Name: Generación de pluripotentes inducidas células madre a partir de células T periféricas Humanos Uso de Sendai virus en Condiciones-Feeder gratuita (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Aprende a generar células madre pluripotentes inducidas a partir de células T humanas periféricas utilizando vectores de virus Sendai en condiciones libres de alimentador. Este protocolo mejora la seguridad para aplicaciones en medicina regenerativa.

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Agradecemos Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi, y Rei Ohno de la Escuela de la Universidad de Keio de Medicina para la asistencia técnica. Este trabajo fue financiado en parte por un programa de apoyo a la I + D de sistemas para acelerar el uso práctico de los resultados de investigación en salud, y el Programa de Carreteras para la Realización de Medicina Regenerativa.

1. Prepare activadas las células T humanas <ol><li> Recoger 10 ml de sangre entera heparinizada de un donante por punción venosa. <ol><li> Obtener el consentimiento informado de los donantes antes de la punción venosa. Venopunción debe ser realizado por personal calificado y entrenado. </li><li> Maneje las muestras de sangre obtenidas con material estéril y siguientes pautas de bioseguridad adecuadas. </li></ol></li><li> Diluir 10 ml de sangre entera heparinizada con 10 ml D-PBS (-). </li><li> Poner 15 ml de solución de Ficoll (PREMIUM Ficoll-Paque) en un nuevo tubo cónico de 50 ml. </li><li> Capa de la solución de sangre 20-ml preparado en el Paso 1.2 en la solución Ficoll en el paso 1.3. Utilizando una pipeta eléctrica, dejó solución de sangre preparada en el Paso 1.2 run lentamente a lo largo de la pared interior del tubo. Tenga cuidado de no mezclar la solución de sangre y una solución de Ficoll. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 30 min a TA. Ajuste la velocidad de deceleración centrífuga para &quot;lento&quot;. Nota: Después de la centrifugación, una fina blancacapa emerge entre una capa de plasma lechosa superior y una capa inferior de Ficoll clara. Esta fina capa blanca contiene las células mononucleares. </li><li> Transferir la capa de células mononucleares a un nuevo tubo cónico de 50 ml con una pipeta de 1 ml. Tenga cuidado de no incluir la solución de Ficoll. </li><li> Añadir D-PBS (-) a las células mononucleares a un volumen total de 10 ml, y se centrifuga a 200 xg durante 5 min a TA. </li><li> Eliminar el sobrenadante. Añadir 10 ml de D-PBS (-) a las células mononucleares, y se centrifuga a 200 xg durante 5 min a TA. </li><li> Descartar el sobrenadante, añadir 1 ml de medio KBM502 a las células mononucleares recogidas, y contar las células utilizando un hemocitómetro. Más de 5 × 10 6 células mononucleares se pueden obtener a partir de 10 ml de sangre entera heparinizada con la separación apropiada utilizando Ficoll. </li><li> Preparar una solución de anticuerpo anti-CD3 humano a una concentración de 10 mg / ml en D-PBS (-). Añadir la solución de anticuerpo anti-CD3 humano a una placa de 6 pocillos, remoje las olasas de cada pocillo y se incuba la placa a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% durante al menos 30 minutos. </li><li> Retirar la solución de anticuerpo anti-CD3 humano de cada pocillo y lavar una vez con D-PBS (-) justo antes de la siembra de las células. </li><li> Células mononucleares de la semilla que se prepararon en el Paso 1.9 a una densidad de 2,5 x 10 5 células / cm 2 en las anti-CD3 humano placas de 6 pocillos recubiertas de anticuerpo en medio KBM502. Se incuba a 37 ° C en un 5% CO 2 incubadora durante 3-7 días sin cambio medio hasta que las células T alcanzan la confluencia. Células T en este período son ambas células suspendidas y adheridos. </li></ol> 2. Infect T humanas Las células con SeV Vectores <ol><li> Después de 3-7 días de cultivo, recoger las células T activadas con medio existente con la pipeta. Ellos Transferir a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 200 xg durante 5 min a TA. </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de medio KBM502 fresco. Contar las células y la placa 1.5 × 10 6 células (en 2 ml de medio KBM502 fresca) en cada pocillo de una placa de 6 pocillos recubiertos con anticuerpos anti-CD3. </li><li> Descongele las soluciones SeV de OCT3 / 4-SEV / TSΔF, Sox2-SEV / TSΔF, KLF4-SEV / TSΔF, y c-myc (HNL) -SeV / TS15ΔF en hielo. </li><li> Añadir las soluciones que contienen SeV OCT3 / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, KLF4-SEV / TSΔF, y c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF individualmente a los pocillos, cada uno a una multiplicidad de infección (MOI) 10. Incubar a 37 ° C en un 5% CO 2 incubadora durante 24 horas más. </li></ol> 3. Retire Vectores SeV de células T humanas <ol><li> 24 horas después de la infección, recoger las células infectadas con una pipeta. Si hay células adheridas, que fácilmente se pueden separar pipetear repetidamente hacia arriba y abajo. Ellos Transferir a un tubo cónico de 15 ml, y se centrifuga a 200 xg durante 5 min a TA. </li><li> Eliminar el sobrenadante que contiene los vectores SeV, y añadir 2 ml de medio KBM502 fresco. Células Replate en each de los pocillos. Se incuba a 37 ° C en un 5% CO 2 incubadora para un 24 h adicionales. </li></ol> 4. Las células reseed en una capa de Matrigel <ol><li> Prepare la solución de matriz de membrana basal por gel de matriz de descongelación (consulte la Lista de materiales para la marca específica utilizada en este estudio) a 4 ° C y la disolución de 0,2 ml en 10 ml de medio DMEM / F12. Nota: Gel Matrix (por favor ver la Lista de materiales para la marca específica utilizada en este estudio) tiene que descongelar O / N a 4 ° C para ser completamente descongelado. Guárdelo en hielo hasta justo antes de su uso. </li><li> Placa de disolución de la matriz de la membrana basal 5 ml por plato en platos de 100 mm y dejar a temperatura ambiente durante al menos 30 min antes de la siembra de células. Se necesitan al menos dos platos de 100 mm para un experimento. </li><li> Recoger las células infectadas por SeV mediante pipeteo, transferirlos a un tubo cónico de 15 ml, y se centrifuga a 200 xg durante 5 min a TA. </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de medio KBM502 fresco. Cuente el número de ceLLS utilizando un hemocitómetro, eliminar la solución de matriz de membrana basal de 100 mm de platos preparados en la etapa 4.2 y la placa de 1 × 10 5 y 1 × 10 6 células (en 10 ml de medio mTeSR fresco) en un 100-mm de la membrana basal de la matriz revestida platos. Por último, utilice la placa en la que las colonias se recogen fácilmente. </li><li> Incubar la placa a 37 ° C en un 5% CO 2 incubadora O / N. </li><li> Cambie el medio de 10 ml carne medio mTeSR cada dos días. Nota: Aproximadamente 20 a 30 días después de la infección, colonias que se parecen mucho a las células madre embrionarias (CES) aparecerá. </li></ol> 5. Ampliar T iPSCs derivada de células- <ol><li> Prepare la solución de matriz de membrana basal por gel de matriz de descongelación (consulte la Lista de materiales para la marca específica utilizada en este estudio) a 4 ° C y la disolución de 0,2 ml en 10 ml de medio DMEM / F12. </li><li> Placa 1 ml de la solución de matriz de membrana basal por pocillo en una placa de 6 pocillos y dejar a temperatura ambiente durante por lomenos 30 minutos antes de recoger colonias. </li><li> Llenar una placa de 96 pocillos con 20 l de medio mTeSR por pocillo. </li><li> Seleccione colonias que se asemejan a los CES bajo el microscopio estereoscópico con una pipeta 20 l. Nota: Las colonias de los CES y CMPI son redondos y plana como se muestra en la Figura 1B. </li><li> Transferencia colonias seleccionadas en la placa de 96 pocillos con medio lleno mTeSR en el Paso 5.3. </li><li> Añadir 200 l de medio mTeSR a cada pocillo y cuidadosamente pipeta arriba y hacia abajo para romper la colonia en pequeños grupos bajo el microscopio estereoscópico con una pipeta 200 l. Eliminar la solución de matriz de membrana basal de la bien preparada en 5,2 y poner cada colonia en un pocillo de la placa de 6 pocillos matriz recubiertos membrana basal con 2 ml de medio mTeSR por pocillo. </li><li> Cambie el medio de 2 ml carne medio mTeSR cada dos días. </li></ol> 6. Mantener T iPSCs derivada de células- Las células iPS derivadas de células T pueden ser mantenidosy almacenados usando las mismas técnicas que para iPSCs humanos y los CES humanos. Una vez colonias IPSC crecen, ampliarlos en platos grandes repitiendo el mismo procedimiento. <ol><li> Cambie el medio mTeSR cada 1-2 días. </li><li> Cuando las colonias se hacen confluentes cada 5-7 días, el paso de las células utilizando solución de disociación para iPSCs humanos y los CES humanos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Hayes, M., Zavazava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+generate+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Strategies to generate induced pluripotent stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).</li>
<li>Gonzalez, F., Boue, S., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+making+induced+pluripotent+stem+cells%3A+reprogramming+a+la+carte%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming a la carte.</a> Nat Rev Genet. 12, 231-242 (2011).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li>
<li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li>
<li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li>
<li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Human+Tumor+Antigen-Specific+T+Cells+from+iPSCs+Derived+from+Mature+CD8+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8 T Cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).</li>
<li>Sampsell-Barron, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-free+adaptation+and+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Xeno-free adaptation and culture of human pluripotent stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1001, 81-97 (2013).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Minegishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+optineurin+E50K-TBK1+interaction+evokes+protein+insolubility+and+initiates+familial+primary+open-angle+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Enhanced optineurin E50K-TBK1 interaction evokes protein insolubility and initiates familial primary open-angle glaucoma.</a> Hum Mol Genet. 22, 3559-353367 (2013).</li>
<li>Tanaka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1+induces+myofibrillar+disarray+and+contractile+vector+variability+in+hypertrophic+cardiomyopathy-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1 induces myofibrillar disarray and contractile vector variability in hypertrophic cardiomyopathy-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> J Am Heart Assoc. 3, e001263(2014).</li>
<li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).</li>
<li>Kishino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+peripheral+T+cells+in+defined+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells from human peripheral T cells in defined culture conditions.</a> PLoS One. 9, e97397(2014).</li>
<li>Masaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Sendai+virus-mediated+gene+transfer+to+vasculature%3A+a+new+class+of+efficient+gene+transfer+vector+to+the+vascular+system%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer to vasculature: a new class of efficient gene transfer vector to the vascular system.</a> FASEB J. 15, 1294-1296 (2001).</li>
<li>Li, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+RNA+vector+derived+from+nontransmissible+Sendai+virus+with+efficient+gene+transfer+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression.</a> J Virol. 74, 6564-6569 (2000).</li>
<li>Ikeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Sendai+virus-mediated+gene+transfer+into+adult+rat+retinal+tissue%3A+efficient+gene+transfer+by+brief+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer into adult rat retinal tissue: efficient gene transfer by brief exposure.</a> Exp Eye Res. 75, 39-48 (2002).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Macarthur, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+by+a+nonintegrating+RNA+Sendai+virus+vector+in+feeder-free+or+xeno-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+Int%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions.</a> Stem cells Int. , 564612(2012).</li>
<li>Iida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sendai+virus+vector%3A+vector+development+and+its+application+to+health+care+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Uirusu%22%5BJournal%5D)">Sendai virus vector: vector development and its application to health care and biotechnology.</a> Uirusu. 57, 29-36 (2007).</li>
<li>Yoshida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+repopulation+of+cytoplasmically+gene+transferred+hematopoietic+cells+by+temperature-sensitive+mutant+of+recombinant+Sendai+viral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Comm%22%5BJournal%5D)">In vivo repopulation of cytoplasmically gene transferred hematopoietic cells by temperature-sensitive mutant of recombinant Sendai viral vector.</a> Biochem Biophys Res Comm. 361, 811-816 (2007).</li>
<li>Bitzer, M., Armeanu, S., Lauer, U. M., Neubert, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sendai+virus+vectors+as+an+emerging+negative-strand+RNA+viral+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Sendai virus vectors as an emerging negative-strand RNA viral vector system.</a> J Gene Med. 5, 543-553 (2003).</li>
<li>Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+a+small+amount+of+human+peripheral+blood+using+a+combination+of+activated+T+cells+and+Sendai+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus.</a> Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).</li>
<li>Okano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Sendai+virus+vectors+for+activated+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes.</a> Gene Ther. 10, 1381-1391 (2003).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+nonviral+method+to+generate+integration-free+human-induced+pluripotent+stem+cells+from+cord+blood+and+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells.</a> Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).</li>
<li>Zhang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Proteom+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Cellular reprogramming of human peripheral blood cells.</a> Genom Proteom Bioinform. 11 (5), 264-274 (2013).</li>
<li>Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+iPS+Cells+from+Human+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+Using+Episomal+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors.</a> Methods Mol Biol. , (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen ninguna competencia o conflictos de intereses a revelar.

Describimos un protocolo para generar iPSC a partir de células T periféricas humanas en condiciones libres de suero y de alimentador utilizando una combinación de matrigel, medio mTeSR y vectores SeV. Para las aplicaciones clínicas de las iPSC, es importante contar con un protocolo para generar iPSC de forma estable y un método menos invasivo para el muestreo celular. Aunque la generación de iPSC con la combinación de matrigel y medio mTeSR mostró una menor eficiencia de reprogramación que la del medio de reemplazo de suero knockout (KSR) y las células alimentadoras, esta combinación logra una generación estable de iPSC a partir de donantes16. La generación estable de iPSC y el muestreo de células menos invasivo tienen la ventaja de poder aumentar el número de donantes para la generación de iPSC. 
Los vectores SeV, un virus de ARN de cadena negativa, no están integrados en el genoma del huésped. Por lo tanto, los riesgos de tumorigénesis pueden evitarse en la etapa de inducción del factor de reprogramación20-24. Además, las condiciones sin alimentador, que utilizan una combinación de medio de cultivo definido y matrigel en lugar de una capa de alimentador, permiten minimizar los riesgos potenciales de exposición a factores exógenos desconocidos. La fusión de estas técnicas proporciona una tecnología iPSC menos invasiva y más segura para la medicina regenerativa16.
Los pasos importantes en este protocolo son el paso de activar las células T humanas (Paso 1) e infectarlas con vectores SeV (Paso 2). Cuando no se obtiene una colonia similar a ESC en la placa de cultivo en un momento óptimo después de la infección por SeV, se debe considerar lo siguiente. En primer lugar, la confluencia de las células mononucleares antes de la activación de las células T puede no ser apropiada porque la activación óptima de las células T es crítica para la infección por SeV25,26. Una densidad demasiado alta de células mononucleares conduce a la muerte celular, interfiriendo con la activación adecuada de las células T. Una densidad demasiado baja de células mononucleares también perturba la activación y proliferación adecuadas de las células T. Por lo tanto, la confluencia de las células mononucleares debe verificarse y ajustarse en consecuencia. En segundo lugar, la dosis de vectores SeV puede no ser suficiente. La eficiencia de inducción de las colonias de iPSC depende de la dosis del virus6. Si no se observa una colonia similar a ESC después de la infección por SeV, se debe considerar la opción de aumentar la dosis del virus hasta un MOI de 15-20. Si se observan signos de diferenciación de colonias de iPSC, la frecuencia con la que se cambia el medio puede aumentarse hasta cada dos días, o hasta cada día cuando las colonias son más grandes. 
La limitación de este protocolo consiste en que este método no está libre de virus. Aunque SeV para la reprogramación celular está disponible comercialmente con facilidad, los usuarios deben preparar el equipo de acuerdo con el nivel de bioseguridad adecuado. Como otro método para generar iPSC sin integración, se han utilizado vectores episomales hasta ahora27-29. Aunque los vectores episomales se pueden usar con equipos con un nivel más bajo de bioseguridad, los vectores episomales pueden insertarse en el genoma del huésped a tasas extremadamente bajas. Por lo tanto, se requieren controles adicionales para confirmar la desaparición de los transgenes, como cuando se usa SeV.
Existe otra limitación en el sentido de que esta técnica no está absolutamente libre de productos derivados de animales. Algunos sustratos, como el matrigel, el mAb anti-CD3, la solución de disociación y la solución SeV se derivan de productos animales y, por lo tanto, se asocian con un riesgo de transferencia de patógenos xenogénicos. Sin embargo, la reducción de sustratos de origen animal en el sistema de cultivo es significativa para la aplicación clínica de la tecnología iPSC debido al menor riesgo.

iPSCs han atraído considerable atención como fuente innovadora de las células para la medicina regenerativa 1.3. Hasta la fecha, diversos métodos para generar células iPS se han reportado 4,5. Entre estos, iPSCs generada a partir de células T humanas han sido de particular interés debido al método menos invasivo de toma de muestras de células 6-8. Además, iPSCs derivado de las células T contiene reordenamientos del gen del receptor de células T (TCR) y son por lo tanto una fuente de células T específicas de antígeno 9,10. Por lo tanto, la generación de células derivadas de células iPS T con seguridad es útil para avanzar la medicina regenerativa. Este método se basa en el concepto de reducir el riesgo de patogenicidad impredecible. Para la aplicación clínica segura de CMPI es importante para reducir el riesgo de exposición a patógenos 11. Anteriormente en muchos sistemas de cultivo de células madre pluripotentes, las células alimentadoras de suero bovino fetal y se han utilizado como reactivo esencials 12. Sin embargo, la eliminación de estos dos reactivos de el sistema de cultivo es preferible para la generación de IPSC para reducir el riesgo de patogenicidad impredecible. Además, este método tiene la ventaja de evitar el muestreo invasivo de células de los pacientes y laboriosa preparación de células alimentadoras. Debido a que las células T derivadas CMPI ya han sido utilizados con éxito en la investigación de enfermedades 13,14, este método también es aplicable y útil para generar iPSCs específicos de la enfermedad de los pacientes. Entre los métodos de reprogramación de células T, utilizando el vector de virus Sendai (SEV) como un vehículo de genes es un método que puede generar CMPI con alta eficiencia 7,16. Además, debido a VSe es un virus de ARN monocatenario y no necesita una fase de ADN para la replicación, su uso en la generación de IPSC evita romper el genoma del huésped 17-19 de. Por lo tanto, hemos establecido protocolos para la generación de células iPS a partir de células T periféricas humanas en el suero-frvectores ee y Condiciones-alimentadoras libre utilizando una combinación de matrigel, mediano mTeSR y SeV.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM GE</td><td>Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td></td></tr><tr><td>Ratón NA/LE purificado anti-humano CD3</td><td>BD Pharmingen</td><td>555336</td><td></td></tr><tr><td>Solución de fracción V de albúmina bovina</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 kit medio</td><td>STEM CELL</td><td>5850</td><td>Calentar a temperatura ambiente antes de usar</td></tr><tr><td>Solución de disociación</td><td>ReproCELL</td><td>RCHETP002</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS(&ndash;)</td><td>Wako</td><td>045-29795</td><td></td></tr><tr><td>SeV Kit vectorial CytoTune-iPS ver.1.0</td><td>DNAVEC</td><td>DV-0303c</td><td>Descongelar en hielo antes de usar</td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>15&#160; ml Tubo de centrífuga</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50&#160; ml Tubo de centrífuga</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr></tbody></table>

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Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Recientemente, iPSCs han atraído la atención como una nueva fuente de células para terapias regenerativas. Aunque el método inicial para la generación de células iPS se basó en fibroblastos dérmicos obtenidas por biopsia invasiva y la inserción genómica retroviral de transgenes, ha habido muchos esfuerzos para evitar estas desventajas. Células T periféricas humanas son una fuente de células única para la generación de células iPS. CMPI derivadas de las células T contienen reordenamientos del receptor de células T (TCR) genes y son una fuente de células T específicas de antígeno. Además, T reordenamiento receptor de la célula en el genoma tiene el potencial para etiquetar líneas celulares individuales y distinguir entre células trasplantadas y de los donantes. Para la aplicación clínica segura de CMPI, es importante reducir al mínimo el riesgo de exponer iPSCs recién generados a los agentes nocivos. Aunque las células de suero bovino fetal y el alimentador han sido esenciales para el cultivo de células madre pluripotentes, es preferible eliminarlos del sistema de cultivo para reducir el riesgode la patogenicidad impredecible. Para solucionar esto, hemos establecido un protocolo para la generación de células iPS a partir de células T periféricas humanas utilizando virus Sendai para reducir el riesgo de exponer a los patógenos iPSCs no definidos. Aunque el manejo de virus Sendai requiere un equipo con el nivel de bioseguridad adecuado, infecta el virus Sendai activan las células T sin la inserción del genoma, pero con una alta eficiencia. En este protocolo, se demuestra la generación de células iPS a partir de células T periféricas humanas en condiciones libres de alimentador utilizando una combinación de cultivo de células T activadas y el virus Sendai.

<html> Usando este protocolo, los usuarios son capaces de generar células iPS a partir de células T periféricas humanas de manera estable. generación de IPSC a partir de células T con VSe y matrigel mostró aproximadamente 0,002% -. 0,005% de eficiencia de reprogramación celular entre varios casos de donantes y de SeV no se detectaron después de varios pasajes 16 Figura 1A muestra un esquema del protocolo para la generación de células T deriva- iPSCs en condiciones libres de alimentador usando matrigel y medianas mTeSR. Alrededor de 20 a 30 días después de la infección con la SEV, colonias IPSC se reconocen por su ESC-colonia como la morfología (Figura 1B). La tinción de inmunofluorescencia reveló expresión de marcadores de células pluripotentes típicos (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1 a 60, y TRA-desde 1 hasta 81) en iPSCs derivadas de células T generadas en condiciones libres de alimentador (Figura 1C). &quot;Width =&quot; 700 &quot;/&gt; Figura 1. (A): Un esquema del protocolo para la reprogramación de células T en condiciones de alimentación gratuita en este estudio. (B): Una colonia IPSC ESC-como típico día 27 después de la toma de muestras de sangre en condiciones libres de alimentador. (C): tinción ALP y tinción de inmunofluorescencia de marcadores de pluripotencia y de superficie (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1 a 60, y TRA-1 hasta 81) en iPSCs derivadas de células T generadas en condiciones libres de alimentador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53225/53225fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe cómo generar células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) a partir de células T periféricas humanas en condiciones libres de alimentadores utilizando una combinación de vectores de virus Matrigel y Sendai que contienen factores de reprogramación.

Generación de pluripotentes inducidas células madre a partir de células T periféricas Humanos Uso de Sendai virus en Condiciones-Feeder gratuita

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

El objetivo general de este procedimiento es generar células madre pluripotentes inducidas o IPC a partir de linfocitos T periféricos humanos en condiciones libres de alimentador. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa, incluyendo cómo se pueden aplicar las células IPS en uso clínico. La principal ventaja de esta técnica es que las células IPS pueden obtenerse sin la inclusión de factores de reprogramación que podrían ser perjudiciales, lo que reduce el riesgo de patogenicidad.La implicación de esta técnica se extiende a nivel mundial a terapias clínicamente relevantes basadas en células IPS, debido a que esta obtención de células invasiva se combina con una reducción del riesgo de exposición de las células IPS en desarrollo a patógenos indefinidos. Por lo tanto, este método puede aportar información sobre la terapia clínica con células IPS. Asimismo, puede aplicarse a otras áreas, como la modelización de enfermedades.Comience a preparar linfocitos T humanos activados diluyendo 10 mililitros de sangre total con heparina con 10 mililitros de DPBS mediante pipeta. Añada 15 mililitros de solución Fol en un tubo cónico de 50 mililitros. Pipetee lentamente la sangre diluida por la pared interna del tubo para formar una capa encima de la solución.Tenga cuidado de no perturbar la interfase. Centrifugue el tubo a 400 veces G durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, observe tres capas: una capa inferior clara, una capa blanca delgada que contiene células mononucleares y una capa superior de plasma lechoso.Transfiera la capa de células mononucleares a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros sin transferir ninguna solución del filtro. A continuación, agregue DPBS para llevar el volumen total a 10 mililitros. Centrifugue el tubo a 200 ×g durante cinco minutos a temperatura ambiente.Deseche el sobrenadante, lave las células con 10 mililitros de DPBS, centrifugue el tubo a 200 ×g durante cinco minutos y elimine el sobrenadante. A continuación, agregue un mililitro de medio KBM-502 a las células y cuente utilizando un hemocitómetro para preparar el cultivo celular. Recubra los pocillos de una placa de seis pocillos con una solución de anticuerpo anti-CD3 humano a 10 microgramos por mililitro en PBS. Incube la placa a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante al menos 30 minutos.Tras la incubación, retire la solución de anticuerpo de la placa ocho y lave una vez con PBS. Siembre las células mononucleares a una densidad de 2,5 × 10⁵ células por centímetro cuadrado en un volumen total de dos mililitros de medio KBM 502 en las placas de seis pocillos recubiertas. Incube las células durante tres a siete días sin cambiar el medio, momento en el cual las células T deben alcanzar confluencia. Tras los tres a siete días, transfiera las células T activadas junto con el medio a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 200 × g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y agregue un mililitro de medio KBM 502 fresco.Cuente las células y siembre 1,5 veces 10 a la seis células en dos mililitros de medio KBM 5 0 2 en cada pocillo de una placa de seis pocillos recubierta con anticuerpo anti-CD3. A continuación, descongele las soluciones del virus Sendai OC3-SOX2, KLF4 y C-MYC-H, y agregue individualmente cada virus Sendai modificado a cada pocillo con una multiplicidad de infección de 10. Incube a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante 24 horas. Luego, recoja las células infectadas con una pipeta y transfiéralas a un tubo cónico de 15 mililitros.Centrifugar las células a 200 veces G durante cinco minutos. Eliminar el sobrenadante y agregar dos mililitros de medio KBM 5 0 2 fresco. Colocar nuevamente las células en los pocillos de una placa de seis pocillos e incubar durante 24 horas en un incubador de cultivo celular.Para recubrir las células, primero descongele la solución de matriz de membrana basal a cuatro grados Celsius durante la noche, disuelva 0,2 mililitros de la solución concentrada en 10 mililitros de medio DMEM/F12, y agregue cinco mililitros de la solución de matriz de membrana basal en placas de 100 milímetros. Deje las placas a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos para permitir que la matriz recubra la placa antes de sembrar las células. Mientras tanto, recolecte las células T infectadas con el virus SAI en un tubo cónico de 15 litros y centrifugue a 200 × g durante cinco minutos.Luego, resuspenda el paladar en un mililitro de medio KBM 5 0 2 fresco y cuente las células utilizando un hemocitómetro tras el período de incubación de 30 minutos. Retire la solución de matriz de membrana basal de las dos placas, luego resuspenda por separado una vez 10 a la quinta células y una vez 10 a la sexta células en 10 mililitros de medio M-T-E-S-R fresco, un medio de cultivo libre de células alimentadoras para ipsc. Pipetee cada suspensión celular en una placa separada de 100 milímetros.Incubar la placa en una incubadora de cultivo celular. Cambiar el medio cada dos días tras 20 a 30 días. Deben aparecer colonias que se asemejan a colonias de células madre embrionarias.Prepare seis placas de pocillos para la expansión de IPSC incubando un mililitro de solución de matriz de membrana basal en cada pocillo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, observe las placas de cultivo que contienen colonias de IPSC bajo un microscopio estereoscópico y aísle colonias individuales raspándolas con una pipeta de 20 microlitros. Transfiera cada colonia a un pocillo de una placa de 96 pocillos que contenga 20 microlitros de medio M-T-E-S-R.Después de transferir las colonias, agregue 200 microlitros de medio M-T-E-S-R a cada pocillo y pipetee hacia arriba y hacia abajo para desintegrar la colonia. Después de eliminar la solución de matriz de membrana basal de las placas de seis pocillos, transfiera células de una colonia individual a cada pocillo, luego agregue dos mililitros de medio M-T-E-S-R, incube las células en una incubadora de cultivo celular y cambie el medio cada dos días utilizando un cultivo libre de alimentador y medios libres de suero; las cels ips se generaron a partir de linfocitos T periféricos humanos. La tinción por inmunofluorescencia reveló la expresión de marcadores típicos de células pluripotentes, incluyendo nano T tres cuatro, SSEA cuatro, TRA uno 60 y TRA 180 1.En estas líneas IPSE derivadas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar todos los pasos, teniendo en cuenta todas las consideraciones importantes de esterilidad y seguridad biológica.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Demostramos el protocolo para la generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas humanas con lentivirus mediada por la entrega de los factores humanos Oct4, Sox2, Nanog, y Lin28. Pluripotencia fue confirmada por la morfología y la presencia de células madre embrionarias (ES) de células específicas de los marcadores.

Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos humanos con los Lentivirus Stemgent Humanos TF Set

Generación de células madre pluripotentes inducidas (IPSC) Líneas produce líneas con diferente potencial de desarrollo aún cuando pasan las pruebas estándar de pluripotencia. Aquí se describe un protocolo para producir ratones totalmente derivadas de iPS, que define las líneas de IPSC como poseedor completo...

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

Aquí se muestra un protocolo simple y eficaz para la generación de iPSCs humanos de 3-4 ml de sangre periférica utilizando un único vector lentiviral reprogramación. La reprogramación de células de la sangre fácilmente disponibles promete acelerar la utilización de la tecnología de IPSC para hacerla accesible a una comunidad de investigación más amplia.

Generación de las células madre pluripotentes inducidas a partir de sangre periférica mediante el STEMCCA vector lentiviral

A continuación, presentamos nuestro método establecido para reprogramar las células somáticas humanas en transgenes libre iPSCs humanas con virus Sendai, que muestra resultados consistentes y una mayor eficiencia.

Eficiente generación, por actividad humana células madre pluripotentes de células somáticas humanas con virus Sendai-

Se desarrolló un método para derivar directamente las células madre neurales humanas a partir de células progenitoras hematopoyéticas enriquecidas a partir de células de sangre periférica.

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) representan una fuente de tejidos específicos del paciente para aplicaciones clínicas y de investigación básica. A continuación, presentamos un protocolo detallado para reprogramar células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) obtenidos a partir de buffy abrigos congelados en CMPI-virales gratis utilizando no integración de plásmidos episomales.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de Frozen Buffy Coats utilizando para no integrar episomal plásmidos

El objetivo de este protocolo es mostrar el protocolo para reprogramar linfocitos infiltrantes de tumores de melanoma en células madre pluripotentes inducidas.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de melanoma humano linfocitos infiltrantes de tumores,

Proponemos un protocolo para reprogramar células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). Al colocar las células sanguíneas transducidas en placas recubiertas de matriz con centrifugación, las iPSC se inducen con éxito a partir de células flotantes. Esta técnica sugiere un protocolo de reprogramación simple y efectivo para células como PBMC y CBMC.

Inducida por la generación de células madre pluripotentes a partir de células de la sangre usando el virus Sendai y centrifugación

Este protocolo describe un método detallado para la generación eficiente de iPSCs libres de integración a partir de células de sangre periférica adultas humanas. Con el uso de cuatro vectores episomales basados en oriP/EBNA para expresar los factores de reprogramación, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 y SOX2, se pueden obtener miles de colonias de iPSC a partir de 1 mL de sangre periférica.

Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

Este artículo describe un procedimiento para producir iTenocitos mediante la generación de células estromales mesenquimales derivadas de iPSC con sobreexpresión combinada de Scleraxis utilizando un vector lentiviral y estiramiento uniaxial a través de un biorreactor 2D.

Generación de iTenocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas a través de la sobreexpresión combinada de escleraxis y la tensión uniaxial 2D

Aprende a generar células madre pluripotentes inducidas a partir de células T humanas periféricas utilizando vectores de virus Sendai en condiciones libres de alimentador. Este protocolo mejora la seguridad para aplicaciones en medicina regenerativa.

Generación de pluripotentes inducidas células madre a partir de células T periféricas Humanos Uso de Sendai virus en Condiciones-Feeder gratuita (Video) | JoVE Journal

Generación de pluripotentes inducidas células madre a partir de células T periféricas Humanos Uso de Sendai virus en Condiciones-Feeder gratuita

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