Name: VDJ-Sec: Análisis de secuenciación profunda del gen de la cadena pesada de inmunoglobulina reordenados para revelar clonal Evolución Patrones de linfoma de células B (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 7 s
Description: Aprende a analizar la composición clonal de linfomas mediante secuenciación profunda de regiones VDJ de inmunoglobulinas. Este método revela patrones de evolución clonal en recaídas tumorales.

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Los autores desean agradecer a la Dra. Rita Shaknovich y a los miembros de Elemento lab, Melnick lab y Tam lab por sus reflexivas discusiones. También nos gustaría agradecer al Centro Central de Recursos Genómicos de Weill Cornell Medical College por realizar la secuenciación de VDJ. YJ contó con el apoyo de ASH Scholar Award. WT y OE cuentan con el apoyo de la subvención piloto del Weill Cornell Cancer Center. OE cuenta con el apoyo del premio NSF CAREER, el Starr Cancer Consortium y el Hirschl Trust. También nos gustaría agradecer a Katherine Benesch, JD, MPH por su generoso apoyo a este proyecto.

1. VDJ amplificación 1.1) La extracción de ADN a partir de muestras de tumores <ol><li> Extraer el ADN de las secciones delgadas (10 a 20 micras) de OCT tejidos normales o malignas incrustados congelados. <ol><li> Digerir 10-30 secciones delgadas de tejido embebido cortada por un micrótomo criostato en 4 ml de tampón de lisis nucleico (0,0075 M Tris HCl, pH 8,2; NaCl 0,3 M; 0,002 M Na 2 EDTA) con proteinasa K (0,5 mg / ml, concentración final ) y 0,625% SDS en un tubo de centrífuga de 15 ml en un baño de 37 ° C el agua durante la noche. </li><li> Añadir 1 ml de NaCl saturado (5 M) a la mezcla de digestión y agitar vigorosamente durante 15 s. </li><li> Centrifugar a 1100 xg durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml y añadir dos volúmenes de etanol al 100%. </li><li> Mezclar invirtiendo el tubo 6-8 veces. Centrifugar a 5000 xg durante 60 min a 4 ° C para recoger el ADN precipitado. </li><li> Lavar el sedimento de ADN dos veces con etanol 70%. Centrifuge a 5000 xg durante 15 min cada vez para recoger el sedimento. </li><li> Disolver el ADN en tampón TE de 100-400 l a temperatura ambiente en un agitador durante toda la noche. El rendimiento de ADN es de 5 a 200 g (concentración final de 50-500 entre ng / l), dependiendo del tamaño del tejido </li></ol></li><li> Extraer el ADN de las secciones delgadas (10-20 M) de, incorporado (FFPE) tejido normal o maligno en parafina fijado con formalina. <ol><li> Incubar las secciones de parafina en 1 ml de xileno dos veces a temperatura ambiente durante 10 min cada vez en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para de-paraffinize. Recoger las secciones de tejido haciendo girar a 13.000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Incubar las secciones en etanol al 1% dos veces 100 ml a temperatura ambiente, 10 minutos cada vez para eliminar residuos xilenos. Recoger las secciones de tejido haciendo girar a 13.000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. La parafina se disuelve completamente en este punto y sólo la sección de tejido restante. </li><li> Seque las secciones en sala de temperatura durante 10-15 min. </li><li> Hacer una solución 0,5 mg / ml de proteinasa K con tampón de PCR 1X (diluido a partir de 10x tampón de PCR con agua libre de nucleasa). Añadir la solución de proteinasa K a las muestras en un volumen final de de 50-100 l e incubar durante la noche a 37 ° C. </li><li> Calentar las muestras a 95 ° C durante 10 min para inactivar la proteinasa K. Nota: En este paso, se disuelve ADN de la muestra en el tampón de PCR y se puede utilizar en los pasos 1.2 y 1.3 directamente. El rendimiento de ADN es de 0,5 a 20 g (concentración final de 10-200 entre ng / l) en función del tamaño del tejido. </li></ol></li></ol> 1.2) Evaluación de la Calidad de ADN <ol><li> Mezclar 0,25 l de ADN polimerasa Taq con 45 l de mezcla maestra del kit escalera comercial en un tubo de PCR. </li><li> Añadir 5 l de ADN preparado a partir 1.1.1.7 o 1.1.2.5 en el tubo de PCR y mezcle bien pipeteando arriba y abajo durante al menos 5 veces. </li><li> Utilice las siguientes condiciones para amplificar el ADN: 95 ° C durante7 min; seguido por 35 ciclos de 45 segundos a 95 ° C, 45 segundos a 60 ° C y 90 segundos a 72 ° C; luego 72 ° C durante 10 minutos y mantenga a 15 ° C. </li><li> Preparar un gel de agarosa al 2% en TBE (Tris / borato / EDTA). </li><li> Mezclar 20 l de reacción de PCR con 4 l de colorante de carga 6x, y cargar en un gel de agarosa al 2%. </li><li> Tinción del gel de agarosa con 0,5 mg ml de bromuro de etidio solución / y detectar productos de PCR con un sistema de imaginación gel. Nota: las muestras que producen productos de PCR en 5 tamaños de 100, 200, 300, 400, y 600 pb se continuará para generar amplicones VDJ. PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es un mutágeno potente. Por favor, manejar con extrema precaución con el uso de equipo de protección, es decir, guantes, y disponer en contenedores específicos según las pautas de la institución. </li></ol> 1.3) VDJ PCR 1.3.1) Amplify recombinado IgH VDJ Segmento de marco Región 1 (IgVHFR1) <ol><li> Mezclar mezcla maestra 45 l de la etiqueta del tuboed como &quot;Mix 2&quot; de una somática Hipermutación Ensayo IGH para la detección del gel kit comercial, 0,25 l de ADN polimerasa Taq, y el ADN de la muestra 5 l preparado a partir 1.1.1.7 o 1.1.2.5 en un tubo de PCR. </li><li> Utilice las siguientes condiciones para amplificar el ADN: 95 ° C durante 7 minutos; seguido por 35 ciclos de 45 segundos a 95 ° C, 45 segundos a 60 ° C y 90 segundos a 72 ° C; luego 72 ° C durante 10 minutos y mantenga a 15 ° C. </li><li> Resolver la totalidad del producto de la PCR en un gel de agarosa al 2% por electroforesis. </li><li> Tinción del gel de agarosa con 0,5 mg ml de bromuro de etidio solución / y detectar productos de PCR con un sistema de imágenes de gel. Un amplicón monoclonal se espera que con el rango de tamaño de 310 a 380 pb. </li><li> Extirpar la porción de gel que contiene el amplicón monoclonal entre 310 hasta 380 pb. </li><li> Se purifica el ADN a partir de gel escindido utilizando un kit de extracción en gel estándar de acuerdo con el protocolo del fabricante. Nota: para muestras que los fragmentos FR1 pudieron obtenerse, no hay necesidad de ampliamente IgVHFR2 y IgVHFR3. </li></ol> 1.3.2) Amplify recombinado IgH VDJ Segmento de marco Región 2 (IgVHFR2) <ol><li> Mezclar mezcla maestra 45 l del tubo etiquetado como &quot;Tube B&quot; de un Clonalidad Ensayo IGH gen comercial para el kit de detección de Gel, 0,25 l de ADN polimerasa Taq, y el ADN de la muestra 5 l preparado a partir 1.1.1.7 o 1.1.2.5 en un tubo de PCR . </li><li> Utilice las siguientes condiciones para amplificar el ADN: 95 ° C durante 7 minutos; seguido por 35 ciclos de 45 segundos a 95 ° C, 45 segundos a 60 ° C y 90 segundos a 72 ° C; luego 72 ° C durante 10 minutos y dejar a 15 ° C. </li><li> Resolver la totalidad del producto de la PCR en un gel de agarosa al 2% por electroforesis. </li><li> Visualice producto de PCR (s) en 0,5 g / ml de bromuro de etidio tinción. Un amplicón monoclonal se puede observar dentro de la gama de 250 a 295 pb de tamaño. </li><li> Extirpar la porción de gel que contiene el amplicón monoclonal entre 250-295 pb. </li><li> Se purifica el ADN a partir de gel escindido usando un extracto estándar de Gelion Kit según el protocolo del fabricante. </li></ol> 1.4) Optimizar VDJ PCR <ol><li> Utilice las siguientes condiciones de PCR modificados para amplificar IgVHFR1 y IgVHFR2 utilizando ADN subóptima: 95 ° C por 7 min, 40 ciclos de 95 ° C durante 60 segundos, 60ºC durante 60 segundos y 72 ° C durante 90 segundos, extensión final a 72 ° C durante 10 min. </li></ol> 2. VDJ Amplicon Biblioteca Preparación y secuenciación 2.1) Preparación Biblioteca 2.1.1) Fin de reparación <ol><li> Traslado VDJ producto de PCR de 1,3 en un tubo de PCR y añadir tampón de resuspensión de ADN Preparación de muestras Kit para llevar el volumen hasta 60 l. </li><li> Añadir 40 l de reparación Final Mix de Kit de Preparación de ADN de la muestra y mezclar bien. </li><li> Incubar la reacción a 30 ° C durante 30 min en un termociclador precalentado (30 ° C) con una tapa pre-calentado a 100 ° C. </li><li> Mezclar 136 l perlas magnéticas y 24 g l PCRagua Rade primero en un tubo de 1,5 ml, a continuación, transferir toda la reacción End-reparación de 2.1.1.3 en el tubo de 1,5 ml y mezclar bien con la solución de perlas. </li><li> Colocar los tubos en un soporte magnético durante 2 minutos para permitir la separación de las perlas de la solución. Aspirar el sobrenadante y lavar las perlas con 80% fresca preparada EtOH dos veces mientras el tubo está en el soporte magnético. </li><li> Aspirar la solución de etanol por completo y permitir que las perlas se sequen al aire durante 15 min a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Tome el tubo fuera de la base y volver a suspender las perlas magnéticas en 17,5 l tampón de resuspensión. </li><li> Colocar los tubos de nuevo en el soporte magnético durante 2 minutos para cuentas separadas de la resuspensión de búfer. Retire la resuspensión Buffer (producto final de reparación se vuelve a suspender en el tampón de resuspensión ahora) en un tubo de PCR limpio. </li></ol> 2.1.2) A-tizón <ol><li> Añadir 12,5 l mezcla A-tizón en el tubo de PCR que contiene el producto final de reparación y mezclar bien. </li&gt; <li> Incubar el tubo de PCR a 37 ° C durante 30 min en un termociclador precalentado (37 ° C) con una tapa pre-calentado a 100 ° C. </li></ol> 2.1.3) Adaptador Ligadura <ol><li> Añadir 2,5 l tampón de resuspensión, 2,5 l Ligadura Mix, y 2,5 l Índice adaptador de ADN en la reacción A-tizón. </li><li> Incubar la reacción a 30 ° C durante 30 minl en un termociclador precalentado (30 ° C) con una tapa pre-calentado a 100 ° C. </li><li> Añadir 5 l Detener Ligadura de búfer en cada reacción y mezclar bien. </li><li> Mezclar 42,5 perlas magnéticas l bien mezclados para limpiar la reacción siguiendo los pasos 2.1.1.5 a 2.1.1.8. Añadir 50 l tampón de resuspensión para eluir el producto ligado al adaptador. </li><li> Limpiar el producto ligado al adaptador para un segundo tiempo mediante el uso de 50 l bien mezclados perlas AMPure XP, y eluir el producto en 25 l tampón de resuspensión en un tubo de PCR limpio. </li></ol> 2.1.4) Los fragmentos de ADN Amplify <ol><li> Añadir 5 l PCR Primer Cóctel y 25 l PCR Master Mix al tubo de PCR que contiene el producto ligado al adaptador y mezclar bien. </li><li> Realizar la amplificación en un termociclador pre-programado con las siguientes condiciones: 98 ° C durante 30 s; 10 ciclos de 98 ° C durante 10 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72 ° C durante 30 segundos; luego 72 ° C durante 5 minutos y mantenga a 10 ° C. </li><li> Limpiar la reacción mediante el uso de perlas magnéticas 50 l bien mezclados, y eluir el producto final en 30 l tampón de resuspensión. </li></ol> 2.1.5) Biblioteca de Validación <ol><li> Cuantificar el producto final con un fluorómetro utilizando el protocolo del fabricante. Concentración biblioteca final está entre 2.5 a 20 ng / l. </li><li> Evaluar la calidad del producto final mediante el uso de un instrumento analítico con el chip de ADN de alta sensibilidad de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cuente con una sola banda con el tamaño esperado para cualquiera IGVHFR1, IGVHFR2 o IGVHFR3. Texpected tamaño del producto biblioteca es igual al tamaño del amplicón VDJ original más el tamaño de los adaptadores (~ 125 pb). </li></ol> 2.2) VDJ-PCR Biblioteca Pooling y secuenciación <ol><li> Calcular la molaridad de cada fracción biblioteca utilizando la siguiente fórmula: nM = [(ng / 1.000) / BP * 660] x 10 9 donde ng es la concentración de la biblioteca VDJ-PCR medida en la etapa 2.1.5.1 y BP es el pico tamaño de la biblioteca VDJ-PCR medida en la etapa 2.1.5.2. </li><li> Diluir la biblioteca para 2 nM (10 l en total) con agua libre de DNasa. </li><li> Combinar los 10 l de las bibliotecas diluidas 2 nM juntos en un tubo de 1,5 ml. </li><li> Añadir un volumen igual de control de espiga-en PhiX en el tubo de 1,5 ml. </li><li> Cargue la piscina en la concentración de 19:00 en una celda de flujo. </li><li> Secuenciar las bibliotecas utilizando un secuenciador de ciclo de gama emparejado 150 según el protocolo del fabricante. </li></ol> Análisis 3. Datos Nota: Un summario de los guiones bioinformáticos utilizados en esta sección se puede encontrar como un Código Archivo suplementario. 3.1) Alineación y control de calidad <ol><li> Mapa secuenciación de extremo emparejado lee contra un IGH humana V, D y J de base de datos región descargado desde el sitio web de IMGT 11 utilizando un algoritmo explosión de nucleótidos adaptada basada en &#39;blastn&#39; disponible de NCBI con brecha pena de abierto de 2, penalización de extensión de 1, longitud de palabra de 7, y el umbral de e-valor de 10 -4. Deseche el par leer no asignar a la vez un IGH V y una región J. </li><li> Cuente los restantes pares de leer que tienen IGH V y J asignaciones para obtener las frecuencias de juego combinaciones VJ en todos leen pares obtenidos de la ejecución de secuenciación en la muestra. Cuente un par de lectura si se asigna a la vez un IGH V y J gen, y luego añadir su alelo a la cuenta correspondiente a la combinación VJ particular. </li><li> Clasifique los recuentos para cada región VDJ recombinado obtenido a partir de 3.1.2 de la altaest al más bajo. La región VDJ tiene el más alto recuento de lecturas se define como importante combinación reordenamiento. </li><li> Deseche secuencias alineadas que cubren menos del 35% de la importante reorganización de dominio identificado en 3.1.3. </li></ol> 3.2) SHM Perfil de Identificación <ol><li> Cuente todos los patrones SHM través de las lecturas de la etapa 3.1.3. Definir cada patrón SHM como un subclon. </li><li> Cuente el número de los subclones que se corresponden a diferentes patrones únicos SHM, y el número de lecturas que se asigna a subclones individuales. </li></ol> 3.3) La representación gráfica de los resultados <ol><li> Lleve a cabo el análisis filogenético de los subclones utilizando sus correspondientes patrones SHM utilizando un barrio método de unión del paquete R &quot;mono&quot;, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Calcula una matriz de distancia de las alineaciones distintas individuales para recrear la filogenia subclone arraigada a la secuencia de la línea germinal del VJ combinación en cuestión para cada conjunto de muestras pareadas. </li><li> Utilice la secuencia de nucleótidos de cada subclon como vector de caracteres y calcular la distancia cadena aproximada entre todos los subclones en los principales reordenamiento VJ tanto para el diagnóstico y las muestras de recaída correspondientes utilizando una medida de distancia Levenshtein donde matemáticamente la distancia entre dos alineaciones está dada por d x, y (i, j), donde d x, y (i, j) = 1 si i ≠ j y 0 de otro modo, y luego esta función resumen sobre la longitud de la cadena correspondiente a secuencias de nucleótidos i y j. </li><li> Gráficamente mostrar la matriz resultante de las distancias subclone y su población en subclone correspondientes en las siguientes dos maneras: <ol><li> Utilice el paquete R &quot;MASA&quot;, de acuerdo con el protocolo del fabricante para aplicar escalamiento multidimensional a la matriz de distancia subclone y generar un principio de dos dimensiones coordenadas mapa, que luego se traza junto con el logaritmode los recuentos de subclonales como el radio del círculo. </li><li> Construir un grafo no dirigido basado en la distancia Levenshtein, donde los vértices corresponden a cada subclon distinta que surge de la gran reordenamiento VJ. Nota: Si la distancia entre dos clones distintos es igual a uno entonces existe un borde entre estos dos vértices. Si la distancia es mayor que uno, entonces no hay ningún borde de conexión ellos. </li><li> Trazar la gráfica de 3.3.3.2 utilizando la función tkplot en el paquete R &quot;IGRAPH&quot; con la disposición Kamada Kawai según el protocolo del fabricante. El radio de los vértices es proporcional a la raíz al cubo del número total de clones mapeadas a la misma y el sombreado utiliza una gama de color rojo y azul para indicar la proporción de clones que o bien pertenecen al diagnóstico (azul) o recaída (rojo) muestras . </li></ol></li></ol> 3.4) La heterogeneidad (entropía) Medición <ol><li> Examine los números y cuenta subclone delpatrones individuales de hipermutación somática que ocurren en el reordenamiento VJ importante para cada una adscrita conjunto de muestras. </li><li> Calcular la entropía y la entropía empírica empírica residual ajustado por el número de clones distintos en cada muestra utilizando la estimación entropía basado en histograma estándar. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Debido al número casi ilimitado de iteraciones de información de la secuencia codificada por VDJ reordenamiento y SHM en el locus IGH de células B humanas, el examen de todo el repertorio IGH por alto rendimiento en alta secuenciación demostró ser una forma eficaz y completa para delinear clonal y las poblaciones de células B sub-clónicas. Además, esta estrategia se puede utilizar para estudiar la ruta de evolución clonal de desarrollo de células B tumor, remisión y recaída mediante la comparación de las arquitecturas c...

El cáncer es una enfermedad clonal. Desde hace treinta años, cuando Peter C. Nowell propuso el modelo de evolución clonal del cáncer 1, muchos estudios han tratado de diseccionar poblaciones clonales dentro de las muestras tumorales y reconstruir los patrones de expansión y evolución clonal que subyacen en el proceso de tumorigénesis 2. Recientemente, la secuenciación del genoma ha permitido a los investigadores a tener una mirada profunda a la heterogeneidad clonal y evolución 3,4. Sin embargo, debido a la falta de marcadores tratables en muchos tipos de células, es difícil para inferir la arquitectura clonal precisa y la ruta evolutiva. Afortunadamente hay un marcador clonalidad natural en células B maduras de las que muchas neoplasias linfoides, incluyendo DLBCL, originan. En respuesta a la estimulación antigénica, cada una de las células B puede formar una sola productiva secuencia IgH VDJ uniéndose a un V H (variable), un D (diversidad) y J H (unión) segmento juntos desde un gran número de estos segmentos. Durante este proceso, pequeñas porciones de la secuencia original pueden ser borrados y los nucleótidos no moldeados adicionales pueden añadirse para crear un reordenamiento VDJ único. Este reordenamiento VDJ específico puede ser heredado en toda la progenie de esta célula B, por lo tanto, el etiquetado de las células B individuo maduro y su descendencia 5. Además, SHM se produce en las secuencias VDJ recombinados en la reacción subsiguiente del centro germinal (GC) para introducir mutaciones adicionales para la expansión de la piscina de anticuerpos y la mejora de la afinidad de anticuerpos 6. Por lo tanto, comparando y contrastando los patrones de muestras de linfoma que se han sometido a estos procesos VDJ y SHM, la heterogeneidad intra-tumor podría ser delineado y ruta de evolución clonal de la enfermedad puede ser deducida. Anteriormente, VDJ reordenamiento y SHM podrían ser identificados por PCR amplificando las regiones recombinados, la clonación de los productos de PCR, y posteriormente secuenciación de Sanger para obtener información de la secuencia. Este enfoque is de bajo rendimiento y bajo rendimiento, la recuperación de sólo una muy pequeña parte de todo el repertorio VDJ recombinado, y dificultando la caracterización de la representación general de la población clonal dentro de una muestra dada. Un enfoque modificado fue creado mediante la generación de bibliotecas de secuenciación NGS indexadas a partir de productos de PCR VDJ y la realización de PE secuenciación pb 2x150 para obtener más de medio millón de secuencias VDJ recombinados por muestra. Además, una canalización personalizada fue desarrollado para llevar a cabo control de calidad (QC), alinear, secuenciación VDJ filtro lee para identificar reordenamientos y SHMS de cada lectura, y llevar a cabo el análisis filogenético en la arquitectura clonal de cada muestra. Además, un nuevo enfoque ha sido establecido para caracterizar adicionalmente los patrones de evolución clonal para las muestras recogidas en diferentes etapas de la enfermedad. Hemos aplicado esta técnica para las muestras de pacientes con DLBCL. DLBCL es una forma agresiva de linfoma no Hodgkin con recaídas frecuentes en hasta un ªIRD de los pacientes 7. Recaídas DLBCL normalmente ocurren temprano, en un plazo de 2 a 3 años del diagnóstico inicial, aunque algunos no se dan después de 5 años 8. El pronóstico para los pacientes con recidiva es pobre, con sólo el 10% el logro de 3 años la supervivencia libre de progresión, debido a las opciones de tratamiento limitadas. Esta es la base de la urgente necesidad de nuevos enfoques para el tratamiento de la recaída DLBCL 9,10. Sin embargo, los mecanismos moleculares asociados con DLBCL recaídas siguen siendo en gran parte desconocido. En particular, el papel de la heterogeneidad clonal el momento del diagnóstico y la evolución clonal durante el desarrollo de recaídas DLBCL son actualmente no caracterizado, por lo que es difícil definir un biomarcador precisa y útil para predecir la recaída. Para abordar estas cuestiones, hemos aplicado nuestro enfoque VDJ-secuenciación de múltiples pares de diagnóstico de recaída primaria pares de muestras DLBCL emparejados. Dos escenarios de evolución clonales distintas de recaída surgieron de la comparación de las arquitecturas clonales entre el diagnóstico y samp recaídales sugiere que múltiples mecanismos moleculares puede estar implicada en DLBCL recaída.

<table><tbody><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>89125-170</td><td>200 proof, para biología molecular</td></tr><tr><td>tampón TE</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td>10 mM Tris&middot; Cl, pH 8,0; 10 mM EDTA</td></tr><tr><td>Xilenos</td><td>VWR</td><td>EM-XX0055-6</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Proteinasa K&nbsp;</td><td>Life Technonogies</td><td>25530-015</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Trifosfato de desoxinucleótido (dNTP) Mezcla de soluciones</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td>10 mM cada nucleótido</td></tr><tr><td>10x Tampón de PCR&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11699105001</td><td>sin MgCl2</td></tr><tr><td>AmpliTaq ADN polimerasa con tampón de oro y MgCl2</td><td>Life Technonogies</td><td>4311806</td><td>50 &micro; l a 5 U/&micro; l</td></tr><tr><td>Escalera de tamaño de control de muestras</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp;</td><td>2-096-0020</td><td>33 reacciones</td></tr><tr><td>IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Detección de gel</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp;</td><td>5-101-0030</td><td>33 reacciones, Mix 2 para la detección de IGVHFR1</td></tr><tr><td>Ensayo de clonalidad del gen IGH - Detección en gel</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp;</td><td>1-101-0020</td><td>33 reacciones, Tubo B para detección de IGVHFR2</td></tr><tr><td>GoTaq Flexi ADN Polimerasa</td><td>Promega</td><td>M8291</td><td>20 &micro; l a 5 U/&micro; l</td></tr><tr><td>10X Tampón Tris-Borato-EDTA (TBE)</td><td>Corning (cellgro)</td><td>46-011-CM</td><td>6x1 L</td></tr><tr><td>50x TAMPÓN TAE&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td>101414-298</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Solución de bromuro de etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>25 pb DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10597011</td><td>1 &micro; g/&micro; l</td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>15628-019</td><td>1 &micro; g/&micro; l</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>40% Solución de Acrilamida/Bis</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610144</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>50 columnas</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Kit de ensayo de alta sensibilidad</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ADN de alta sensibilidad</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalizador</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorímetro</td><td>Life Technologies</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de resuspensión (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de reparación final (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de ligadura (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Índice adaptador de ADN (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)Illumina</td><td></td> <td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>PCR cebador cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Soporte magnético</td><td>Life Technologies</td><td>4457858</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagen en gel</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>170-8370</td><td></td></tr></tbody></table>

vdj-sec: análisis de secuenciación profunda del gen de la cadena pesada de inmunoglobulina reordenados para revelar clonal evolución patrones de linfoma de células b

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

Clonalidad tumor comprensión es fundamental para la comprensión de los mecanismos implicados en la tumorigénesis y la progresión de la enfermedad. Además, la comprensión de los cambios en la composición clonal que se producen dentro de un tumor en respuesta a ciertos micro-entorno o tratamientos puede conducir al diseño de los enfoques más sofisticados y eficaces para erradicar las células tumorales. Sin embargo, el seguimiento de tumores clonales subpoblaciones ha sido difícil debido a la falta de marcadores distinguibles. Para abordar este problema, un protocolo VDJ-ss fue creado para rastrear los patrones de evolución clonal de linfoma de células grandes B (DLBCL) recaída difusa mediante la explotación de recombinación VDJ e hipermutación somática (SHM), dos características únicas de los linfomas de células B. En este protocolo, la secuenciación de próxima generación (NGS) bibliotecas con potencial de indexación se construyeron a partir de la cadena pesada de inmunoglobulina amplificado reordenado (CIB) región VDJ de pares de diagnóstico primario y la recaída samp DLBCLles. En promedio se obtuvieron más de medio millón de secuencias VDJ por muestra después de la secuenciación, que contienen tanto VDJ reordenamiento e información SHM. Además, se desarrollaron tuberías bioinformática personalizadas para utilizar plenamente la información de secuencia para la caracterización de CIB-VDJ repertorio dentro de estas muestras. Además, la tubería permite la reconstrucción y la comparación de la arquitectura clonal de los tumores individuales, lo que permite el examen de la heterogeneidad clonal dentro de los tumores de diagnóstico y deducción de los patrones de evolución clonal entre diagnóstico y pares de recaída del tumor. Al aplicar este análisis a varios pares diagnóstico de recaída, descubrimos evidencia clave de que múltiples patrones evolutivos tumorales distintivo podrían llevar a DLBCL recaída. Además, este enfoque se puede ampliar a otros aspectos clínicos, como la identificación de la enfermedad residual mínima, seguimiento de los avances recaída y la respuesta al tratamiento y la investigación de repertorio inmunológicoes en contextos no-Hodgkin.

El procedimiento general de secuenciación VDJ (VDJ-SEC), incluyendo la extracción de ADN, recombina VDJ región de amplificación y purificación, la construcción de bibliotecas de secuenciación, se lee en el procesamiento y el análisis filogenético, está representado en la Figura 1. Rutinariamente de 5-200 g de ADN puede ser recuperada a partir de secciones de tejido sólido congelado o 0,5 a 20 g de ADN a partir de secciones de tejidos embebidos en parafina fijado en formol. Dependiendo d...

Este protocolo describe un enfoque para interrogar las regiones VDJ de cadena pesada de inmunoglobulinas recombinadas de los linfomas mediante secuenciación profunda y recuperar el reordenamiento de VDJ y el estado de hipermutación somática para delinear la arquitectura clonal del tumor individual. La comparación de la arquitectura clonal entre el diagnóstico pareado y las muestras de recaída revela modos de evolución clonal de recaída y linfoma.

VDJ-Sec: Análisis de secuenciación profunda del gen de la cadena pesada de inmunoglobulina reordenados para revelar clonal Evolución Patrones de linfoma de células B

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar la composición clonal de muestras de linfoma para la identificación de patrones de evolución clonal en la recaída del linfoma. Este método puede ayudar a abordar preguntas clave en el campo del linfoma, como la forma en que los tumores recidivados se originan a partir de los tumores originales. La principal ventaja de este protocolo es que adapta la tecnología más reciente de secuenciación de alto rendimiento para permitir una cartografía más completa de las similitudes en el linfoma.En este protocolo, se extraerá ADN de secciones delgadas de tejidos normales o malignos embebidos en OCT congelado, así como en parafina fijada con formalina. Primero, digiera de 10 a 30 secciones delgadas en cuatro mililitros de tampón de lisis de ácidos nucleicos con proteinasa K y SDS al 0,625 % en un baño de agua a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, añada un mililitro de cloruro de sodio saturado de cinco moles a la mezcla de digestión y agite vigorosamente durante 15 segundos; luego centrifugue a 1.100 ×g durante 15 minutos.A temperatura ambiente, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Añada dos volúmenes de etanol al 100% y mezcle invirtiendo el tubo de seis a ocho veces. Centrifugue a 5.000 ×g durante 60 minutos a cuatro grados Celsius. Para recoger el ADN precipitado, lave el pellet de ADN dos veces con etanol al 70%, centrifugando a 5.000 ×g durante 15 minutos cada vez.Para recoger el pellet, disuelva el pellet de ADN en 100 a 400 microlitros de tampón TE a temperatura ambiente en un agitador durante la noche para extraer el ADN de secciones delgadas de tejido incluido en parafina fijado con formol. Primero desparafine incubando las secciones de parafina en un mililitro de xileno dos veces a temperatura ambiente durante 10 minutos cada vez. Recoja las secciones de tejido centrifugando a 13.000 ×g durante cinco minutos a temperatura ambiente.A continuación, elimine los restos de etileno incubando las secciones en un mililitro de etanol al 100 % dos veces a temperatura ambiente durante 10 minutos cada vez. Recupere las secciones de tejido mediante centrifugación a 13.000 ×g durante cinco minutos. A temperatura ambiente, seque al aire las secciones durante 10 a 15 minutos.Añada una solución de proteasa K recién preparada a las muestras en un volumen final de 50 a 100 microlitros e incube durante la noche a 37 grados Celsius al día siguiente. Caliente las muestras a 95 grados Celsius durante 10 minutos para inactivar la proteinasa K. El rendimiento de ADN de las extracciones mostradas en el segmento anterior es de cinco a 200 microgramos, dependiendo del tamaño del tejido.El siguiente paso es evaluar la calidad de cada muestra de ADN en una mezcla de tubos de PCR. Añada 25 microlitros de polimerasa TDNA junto con 45 microlitros de mezcla maestra proveniente de un kit comercial de marcadores. Agregue cinco microlitros de ADN al tubo de PCR y mezcle bien pipeteando arriba y abajo al menos cinco veces.Amplifique el ADN siguiendo las condiciones detalladas en el texto del protocolo. A continuación, mezcle 20 microlitros de la reacción de PCR con cuatro microlitros de colorante marcador 6x y cargue en un gel de agarosa al 2%. Cuando la electroforesis esté completa, tiña el gel de agarosa con bromuro de etidio y detecte los productos de PCR.Con un sistema de imagen de geles, las muestras que produzcan cinco productos de PCR de tamaños 100, 200, 300, 400 y 600 pares de bases se utilizarán únicamente para generar amplicones VDJ. En este video se demostrará la amplificación del segmento I-G-H-V-D-J recombinado a partir de la región marco uno o IGV HFR uno. La amplificación del segmento I-G-H-B-D-J recombinado a partir de la región marco dos sigue un procedimiento similar y se describe en el texto del protocolo en una mezcla para tubo de PCR.45 microlitros de la mezcla maestra de la probeta etiquetada como mezcla dos de un kit comercial para la detección de mutación somática en IGH por electroforesis en gel, 25 microlitros de la polimerasa TAC y cinco microlitros de ADN de la muestra; amplificar el ADN siguiendo las condiciones descritas en el texto del protocolo. Para amplificar en condiciones subóptimas de PCR de ADN, se pueden ajustar las condiciones alargando el tiempo de extensión o incrementando el número de ciclos de amplificación. Resolver todos los productos de PCR mediante electroforesis en un gel de AGAROSA al 2%. Teñir el gel de AGAROSA con una solución de bromuro de etidio a 0,5 microgramos por mililitro y detectar los productos de PCR.Con un sistema de imagen de geles, se espera un amplicón monoclonal con un tamaño entre 310 y 380 pares de bases. Recorte la porción del gel que contiene el amplicón monoclonal. Posteriormente, purifique el ADN del fragmento recortado del gel utilizando un kit estándar de extracción de geles según el protocolo del fabricante.Para comenzar este procedimiento, transfiera el producto V-D-J-P-C-R purificado a un tubo de PCR y agregue el tampón de suspensión Resus del kit de preparación de muestras de ADN para llevar el volumen hasta 60 microlitros. Añada 40 microlitros de la mezcla de reparación de extremos del kit de preparación de muestras de ADN, mezcle bien e incube la reacción a 30 grados Celsius durante 30 minutos en un termociclador precalentado con la tapa precalentada a 100 grados Celsius. A continuación, mezcle 136 microlitros de perlas magnéticas y 24 microlitros de agua grado PCR en un tubo de 1,5 mililitros y transfiera toda la reacción de reparación de extremos al tubo, mezclando bien con la solución de perlas.Coloque los tubos en un soporte magnético durante dos minutos para permitir la separación de las perlas de la solución. Aspire el sobrenadante y lave las perlas dos veces con etanol al 80% recién preparado. Aspire completamente la solución de etanol y deje secar las perlas al aire durante 15 minutos a temperatura ambiente.Después de 15 minutos, retire los tubos del soporte magnético y resuspenda las perlas en 17,5 µL de tampón de resuspensión. Vuelva a colocar los tubos en el soporte magnético durante dos minutos para separar las perlas del tampón de resuspensión. Transfiera el tampón de resuspensión, que ahora contiene el producto de reparación de extremos, a un tubo limpio de PCR.El siguiente paso consiste en añadir una cola a al producto de reparación de extremos. Añada 12,5 microlitros de la mezcla de adición de cola a al tubo de PCR que contiene el producto de reparación de extremos y mezcle bien. Incube los tubos de PCR a 37 grados Celsius durante 30 minutos en un termociclador precalentado con la tapa precalentada a 100 grados Celsius.Para la ligadura del adaptador, agregue 2,5 microlitros de tampón de suspensión Resus, 2,5 microlitros de mezcla de ligación y 2,5 microlitros de índice del adaptador de ADN a la reacción de adición de cola A. Incube la reacción a 30 grados Celsius durante 30 minutos en un termociclador precalentado con tapa precalentada a 100 grados Celsius. Después de 30 minutos, añada cinco microlitros de tampón de detención de la ligadura a cada reacción y mezcle bien.Añada 42,5 µL de perlas magnéticas bien mezcladas a cada reacción y lávelas con etanol al 80% como se mostró anteriormente. Añada 50 µL de tampón de resuspensión Resus para eluir el producto con adaptador ligado. Limpie el producto con adaptador ligado por segunda vez utilizando 50 µL de perlas Ampu XP bien mezcladas y eluya el producto en 25 µL de tampón de resuspensión Resus en un tubo de PCR limpio.Para amplificar el amplicón VDJ, agregue cinco microlitros de la mezcla de cebadores de PCR y 25 microlitros de la mezcla maestra de PCR al tubo de PCR que contiene el producto con el adaptador ligado y mezcle completamente; realice la amplificación en un termociclador con las condiciones descritas en el texto del protocolo. Cuando la amplificación haya finalizado, purifique la reacción utilizando 50 microlitros de perlas magnéticas bien mezcladas y eluya el producto final en 30 microlitros de tampón Resus. Posteriormente, la biblioteca del amplicón VTJ se valida, agrupa y secuencia según se describe en el texto del protocolo.Dado que la complejidad de la biblioteca de secuenciación VVG es baja, recomendamos agregar un 20 a 50 % de FI de espaciado en muestras de secuenciación aprobadas para permitir una llamada precisa de las bases. Estas imágenes representativas de geles muestran los productos de amplicón V-D-J-P-C-R obtenidos a partir de ADN extraído de muestras de pacientes con linfoma. La calidad del amplicón V-D-J-P-C-R antes y después de la construcción de la biblioteca se evaluó mediante un bioanalizador.El cambio de tamaño de 334 pares de bases a 459 pares de bases indica la adición del adaptador para rastrear la evolución clonal de un caso de recaída de linfoma difuso de grandes células B. Se realizó el análisis filogenético de los perfiles de mutación somática por hipermutación (SHM) de las principales reordenaciones VDJ de la cadena pesada entre las muestras de diagnóstico y de recaída.Se observó el modo de evolución clonal divergente tardía. Se desarrollaron nuevos métodos gráficos para visualizar la evolución clonal. Los patrones mostrados son gráficos de escalamiento multidimensional de un modelo de recaída divergente tardía y uno divergente temprana.El radio de cada círculo indica el número de subclones correspondientes a un perfil particular de mutación somática hipercomplementaria (SHM). El color azul corresponde a la muestra de diagnóstico y el rojo a la muestra de recaída. Asimismo, los gráficos no dirigidos muestran que la distribución de los conteos de subclones en el caso de divergencia tardía difiere del caso de divergencia temprana.Los bordes corresponden a dos perfiles de MSH que presentan una distancia de cadena de una separación de letra, y la barra de escala de color indica la proporción de secuencias que se asignan a un perfil particular de MSH, correspondiente a la muestra de diagnóstico roja o a la muestra de recaída amarilla. Al realizar este procedimiento, es importante evitar contaminaciones cruzadas entre las muestras. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la calidad de muestras tumorales de linfoma.Este enfoque también puede utilizarse para rastrear la enfermedad residual mínima y explorar la respuesta de vigilancia inmunitaria frente a los cánceres. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Aquí se describe un protocolo para la detección simultánea de las modificaciones de histonas por secuencias de ADN de inmunofluorescencia y por FISH de ADN seguido por microscopía 3D y análisis (3D inmuno-ADN FISH).

Inmunofluorescencia y FISH Combinado de ADN en 3D conservados núcleos en interfase para estudiar los cambios en la organización nuclear 3D

La síntesis de anticuerpos monoclonales humanos es el primer paso en estudios destinados a desentrañar los mecanismos fisiopatológicos de las respuestas inmunitarias mediadas por autoanticuerpos. Hemos desarrollado un protocolo para generar anticuerpos monoclonales de inmunoglobulina G (IgG) humana recombinante a partir de células B clasificadas por sangre, incluido el aislamiento de células B, la clonación de anticuerpos y la síntesis in vitro.

Generación de recombinante humano IgG anticuerpos monoclonales a partir de células inmortalizadas B Ordenada

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Aquí, describimos protocolos para el análisis y visualización de la estructura y Constitución de los repertorios de anticuerpos todo. Se trata de la adquisición de grandes secuencias de RNA anticuerpos mediante secuenciación de próxima generación.

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Establecimiento y propagación de los tumores del retinoblastoma humanos en ratones con deficiencia inmune

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VDJ-Sec: Análisis de secuenciación profunda del gen de la cadena pesada de inmunoglobulina reordenados para revelar clonal Evolución Patrones de linfoma de células B (Video) | JoVE Journal

VDJ-Sec: Análisis de secuenciación profunda del gen de la cadena pesada de inmunoglobulina reordenados para revelar clonal Evolución Patrones de linfoma de células B

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