La cuantificación de la madre del colon mutaciones celulares

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar las mutaciones somáticas fenotípicas en el gen de la glucosa seis fosfato deshidrogenasa o G seis PD en las células madre del colon. Después del tratamiento de animales con agentes genotóxicos putativos, esto se logra tratando primero a los animales con el agente esperando una cantidad adecuada de tiempo para permitir que la progenie de una célula madre portadora de una mutación G 6 PD poblará completamente una cripta, sacrificando al animal, eliminando el colon y formándolo en un rollo suizo y congelando el tejido en nitrógeno líquido. El segundo paso es preparar secciones congeladas de siete micras de espesor en portaobjetos del colon utilizando un criostato.

El tejido se calienta a 37 grados centígrados y luego se construyen pocillos por tinción de tejido alrededor de las secciones de tejido. El paso final es incubar las secciones de tejido con la mezcla de tinción G six PD y luego analizar las secciones bajo un microscopio óptico: las células con actividad G six PD se tiñen de azul, mientras que las con mutaciones fenotípicas aparecen blanquecinas. En última instancia, la cuantificación de los crips mutados se utiliza para determinar la frecuencia de las mutaciones.

Esta técnica mide las mutaciones somáticas de la glucosa seis fosfato deshidrogenasa en las células madre, y esta es la población celular crítica en la carcinogénesis del colon. Mediante la identificación de mutaciones de células madre somáticas, es posible correlacionar la frecuencia de las mutaciones con los incidentes de cáncer de colon en los animales tratados. Aunque este método puede proporcionar información sobre las mutaciones de las células madre en el colon, también se puede aplicar a otros organismos modelo o sistemas de órganos.

Si se puede identificar un nicho de células madre, generalmente las personas nuevas en este método tendrán dificultades con la preparación de la solución MBT. Solubilización. La solución MBT requiere una cuidadosa atención a las instrucciones detalladas. Para comenzar a preparar la solución de tinción histológica a dos mililitros de tampón de fosfato de pH 7.4 a 35 mililitros de temperatura óptima de corte, o medio OCT en un tubo de 50 mililitros y agitar enérgicamente para combinar con papel de pH.

Se confirmó que la solución tiene un pH aproximado de 7,4. A continuación, a la glucosa seis fosfato y una solución de DP y cloruro de magnesio disueltos en tampón de fosfato como se indica en el protocolo de texto y, de nuevo, confirmaron que el pH de la solución sigue siendo de aproximadamente 7,4. Agregue la solución M-M-P-M-S y mezcle vigorosamente.

Esto debería dar como resultado una envoltura homogeneizada de color rojo oscuro claro y la solución en papel de aluminio para minimizar la exposición a la luz. Si la solución se vuelve turbia, debe desecharse mientras se calienta un baño de aceite. Por separado, prepare una solución de cinco milimolares de nitro azul a teraz oleum o MBT mezclando 0,4 mililitros de dimetilformamida, 0,4 mililitros de etanol anhidro y MBT en un tubo de dos mililitros con una tapa de junta tórica, selle sin apretar el tubo y déjelo hervir vigorosamente en el baño de aceite hasta que se disuelva el MBT.

A continuación, deje que la solución de MBT se enfríe a temperatura ambiente y luego agréguela a la mezcla de reacción OCT. La solución puede cambiar de color del rojo anaranjado inicial a un rojo oscuro o morado con el tiempo. Después de tratar a los animales y preparar las secciones congeladas como se indica en el protocolo de texto, construya pocillos para la tinción de tejidos utilizando dos arandelas de acero unidas con grasa de silicona, ajuste el perfume a la base de la lavadora y corte el centro donde se colocará la solución reemplazada.

Antes de la guerra, el tejido congelado se deslizaba en una habitación húmeda a 37 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, coloque los pocillos en el portaobjetos para rodear las secciones de tejido con aproximadamente medio mililitro de la mezcla de tinción G six PD previamente preparada en cada pocillo de la sección de tejido e incube durante 45 a 50 minutos. Retire los portaobjetos de la habitación cálida y retire con cuidado los pozos de acero inoxidable de los portaobjetos.

Coloque los portaobjetos en el borde largo y drene la mezcla de mezcla de reacción, seguido de un lavado de 30 a 60 minutos y un tampón de fosfato de 100 milimolares. Para eliminar los restos finales de la solución de tinción G six PD, enjuague los portaobjetos y el agua desionizada durante cinco a 10 minutos para eliminar el tampón de fosfato residual. Por último, selle el tejido añadiendo gel de flúor gota a gota al portaobjetos y seque durante 30 minutos para adquirir imágenes para su posterior análisis.

Coloque el portaobjetos en un microscopio óptico y ajústelo a cuatro aumentos DX. A continuación, tome fotografías de la sección de tejido teñido con una cámara de 5,0 megapíxeles para estimar el número total de criptas examinadas. Para cada ratón, seleccione una sección del nivel con la superficie más pequeña y visualícela con un aumento de 10x.

Cuenta el número de crips mutantes. De acuerdo con los siguientes criterios, toda la cripta está desprovista de color azul. La estructura exterior de la cripta está intacta.

El mutante se observa en secciones adyacentes de siete micras y dos observadores identifican la misma cripta que el mutante. Cuente visualmente el número de criptas en esta sección y multiplíquelo por el número de niveles filtrados para cada dos puntos. Ejemplos de Crips mutantes observados en ratones tratados con el agente dañino del ADN, el azoximetano, se pueden ver aquí, a la izquierda, se ve una vista vertical o de arriba hacia abajo de una cripta mutante.

Mientras que a la derecha hay una vista horizontal o lateral, para que una cripta sea declarada mutante, todas las células dentro de la cripta deben permanecer. Las criptas blancas con una pequeña cantidad de blanco se deben a la producción de moco de las células caliciformes. La frecuencia de mutación se calcula dividiendo el número de mutantes observados por el número total de criptas no detectadas con mutantes.

Se observaron crips en el colon de ratones de control que representaban una frecuencia de mutación inferior a uno por 10 elevado a menos cinco, mientras que los ratones tratados con azoximetano mostraron una frecuencia de mutación con células madre de 4,44 veces 10 elevado a menos cuatro después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como el análisis genético del tipo de mutaciones de la glucosa x fosfato deshidrogenasa, para responder a preguntas adicionales, como cómo el agente químico codifica erróneamente una mutación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir las mutaciones de las células madre somáticas en ratones tratados con compuestos potencialmente mutagénicos y cancerígenos.