VDJ-Sec: Análisis de secuenciación profunda del gen de la cadena pesada de inmunoglobulina reordenados para revelar clonal Evolución Patrones de linfoma de células B

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar la composición clonal de muestras de linfoma para la identificación de patrones de evolución clonal en la recaída del linfoma. Este método puede ayudar a abordar preguntas clave en el campo del linfoma, como la forma en que los tumores recidivados se originan a partir de los tumores originales. La principal ventaja de este protocolo es que adapta la tecnología más reciente de secuenciación de alto rendimiento para permitir una cartografía más completa de las similitudes en el linfoma.

En este protocolo, se extraerá ADN de secciones delgadas de tejidos normales o malignos embebidos en OCT congelado, así como en parafina fijada con formalina. Primero, digiera de 10 a 30 secciones delgadas en cuatro mililitros de tampón de lisis de ácidos nucleicos con proteinasa K y SDS al 0,625 % en un baño de agua a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, añada un mililitro de cloruro de sodio saturado de cinco moles a la mezcla de digestión y agite vigorosamente durante 15 segundos; luego centrifugue a 1.100 ×g durante 15 minutos.

A temperatura ambiente, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Añada dos volúmenes de etanol al 100% y mezcle invirtiendo el tubo de seis a ocho veces. Centrifugue a 5.000 ×g durante 60 minutos a cuatro grados Celsius. Para recoger el ADN precipitado, lave el pellet de ADN dos veces con etanol al 70%, centrifugando a 5.000 ×g durante 15 minutos cada vez.

Para recoger el pellet, disuelva el pellet de ADN en 100 a 400 microlitros de tampón TE a temperatura ambiente en un agitador durante la noche para extraer el ADN de secciones delgadas de tejido incluido en parafina fijado con formol. Primero desparafine incubando las secciones de parafina en un mililitro de xileno dos veces a temperatura ambiente durante 10 minutos cada vez. Recoja las secciones de tejido centrifugando a 13.000 ×g durante cinco minutos a temperatura ambiente.

A continuación, elimine los restos de etileno incubando las secciones en un mililitro de etanol al 100 % dos veces a temperatura ambiente durante 10 minutos cada vez. Recupere las secciones de tejido mediante centrifugación a 13.000 ×g durante cinco minutos. A temperatura ambiente, seque al aire las secciones durante 10 a 15 minutos.

Añada una solución de proteasa K recién preparada a las muestras en un volumen final de 50 a 100 microlitros e incube durante la noche a 37 grados Celsius al día siguiente. Caliente las muestras a 95 grados Celsius durante 10 minutos para inactivar la proteinasa K. El rendimiento de ADN de las extracciones mostradas en el segmento anterior es de cinco a 200 microgramos, dependiendo del tamaño del tejido.

El siguiente paso es evaluar la calidad de cada muestra de ADN en una mezcla de tubos de PCR. Añada 25 microlitros de polimerasa TDNA junto con 45 microlitros de mezcla maestra proveniente de un kit comercial de marcadores. Agregue cinco microlitros de ADN al tubo de PCR y mezcle bien pipeteando arriba y abajo al menos cinco veces.

Amplifique el ADN siguiendo las condiciones detalladas en el texto del protocolo. A continuación, mezcle 20 microlitros de la reacción de PCR con cuatro microlitros de colorante marcador 6x y cargue en un gel de agarosa al 2%. Cuando la electroforesis esté completa, tiña el gel de agarosa con bromuro de etidio y detecte los productos de PCR.

Con un sistema de imagen de geles, las muestras que produzcan cinco productos de PCR de tamaños 100, 200, 300, 400 y 600 pares de bases se utilizarán únicamente para generar amplicones VDJ. En este video se demostrará la amplificación del segmento I-G-H-V-D-J recombinado a partir de la región marco uno o IGV HFR uno. La amplificación del segmento I-G-H-B-D-J recombinado a partir de la región marco dos sigue un procedimiento similar y se describe en el texto del protocolo en una mezcla para tubo de PCR.

45 microlitros de la mezcla maestra de la probeta etiquetada como mezcla dos de un kit comercial para la detección de mutación somática en IGH por electroforesis en gel, 25 microlitros de la polimerasa TAC y cinco microlitros de ADN de la muestra; amplificar el ADN siguiendo las condiciones descritas en el texto del protocolo. Para amplificar en condiciones subóptimas de PCR de ADN, se pueden ajustar las condiciones alargando el tiempo de extensión o incrementando el número de ciclos de amplificación. Resolver todos los productos de PCR mediante electroforesis en un gel de AGAROSA al 2%. Teñir el gel de AGAROSA con una solución de bromuro de etidio a 0,5 microgramos por mililitro y detectar los productos de PCR.

Con un sistema de imagen de geles, se espera un amplicón monoclonal con un tamaño entre 310 y 380 pares de bases. Recorte la porción del gel que contiene el amplicón monoclonal. Posteriormente, purifique el ADN del fragmento recortado del gel utilizando un kit estándar de extracción de geles según el protocolo del fabricante.

Para comenzar este procedimiento, transfiera el producto V-D-J-P-C-R purificado a un tubo de PCR y agregue el tampón de suspensión Resus del kit de preparación de muestras de ADN para llevar el volumen hasta 60 microlitros. Añada 40 microlitros de la mezcla de reparación de extremos del kit de preparación de muestras de ADN, mezcle bien e incube la reacción a 30 grados Celsius durante 30 minutos en un termociclador precalentado con la tapa precalentada a 100 grados Celsius. A continuación, mezcle 136 microlitros de perlas magnéticas y 24 microlitros de agua grado PCR en un tubo de 1,5 mililitros y transfiera toda la reacción de reparación de extremos al tubo, mezclando bien con la solución de perlas.

Coloque los tubos en un soporte magnético durante dos minutos para permitir la separación de las perlas de la solución. Aspire el sobrenadante y lave las perlas dos veces con etanol al 80% recién preparado. Aspire completamente la solución de etanol y deje secar las perlas al aire durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Después de 15 minutos, retire los tubos del soporte magnético y resuspenda las perlas en 17,5 µL de tampón de resuspensión. Vuelva a colocar los tubos en el soporte magnético durante dos minutos para separar las perlas del tampón de resuspensión. Transfiera el tampón de resuspensión, que ahora contiene el producto de reparación de extremos, a un tubo limpio de PCR.

El siguiente paso consiste en añadir una cola a al producto de reparación de extremos. Añada 12,5 microlitros de la mezcla de adición de cola a al tubo de PCR que contiene el producto de reparación de extremos y mezcle bien. Incube los tubos de PCR a 37 grados Celsius durante 30 minutos en un termociclador precalentado con la tapa precalentada a 100 grados Celsius.

Para la ligadura del adaptador, agregue 2,5 microlitros de tampón de suspensión Resus, 2,5 microlitros de mezcla de ligación y 2,5 microlitros de índice del adaptador de ADN a la reacción de adición de cola A. Incube la reacción a 30 grados Celsius durante 30 minutos en un termociclador precalentado con tapa precalentada a 100 grados Celsius. Después de 30 minutos, añada cinco microlitros de tampón de detención de la ligadura a cada reacción y mezcle bien.

Añada 42,5 µL de perlas magnéticas bien mezcladas a cada reacción y lávelas con etanol al 80% como se mostró anteriormente. Añada 50 µL de tampón de resuspensión Resus para eluir el producto con adaptador ligado. Limpie el producto con adaptador ligado por segunda vez utilizando 50 µL de perlas Ampu XP bien mezcladas y eluya el producto en 25 µL de tampón de resuspensión Resus en un tubo de PCR limpio.

Para amplificar el amplicón VDJ, agregue cinco microlitros de la mezcla de cebadores de PCR y 25 microlitros de la mezcla maestra de PCR al tubo de PCR que contiene el producto con el adaptador ligado y mezcle completamente; realice la amplificación en un termociclador con las condiciones descritas en el texto del protocolo. Cuando la amplificación haya finalizado, purifique la reacción utilizando 50 microlitros de perlas magnéticas bien mezcladas y eluya el producto final en 30 microlitros de tampón Resus. Posteriormente, la biblioteca del amplicón VTJ se valida, agrupa y secuencia según se describe en el texto del protocolo.

Dado que la complejidad de la biblioteca de secuenciación VVG es baja, recomendamos agregar un 20 a 50 % de FI de espaciado en muestras de secuenciación aprobadas para permitir una llamada precisa de las bases. Estas imágenes representativas de geles muestran los productos de amplicón V-D-J-P-C-R obtenidos a partir de ADN extraído de muestras de pacientes con linfoma. La calidad del amplicón V-D-J-P-C-R antes y después de la construcción de la biblioteca se evaluó mediante un bioanalizador.

El cambio de tamaño de 334 pares de bases a 459 pares de bases indica la adición del adaptador para rastrear la evolución clonal de un caso de recaída de linfoma difuso de grandes células B. Se realizó el análisis filogenético de los perfiles de mutación somática por hipermutación (SHM) de las principales reordenaciones VDJ de la cadena pesada entre las muestras de diagnóstico y de recaída.

Se observó el modo de evolución clonal divergente tardía. Se desarrollaron nuevos métodos gráficos para visualizar la evolución clonal. Los patrones mostrados son gráficos de escalamiento multidimensional de un modelo de recaída divergente tardía y uno divergente temprana.

El radio de cada círculo indica el número de subclones correspondientes a un perfil particular de mutación somática hipercomplementaria (SHM). El color azul corresponde a la muestra de diagnóstico y el rojo a la muestra de recaída. Asimismo, los gráficos no dirigidos muestran que la distribución de los conteos de subclones en el caso de divergencia tardía difiere del caso de divergencia temprana.

Los bordes corresponden a dos perfiles de MSH que presentan una distancia de cadena de una separación de letra, y la barra de escala de color indica la proporción de secuencias que se asignan a un perfil particular de MSH, correspondiente a la muestra de diagnóstico roja o a la muestra de recaída amarilla. Al realizar este procedimiento, es importante evitar contaminaciones cruzadas entre las muestras. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la calidad de muestras tumorales de linfoma.

Este enfoque también puede utilizarse para rastrear la enfermedad residual mínima y explorar la respuesta de vigilancia inmunitaria frente a los cánceres. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.