Generación de pluripotentes inducidas células madre a partir de células T periféricas Humanos Uso de Sendai virus en Condiciones-Feeder gratuita

El objetivo general de este procedimiento es generar células madre pluripotentes inducidas o IPC a partir de células T periféricas humanas en condiciones libres de alimento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa, incluida la forma en que las células IPS se pueden aplicar en el uso clínico. La principal ventaja de esta técnica es que las células IPS se pueden curar sin la inclusión de posibles refactores de daño, lo que reduce el riesgo de patogenicidad.

La implicación de esta técnica se extiende a las terapias basadas en células IPS clínicamente relevantes a nivel mundial debido a que este muestreo celular invasivo combinado con la reducción del riesgo de exponer las células IPS en desarrollo a patógenos indefinidos. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la terapia clínica del servicio IPS. También se puede aplicar a otras áreas, como las condiciones de modelado de enfermedades.

Comience a preparar las células T humanas activadas diluyendo 10 mililitros de sangre entera heparinizada con 10 mililitros de pipeta DPBS. 15 mililitros de solución de fol en un tubo cónico de 50 mililitros. Pipetea lentamente la sangre diluida que corre a lo largo de la pared interior del tubo para colocarla encima de la solución.

Tenga cuidado de no perturbar la interfaz. Centrifugar el tubo a 400 veces G durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, observe tres capas, incluida una capa transparente inferior, una capa blanca delgada que contiene células mononucleares y una capa superior de plasma lechoso.

Transfiera la capa de celda mononuclear a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros sin transferir ninguna solución de orificio de ajuste. A continuación, agregue DPBS para llevar el volumen total a 10 mililitros. Centrifugar el tubo a 200 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Deseche el sobrenadante, lave las células con 10 mililitros de centrífuga DPBS, centrifugue el tubo a 200 veces G durante cinco minutos y retire el sobrenadante. A continuación, añada un mililitro de medio KBM 5 0 2 a las células y cuente utilizando un hemocitómetro para preparar la placa de cultivo celular, cubra los pocillos de una placa de seis pocillos con 10 microgramos por mililitro de solución de anticuerpos anti-CD tres humanos en PBS. Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante al menos 30 minutos.

Después de la incubación, retire la solución de anticuerpos de la placa ocho y lave una vez con PBS las células mononucleares a una densidad de 2,5 veces 10 a la quinta célula por centímetro cuadrado en un volumen total de dos mililitros de medio KBM 5 0 2 en las placas de seis pocillos recubiertas incubar las células durante tres a siete días sin cambiar el medio, momento en el que la célula T debería alcanzar la confluencia después de tres a siete días. Transfiera las células T activadas con un medio a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 200 veces G durante cinco minutos. Retire el SNAT y agregue un mililitro de KBM 5 0 2 medium fresco.

Cuente las células y la placa 1,5 veces 10 a las seis células en dos mililitros de medio KBM 5 0 2 en cada pocillo de una placa de seis pocillos recubierta de anticuerpos anti CD tres a continuación, descongele el OC tres SOX dos, KLF cuatro y C-M-Y-C-H, y L sendi soluciones de virus en hielo en cada virus Sendai diseñado individualmente a cada pocillo y una multiplicidad de infección de 10. Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. A continuación, recoge las células infectadas con una pipeta y transfiérelas a un tubo cónico de 15 mililitros.

Centrifugar las células a 200 veces G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y agregue dos mililitros de KBM 5 0 2 medio fresco. Reemplace las células en los pocillos de una placa de seis pocillos e incube durante 24 horas en una incubadora de cultivo celular.

Para retirar las células, primero descongele la solución de la matriz de la membrana basal a cuatro grados centígrados, disuelva durante la noche 0,2 mililitros de la solución pensada en 10 mililitros de placa mediana DMM F 12, cinco mililitros de la solución de la matriz de la membrana basal en platos de 100 milímetros. Deje las placas a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos para permitir que la matriz cubra la placa antes de sembrar las celdas. Mientras tanto, recoja las células T infectadas con el virus SAI en un tubo cónico de 15 litros y centrifugue a 200 veces G durante cinco minutos.

A continuación, vuelva a suspender el paladar en un mililitro de medio KBM 5 0 2 fresco y cuente las células con un hemocímetro después del período de incubación de 30 minutos. Retire la solución de la matriz de membrana basal de las dos placas, luego vuelva a suspender una vez 10 a las quintas celdas y por separado una vez 10 a las seis celdas en 10 mililitros de medio M-T-E-S-R fresco, un medio de cultivo libre de células alimentadoras para ipsc. Pipetee cada suspensión de celda en una placa separada de 100 milímetros.

Incubar la placa en una incubadora de cultivo celular. Cambiar el medio cada dos días después de 20 a 30 días. Deben aparecer colonias que se asemejen a colonias de células madre embrionarias.

Prepare seis placas de pared para la expansión de IPSC incubando un mililitro de solución de matriz de membrana basal en cada pocillo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, observe las placas de cultivo que contienen colonias de IPSC bajo un microscopio estereoscópico y aísle las colonias individuales raspándolas con una pipeta de 20 microlitros. Transfiera cada colonia a un pocillo y una placa de pared de 96 que contiene 20 microlitros de medio M-T-E-S-R.

Después de transferir las colonias, agregue 200 microlitros de medio M-T-E-S-R a cada pocillo y pipetee hacia arriba y hacia abajo para interrumpir la colonia. Después de eliminar la solución de matriz de membrana basal de las placas de seis pocillos, transferir las células de una colonia individual a cada pocillo, luego agregar dos mililitros de medio M-T-E-S-R, incubar las células en una incubadora de cultivo celular y cambiar el medio cada dos días utilizando un cultivo libre de alimentador y medios libres de suero. Se generaron ipsc a partir de células T periféricas humanas. La tinción inmunofluorescente reveló la expresión de marcadores típicos de células pluripotentes, incluidos nano T tres cuatro SSEA cuatro, TRA uno 60 y TRA 180 1.

En estas líneas IPSE derivadas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar todos los pasos, teniendo en cuenta todas las consideraciones importantes de esterilidad y bioseguridad.