Name: La cuantificación de la madre del colon mutaciones celulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprende a cuantificar mutaciones somáticas en células madre colónicas mediante el gen G6PD en ratones tratados. Este método permite medir la frecuencia mutacional y evaluar efectos genotóxicos con reproducibilidad.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores no tienen reconocimientos.

Los procedimientos experimentales y el tratamiento ético de los animales fue aprobado por la Universidad de Pittsburgh IACUC (protocolo # 1104674). 1. Preparación de G6PD tinción Mezcla NOTA: Asegúrese de que la concentración final de cada uno de los reactivos es el siguiente; 5 mM de glucosa-6-fosfato (G6P); 2 mM NADP, 5 mM de MgCl 2, NBT 0,35 mM mM 1-metoxi-5-metilfenazinio sulfato de metilo (MMPMS) y 0.8. 1,8,9 Para cada reactivo de la concentración inicial fue derivada por unos 40 ml de volumen final. Soluciones estaban recién preparados y utilizados cada día. <ol><li> Añadir 2 ml de 200 mM pH 7,4 tampón fosfato (PB) a 35 ml de medio de octubre en un tubo de 50 ml y agitar vigorosamente. Confirmar con papel de pH que la solución es ~ pH 7,4. Si no descarta la solución. </li><li> Añadir 61 mg G6P disolvió en 0,94 ml de PB 200 mM, 61 mg NADP disolvió en 0,94 ml de PB 200 mM, y 41 mg de MgCl 2 disolvió en 0,96 ml de 100 mM PB. Reconfirmar que el pH es de ~ 7.4 ingenioh papel pH. Si no ~ 7.4, deseche la solución. </li><li> Añadir 5 mg de MMPMS disueltos en 0,25 ml de PB 200 mM (pH 7,4). Agite la mezcla de reacción resultante para generar una clara homogeneizado rojo oscuro. Si la solución es turbia, la mezcla debe ser desechada. El tubo que contiene la mezcla de reacción se envuelve en papel de aluminio para minimizar la exposición a la luz. Almacenar la mezcla de reacción a RT mientras que el componente final, NBT, se prepara. </li><li> Preparar separadamente una solución 5 mM NBT mediante la adición de 0,4 ml de formamida de dimetilo anhidra (DMF) y 0,4 ml de etanol anhidro a 164 mg de NBT en un tubo de 2 ml con una tapa de junta tórica. Cierre la tapa sin apretar (no cerrado herméticamente) y llevar la solución a ebullición vigorosa en un baño de aceite hasta que el NBT está en solución. 8 </li><li> Deje que el solubilizado NBT se enfríe a temperatura ambiente y luego poner todo de la solución a la mezcla de reacción octubre y agitar enérgicamente hasta obtener una solución clara. Observe el cambio de color de la solución de color naranja-rojo inicial a un color rojo oscuro o purpde color le paso del tiempo. Esto es normal. </li><li> Coloque la mezcla final tinción G6PD en un 37 ° C cálido ambiente durante 1 hora antes de su uso. </li></ol> 2. Tratamiento de Animales y Tejidos Colección <ol><li> Tratar a 6 semanas de edad C57BL / 6 ratones machos con el agente que daña el ADN, por ejemplo, 10 mg / kg azoximetano (AOM) en un volumen de 200 l de PBS mediante inyección ip. Tratar a los ratones de control con 200 l de PBS por inyección ip. </li><li> A los 90 días, la eutanasia a los ratones por asfixia de CO 2 seguido por dislocación cervical aprobadas por protocolo de IACUC. </li><li> Abrir quirúrgicamente la cavidad abdominal desde justo por encima del ano a la base del esternón. Mueva el intestino delgado de la cavidad del cuerpo, pero no extirparlo. Extirpar el intestino inferior justo por debajo del ciego hasta el recto. 10 </li><li> Cortar cuidadosamente a lo largo de un lado del colon utilizando una tijera micro-disección y eliminar las heces en el colon abierto por lavado con PBS estéril limpio. Rodillo suizo del impuesto especiald colon con el lado luminal hacia afuera, y colocar en un molde de tejido. 10 </li><li> Sumerja completamente los dos puntos en octubre medio y lugar molde en un Dewar que contiene líquido N 2. Mantenga el molde de manera que la base de plástico es sólo en contacto con el líquido 2 N hasta que el medio PTU sólido congelado. </li><li> Guarde el bloque de tejido congelado a -80ºC hasta cortar secciones congeladas. No utilice ningún fijador, que daría lugar a la inactivación de la enzima G6PD. </li></ol> 3. Preparación de las secciones congeladas <ol><li> Los cortes de secciones de tejido congelado en un espesor de 7 micras usando un criostato a -25 ° C. Cortar 4 consecutivos 7 micras secciones y colocar dos de ellos en la misma diapositiva (Figura 1). Prepare 2 toboganes, o cuatro consecutivos 7 micras secciones para representar un nivel del colon (Figura 1). </li><li> Repita para el siguiente nivel con una distancia mínima de&gt; 50 m desde el último tramo de la prnivel evious. Esta distancia se aseguró de que las criptas evaluados para cada nivel no se duplican entre sí. </li><li> Limpie con frecuencia la cuchilla criostato con etanol 100% para eliminar el residuo OCT se acumula durante el corte. Antes de seccionamiento se reanuda, la hoja seca se limpia con una hoja de pelo antiestático para disipar la carga estática acumulada. Diapositivas de las tiendas con las secciones congeladas a -80 ° C </li></ol> 4. La tinción de cortes congelados de tejido <ol><li> Realice la reacción de la enzima histoquímica en un 37 ° C ambiente cálido, con alta humedad. NOTA: Si se intenta la reacción enzimática en un horno de incubación o en un calentador de diapositivas llevó a las manchas G6PD pobre e inconsistente. </li><li> Construir pozos para tinción de tejidos utilizando dos 1.5 cm x arandelas de acero de 0,15 cm (interior de diámetro x altura) que están unidos entre sí mediante grasa de silicona (Figura 1). Cortar la parafina para adaptarse a la base del pozo con el centro cortado y bien el lugard sobre la sección de tejido en la diapositiva. NOTA: El Parafilm en la parte inferior de la arandela crea un sello entre la corredera y la arandela que mantiene la mezcla viscosa tinción G6PD en la sección de tejido. Esta construcción da un pozo con una 0,4 - 0,5 ml de volumen de modo que cada sección de tejido en el estudio recibe el mismo volumen de la mezcla de reacción de tinción G6PD. </li><li> Incubar los portaobjetos de tejido congelado a 37 ° C en una habitación caliente durante 10 minutos. A los 37 ° C, añadir la mezcla de reacción de tinción G6PD a cada sección de tejido bien (2 secciones por diapositiva) de 45 a 50 min. Retire los portaobjetos de la habitación caliente, y levante con cuidado los pozos de acero inoxidable fuera de las diapositivas. </li><li> Diapositivas Set en su borde largo para permitir que el medio de reacción se drene. Colocar los portaobjetos en mM PB 100 (pH 7,4) durante 30-60 min para eliminar la mezcla de reacción de tinción G6PD del tejido sin perturbar la tinción de tejidos. Sumergir los portaobjetos en agua destilada durante 5 a 10 minutos para eliminar las sales PB </li><li> Sellar el tejido mediante adding fluoro-gel a partir de un cuentagotas sobre el tejido y esperando ~ 30 min para que se seque. Evite las burbujas que pueden confundir la identificación de las criptas mutados. NOTA: Si se forman burbujas, el procedimiento se puede repetir después de la eliminación de la fluoro-gel por inmersión en agua destilada. No utilice cubreobjetos ya que tienden a atrapar burbujas de aire. </li></ol> 5. Determinación de G6PD mutante Criptas y Mutación Frecuencia <ol><li> Analizar toboganes para G6PD criptas mutantes bajo un microscopio óptico. NOTA: Los criterios utilizados para identificar una cripta completamente mutante fueron: (i) toda la cripta carecía del color azul; (ii) la estructura exterior de la cripta estaba intacta, (iii) la cripta mutante fue observado en secciones adyacentes 7 micras y, (iv) dos observadores tenían que identificar la misma cripta como un mutante. Los mutantes observados en adyacentes 7 micras secciones se cuentan como un mutante. </li><li> Imagen cada cripta mutante G6PD a 40 aumentos y catalogar las imágenes mediante una cámara de 5,0 megapíxeles consoftware de imágenes. </li><li> Cuantificar el número total de criptas examinados en un ratón mediante la selección de una sección representativa para cada ratón desde el nivel con el área de superficie más pequeña y la imagen es un aumento de 10x (Figura 1C). NOTA: Un nivel representa cuatro consecutivos 7 micras secciones (Figura 1D), que debido a su proximidad a menudo muestran mutados criptas en más de una sección. Los niveles están separados por&gt; 50 micras para visualizar criptas de diferentes áreas de los dos puntos. </li><li> Abra cada archivo de imagen y contar visualmente el número de criptas en un nivel mediante el análisis de los archivos (que se muestran como cuadros en la Figura 1C). Imágenes archivos varían en el número de criptas observados desde un mínimo de 20 a&gt; 300 criptas en un solo archivo. </li><li> Multiplicar el número total de criptas desde el nivel seleccionado (Figura 1C) para cada ratón por el número de niveles seleccionados para criptas mutantes G6PD para cada colon. Por ejemplo, un recuento total de1,250 criptas por nivel seleccionado multiplicado por 8 niveles seleccionados para criptas mutantes es igual a un recuento total de 10.000 criptas. Evaluar un mínimo de 10.000 criptas por cada dos puntos para el análisis estadístico. </li><li> Combinar el número de mutantes observados en todos los animales por el número total de criptas seleccionados para calcular la MF para cada tratamiento. El nivel de MF de células madre de fondo en los ratones no tratados es &lt;0.1x10 -4 (Tabla 1), que es similar a la reportada previamente en ratones C57BL / 6. 11 </li></ol>

<ol><li>Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+somatic+mutation+and+colonic+crypt+clonality+by+X-linked+enzyme+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry.</a> Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).</li>
<li>Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clonal+origin+of+experimental+large+bowel+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The clonal origin of experimental large bowel tumours.</a> Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).</li>
<li>Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutation+of+the+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+%28g6pd%29+gene+in+colonic+stem+cells+and+crypt+restricted+loss+of+G6PD+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity.</a> Mutat. Res. 379 (1), (1997).</li>
<li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyvinyl+alcohol+and+other+tissue+protectants+in+enzyme+histochemistry%3A+a+consumer%E2%80%99s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+J%22%5BJournal%5D)">Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer’s guide.</a> Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).</li>
<li>Giardina Rosenberg, D. W., C,, Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+the+study+of+colon+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Mouse models for the study of colon carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).</li>
<li>Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inflammation-related+mouse+colon+carcinogenesis+model+induced+by+azoxymethane+and+dextran+sodium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate.</a> Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).</li>
<li>Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+promoting+effect+of+dextran+sodium+sulfate+on+mouse+colon+carcinogenesis+initiated+with+azoxymethane%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane.</a> Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).</li>
<li>Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+peroxisomes+causes+oxygen+insensitivity+of+the+histochemical+assay+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+to+detect+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).</li>
<li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate.</a> Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).</li>
<li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Colitis+modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+%28DSS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li>
<li>Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+susceptibility+to+colonic+stem+cell+somatic+mutation+in+three+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice.</a> J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).</li>
<li>Whetstone, R. D., Gold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Cells+Enhance+Stem+Cell+Mutagenesis+in+the+Mouse+Colon%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon.</a> Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).</li>
<li>Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemistry+and+cytochemistry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).</li>
<li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+cytochemical+staining+method+for+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+erythrocytes.+II.+Further+improvements+of+the+staining+procedure+and+some+observations+with+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.</a> Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).</li>
<li>Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crypt-restricted+metallothionein+immunopositivity+in+murine+colon%3A+validation+of+a+model+for+studies+of+somatic+stem+cell+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation.</a> J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

A menudo, el efecto genotóxico de un compuesto se determina por su capacidad de modificar el ADN. Esto se hace normalmente aislando el tejido y midiendo el nivel global de aductos de ADN. Para AOM, esto implicaría la cuantificación O 6 metilguanina aductos en el colon. Con esta información el enfoque sobre los daños dentro de los tipos de células específicas, como en el nicho de células madre, se pierde. Además, un aducto de ADN no es lo mismo que una mutación ya que sólo un pequeño subconjunto de aductos se ...

Se cree que el cáncer de colon de involucrar a la exposición a los agentes ambientales y componentes de la dieta que pueden dañar el ADN y producir la activación de mutaciones somáticas en oncogenes (por ejemplo, ß-catenina) o inactivación de las mutaciones en los genes supresores de tumores (por ejemplo, APC). Se supone que estas mutaciones se producen críticos en las células madre del colon. Debido a la arquitectura única de la cripta epitelio del colon, es posible medir las mutaciones de células madre en el colon después de exponer a los animales a los productos químicos asociados con la carcinogénesis de colon. Varias enzimas ligadas al cromosoma X pueden servir como indicadores para las mutaciones que se producen en las células madre, ya que las mutaciones estarán presentes en todas las células dentro de una cripta. Anteriormente, un procedimiento se publicó que demuestra que los productos químicos que inducen tumores de colon en ratones también generaron mutaciones de células madre somáticas en el colon a través de análisis de mutaciones en el nivel de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ligada al cromosoma X gen (G6PD) 1-3.El método cuantifica la incidencia de mutaciones somáticas aleatorias en las células madre del colon sin ninguna presión de selección. El procedimiento implica la producción de secciones de colon no fijadas congelados procedentes de ratones tratados y de control y la identificación de criptas desprovistas de células que producen la actividad G6PD funcional. Estas criptas mutados, que aparecen blanco, indican que la mutación se produjo en una célula madre que dio origen a la progenie también alberga un gen G6PD mutado. En el ensayo enzimático, criptas G6PD mutante deficiente no pueden oxidar la glucosa-6-fosfato, que se requiere para la reducción de nitro azul tetrazolio (NBT). Cuando la enzima G6PD es funcional, el NBT en la mezcla de tinción se reduce a formazán insoluble y precipita, acumulando en la ubicación de la enzima y células &quot;de tinción&quot; azules. Las células que son mutantes de G6PD permanecen blanquecino en contraste con azul manchadas criptas de tipo salvaje. Este método mide mutaciones que tienen un fenotipo &quot;nulo&quot;. Debido a que enenzimas, tales como G6PD, puede difundirse fuera de las células en una sección de tejido no fijado si las secciones se colocan en una solución acuosa, es necesario para estabilizar la enzima en las secciones de tejido a analizar. 4 La estabilización de la enzima en el tejido no debe interferir con la difusión de pequeñas moléculas de reactivo necesario para la reacción enzimática G6PD. Hemos hecho una serie de cambios significativos en el procedimiento original. El medio para la tinción enzimática crítica ha sido cambiado de alcohol de polivinilo a Optimal Compuesto Temperatura de corte (OCT), lo que facilita el control del pH y la solubilización de los componentes utilizados en el ensayo. La tinción se realiza usando 0,4 - 0,5 ml pozos hechos de arandelas de acero de manera que cada sección de tejido recibió el mismo volumen de la mezcla de reacción G6PD. Se desarrolló un procedimiento para estimar el número de criptas en una sección fotografiado que proporciona una gran toma de muestras del tejido del colon sin tenerpara contar manualmente&gt; 10 5 criptas para cada colon. El análisis de los adyacentes 7 micras secciones de tejido permite la visualización de una cripta mutante en más de una diapositiva, lo que reduce los posibles artefactos de tinción. Estos cambios hacen que el procedimiento sea más eficiente y reproducible. El uso de este protocolo revisado, hemos cuantificado la frecuencia de mutación en las células madre del colon después de la exposición de ratones C57BL / 6 a azoximetano, un carcinógeno bien conocido de colon en roedores 5-7.

<table><tbody><tr><td>reactivos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>: nitroazul, tetrazolio,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NADP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, glucosa-6-fosfato</td><td></td><td></td><td></td>,</tr><tr><td>1-metoxi-5-metilfenazinio, sulfato</td><td></td><td></td><td></td>de metilo,</tr><tr><td>dimetil formamida, tampón de</td> fosfato (<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compuesto de temperatura de corte óptima (OCT)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscopio óptico equipado con cámara</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 5 megapíxeles criostato</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sala caliente&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la cuantificación de la madre del colon mutaciones celulares

Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

La capacidad de medir las mutaciones de células madre es una poderosa herramienta para cuantificar en una población celular crítico si, y en qué medida, un producto químico puede inducir mutaciones que potencialmente conducen al cáncer. El uso de un ensayo enzimático para cuantificar mutaciones de células madre en el gen de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ligada al cromosoma X se ha informado anteriormente. 1 Este método requiere la preparación de secciones congeladas y la incubación del tejido seccionado con una mezcla de reacción que produce una el color azul si las células producen la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) enzima funcional. Si no, las células aparecen de color blanquecino. Hemos modificado la mezcla de reacción usando Compuesto de corte óptimo de temperatura (OCT) medio en lugar de alcohol de polivinilo. Esto facilita la medición del pH, aumenta la solubilización de los componentes de tinción de G6PD y restringe la difusión de la enzima G6PD. Para demostrar que se produjo una mutación en una célula madre, toda la cripta debe carecer de G6PD enzimáticaactividad. Sólo si una célula madre alberga una mutación G6PD fenotípica será toda la progenie en la cripta carecen de actividad enzimática de G6PD. Para identificar las criptas con una mutación de células madre, cuatro secciones congeladas adyacentes consecutivos (un nivel) se redujeron a 7 micras espesores. Este enfoque de hacer cortes adyacentes ofrece conformación que una cripta estaba completamente mutado ya se observó la misma cripta mutado en las secciones adyacentes. Diapositivas con muestras de tejidos que fueron más de 50 micras, aparte estaban preparados para evaluar un total de&gt; 10 4 criptas por ratón. La frecuencia de mutación es el número de mutados (blanco) ÷ criptas observados por el número de tipo salvaje (azul) criptas en un grupo de tratamiento.

La capacidad de medir las mutaciones de células madre de colon en animales ofrece una manera única de correlacionar las mutaciones a la inducción de cáncer. Normalmente, se supone que el paso crítico en la carcinogénesis implica la activación de mutaciones en oncogenes y / o inactivación de mutaciones en genes supresores de tumores. Hemos inyectado C57BL / 6 ratones con 200 l de PBS o 10 mg / kg AOM en 200 l de PBS. OMA es un carcinógeno conocido de colon. 5.7 A los 90 días se analizaron los dos puntos para l...

Reportamos mejoras significativas para la medición reproducible de mutaciones somáticas de células madre colónicas después de la exposición de ratones a agentes potencialmente dañinos en el ADN.

La cuantificación de la madre del colon mutaciones celulares

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar mutaciones somáticas fenotípicas en el gen de la glucosa seis fosfato deshidrogenasa o G6PD en células madre del colon. Después del tratamiento de los animales con agentes genotóxicos putativos, esto se logra primero tratando a los animales con el agente y esperando un tiempo adecuado para permitir que la progenie de una célula madre que porta una mutación en G6PD colonice completamente un cripto, sacrificando luego al animal, extrayendo el colon y enrollándolo en forma de rollo suizo, y congelando el tejido en nitrógeno líquido. El segundo paso consiste en preparar secciones congeladas de siete micrones de grosor sobre portaobjetos a partir del colon, utilizando un criostato.El tejido se calienta a 37 grados Celsius y luego se construyen pozos por tinción de tejido alrededor de las secciones del tejido. El paso final consiste en incubar las secciones del tejido con la mezcla de tinción de G six PD y luego analizar las secciones bajo un microscopio óptico: las células con actividad de G six PD se tiñen de azul, mientras que aquellas con mutaciones fenotípicas aparecen de color blanquecino. En última instancia, la cuantificación de los crips mutados se utiliza para determinar la frecuencia de mutación.Esta técnica mide las mutaciones somáticas de la glucosa seis fosfato deshidrogenasa en células madre, que constituyen la población celular crítica en la carcinogénesis del colon. Al identificar mutaciones somáticas en células madre, es posible correlacionar la frecuencia de mutaciones con los casos de cáncer de colon en animales tratados. Aunque este método puede proporcionar información sobre las mutaciones en células madre del colon, también puede aplicarse a otros organismos modelo o sistemas orgánicos.Si se puede identificar un nicho de células madre, por lo general las personas nuevas en este método tendrán dificultades con la preparación de la solución de MBT. Solubilización. La solución de MBT requiere atención cuidadosa a las instrucciones detalladas. Para comenzar a preparar la solución de tinción histológica, agregue dos mililitros de tampón fosfato con pH 7,4 a 35 mililitros de medio de temperatura óptima para corte, o medio OCT, en un tubo de 50 mililitros y agite vigorosamente para mezclar, utilizando papel indicador de pH.Se confirmó que la solución tiene un pH aproximado de 7,4. A continuación, agregue glucosa seis fosfato y una solución de DP y cloruro de magnesio disueltas en tampón fosfato según se indica en el protocolo del texto y nuevamente confirme que el pH de la solución se mantiene aproximadamente en 7,4. AÑADA la solución M-M-P-M-S y mezcle vigorosamente.Esto debería dar como resultado un homogeneizado rojo oscuro y claro; envuelva la solución con papel de aluminio para minimizar la exposición a la luz. Si la solución se vuelve turbia, debe desecharse mientras se calienta un baño de aceite. Por separado, prepare una solución de tetrazolio azul nítrico cinco milimolar o MBT mezclando 0,4 mililitros de dimetilformamida, 0,4 mililitros de etanol anhidro y MBT en un tubo de dos mililitros con tapa de anillo tórico; cierre el tubo ligeramente y llévelo a ebullición vigorosa en el baño de aceite hasta que el MBT se disuelva.A continuación, deje que la solución de MBT se enfríe a temperatura ambiente y luego añádala a la mezcla de reacción OCT. La solución puede cambiar de color, pasando del rojo anaranjado inicial a un rojo oscuro o púrpura con el tiempo. Después de tratar a los animales y preparar cortes congelados según se indica en el protocolo escrito, construya pozos para la tinción del tejido utilizando dos arandelas de acero unidas entre sí con grasa de silicona ajustada al perfume en la base de la arandela y corte el centro donde se colocará la solución.Incube previamente las láminas de tejido congelado en una habitación húmeda a 37 grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, coloque los pocillos sobre la lámina para rodear las secciones de tejido con aproximadamente medio mililitro de la mezcla de tinción de G6PD previamente preparada en cada pocillo de sección de tejido e incube durante 45 a 50 minutos. Retire las láminas de la habitación cálida y retire cuidadosamente los pocillos de acero inoxidable de las láminas.Coloque los portaobjetos sobre el borde largo y drene la mezcla de reacción, seguido de un lavado de 30 a 60 minutos con tampón fosfato 100 milimolar. Para eliminar los últimos rastros de la solución de tinción de G seis PD, enjuague los portaobjetos con agua desionizada durante cinco a 10 minutos para eliminar el tampón fosfato residual. Finalmente, selle el tejido agregando gota a gota fluoro gel sobre el portaobjeto y seque durante 30 minutos para obtener imágenes para análisis posterior.Coloque el portaobjetos en un microscopio óptico y ajuste a una magnificación de cuatro DX. Luego, tome imágenes de la sección de tejido teñida con una cámara de 5,0 megapíxeles para estimar el número total de criptas examinadas. Para cada ratón, seleccione una sección del nivel con el área superficial más pequeña e imágenesela a una magnificación de 10 x.Contar el número de criptas mutantes. Según los siguientes criterios, toda la cripta carece de color azul. La estructura externa de la cripta está intacta.Se observa el mutante en secciones adyacentes de siete micrómetros y dos observadores identifican el mismo cripto como mutante. Cuente visualmente el número de criptos en esta sección y multiplique por el número de niveles analizados para cada colon. A continuación se muestran ejemplos de criptos mutantes observados en ratones tratados con el agente dañino para el ADN, azoximetano. A la izquierda se puede ver una vista vertical o desde arriba de un cripto mutante.Mientras que a la derecha se muestra una vista horizontal o lateral, para que un cripto sea declarado mutante, todas las células dentro del cripto deben permanecer. Los criptos blancos con una pequeña cantidad de blanco se deben a la producción de moco por las células caliciformes. La frecuencia de mutación se calcula como el número de mutantes observados dividido por el número total de criptos analizados sin mutante.Se observaron criptas en colones de ratones de control, lo que representa una frecuencia de mutación menor a una vez 10 a la menos cinco, mientras que los ratones tratados con azoximetano mostraron una frecuencia de mutación en células madre de 4,44 veces 10 a la menos cuatro tras seguir este procedimiento. Otros métodos, como el análisis genético del tipo de mutaciones en la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como la forma en que el agente químico induce errores en el código genético y provoca una mutación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir las mutaciones en células madre somáticas en ratones tratados con compuestos potencialmente mutagénicos y carcinogénicos.

quantification-of-colonic-stem-cell-mutations

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Reducción de la expresión / ausente de PMS2 y / o ERCC1 en las criptas todo es un evento frecuente dentro de los 10 cm a cada lado de los adenocarcinomas de colon, probablemente la base de un defecto en el campo con gran capacidad de mutar y progresión del cáncer. La deficiencia en Ku86 o CCOI es mucho menos frecuente en estos defectos en el campo.

PMS2 deficiente, ERCC1, Ku86, CCOI en los defectos del campo durante la progresión de cáncer de colon

Se describe un procedimiento para la desagregación de cáncer colorrectal (CCR) para producir células viables único, que son capturados en microarrays de anticuerpos a medida el reconocimiento de los antígenos de superficie (CRC DotScan microarrays). Subpoblaciones de células obligado a los microarrays pueden ser perfiladas por multiplexación de fluorescencia utilizando anticuerpos monoclonales marcados con colorantes fluorescentes.

Celular del cáncer colorrectal superficie de la proteína perfiles con un microarray de anticuerpos y la multiplexación de fluorescencia

Aquí se describe un ensayo in vivo mutagénesis por un pequeño número de células hematopoyéticas purificadas utilizando el modelo de ratón transgénico LacI. El gen LacI puede ser aislado para determinar la frecuencia, la ubicación y tipo de mutantes de ADN espontáneamente surgido o después de la exposición a genotoxinas.

La identificación de mutaciones del ADN en Purificada hematopoyéticas células madre / progenitoras

Se describe un sistema integrado para la secuenciación dirigida de próxima generación de muestras oncológicas. Este sistema multiplataforma está optimizado para biopsias tumorales de baja calidad y baja cantidad, se adapta a entradas de ADN bajas, incluye controles multivariantes bien caracterizados y cuenta con un nuevo llamador de variantes que se basa en medidas cuantitativas de control de calidad preanalítico.

Integración de Procesos húmedo y en seco de banco Optimiza Targeted secuenciación de próxima generación de baja calidad y biopsias de tumores de baja cantidad

Aquí, ofrecemos una descripción detallada de una instalación experimental para el análisis de la evaluación de la integridad del ADN en células antes del trasplante de la célula.

Evaluar la integridad del ADN de la célula de vástago para terapia celular cardiaca

El kit de diagnóstico de FL-DNA presentado es un método fácil de ahorrar tiempo y fácil de usar para determinar la probabilidad confiable de la presencia de lesiones por cáncer colorrectal.

Evaluación del riesgo y la prevalencia del cáncer colorrectal mediante la detección de la integridad del ADN de las heces

Este artículo describe un método para identificar alteraciones clonales y subclonales entre diferentes especímenes de un paciente dado. Aunque los experimentos descritos aquí se centran en un tipo de tumor específico, el enfoque es ampliamente aplicable a otros tumores sólidos.

Análisis comparativo de lesiones a través de un enfoque de secuenciación dirigida

Aquí se presenta un protocolo para descubrir los genes conductores sobreexpresados que mantienen las células similares al cáncer derivadas de las células HT29 colorrectales. RNAseq con bioinformática disponible se realizó para investigar y examinar las redes de expresión génica para esclarecer un mecanismo potencial implicado en la supervivencia de las células tumorales dirigidas.

Descubrimiento de genes conductores en tumores timos similares al cáncer de 29 años de origen colorrectal

Este protocolo presenta un sistema nuevo, robusto, y reproducible de la cultura para generar y para crecer esferoides tridimensionales de las células de la adenocarcinoma de los dos puntos Caco2. Los resultados proporcionan la primera prueba de concepto de la idoneidad de este enfoque para estudiar la biología de las células madre cancerosas, incluida la respuesta a la quimioterapia.

Un modelo tridimensional de esferoides para estudiar las células madre del cáncer de colon

Este protocolo describe un método simple y rentable para investigar y cuantificar la muerte celular en organoides colónicos humanos en respuesta a perturbaciones citotóxicas como las citocinas. El enfoque emplea un colorante fluorescente de muerte celular (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), microscopía de fluorescencia en vivo y software de análisis de imágenes de código abierto para cuantificar las respuestas de un solo organoide a estímulos citotóxicos.

Cuantificación de la muerte celular inducida por citocinas en organoides colónicos humanos mediante microscopía de fluorescencia en vivo

Aprende a cuantificar mutaciones somáticas en células madre colónicas mediante el gen G6PD en ratones tratados. Este método permite medir la frecuencia mutacional y evaluar efectos genotóxicos con reproducibilidad.

La cuantificación de la madre del colon mutaciones celulares

Explorar más videos