la población original de CLP mediante este método.

Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que la célula a c seis esté en buenas condiciones y de que la densidad de C sea la correcta antes de añadir el clp tras un desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en biología de DC superaran la limitación de utilizar un pequeño número de proyectores para estudiar el desarrollo de DC a partir de diferentes proyectores. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar PC in vitro a partir de CLP utilizando un sistema C seis BEAT.