Clasificación celular del Neuronales madre y progenitoras Las células del adulto Ratón zona subventricular y Live-imágenes de sus Dinámica del Ciclo Celular

El objetivo general de este procedimiento es seguir la progresión del ciclo celular de células madre neurales ordenadas y sus progenias aisladas de la zona subventricular de ratones transgénicos con ubiquitinación fluorescente conocidos como ratones FCI. Esto se logra primero mediante la disección de la zona subventricular de cerebros de ratones adultos transgénicos. El segundo paso consiste en disociar el tejido neuronal en una suspensión simple de células utilizando un tratamiento con papaya.

A continuación, las diferentes poblaciones celulares neurogénicas de la zona subventricular se marcan mediante el uso de anticuerpos para identificar células madre neurales en estado de quiescencia, células madre neurales activadas, células de amplificación transitoria y neuroblastos inmaduros así como migratorios. El paso final consiste en utilizar citometría de flujo para clasificar directamente las células en medio de cultivo fresco antes de sembrarlas en placas recubiertas con poli-D-lisina. Finalmente, se utiliza microscopía de video de lapso de tiempo continuo para estudiar la progresión del ciclo celular de las células sembradas, ya que las distintas células transgénicas fluorescen en diferentes momentos durante su ciclo celular.

Combinar la técnica de clasificación celular con la tecnología Fuji permite la visualización y el aislamiento de las diferentes poblaciones celulares de la zona subventricular, posibilitando el estudio de sus propiedades y dinámicas en el cerebro adulto en movimiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el contexto del envejecimiento y las patologías cerebrales. El día antes del experimento, añada aproximadamente 200 microlitros de una solución de poli-D-lisina a 10 microgramos por mililitro a cada pocillo de una placa estéril de 96 pocillos con paredes negras para recubrir el fondo de los pocillos. Tape la placa e incúbela toda la noche a 37 grados Celsius.

Retire la solución de poli D lisina y enjuague los pocillos tres veces con agua destilada estéril antes de dejar secar la placa en la campana de flujo laminar durante al menos dos horas. Si no se utiliza inmediatamente, almacene la placa recubierta y seca a cuatro grados Celsius durante un máximo de siete días.

A continuación, prepare la solución de disociación con papaína y esterilícela pasando la mezcla a través de un filtro de 0,2 micrones. Precaliente la solución a 37 grados Celsius antes de usarla. Asimismo, prepare una solución de inhibidor de proteasas añadiendo 0,7 miligramos por mililitro de tripsina en inhibidor tipo dos al medio TM F 12 estéril.

Filtre la solución utilizando un filtro de 0,2 micrones y precaliente la solución a 37 grados Celsius antes de usarla. Coloque la zona ventricular subventricular recién diseccionada del cerebro de un ratón adulto fucci rojo en una placa de Petri que contenga 0,6 % de glucosa en PBS y pique el tejido hasta que no queden piezas grandes. A continuación, transfiera todo a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 200 ×g durante cinco minutos.

Una vez que el tejido haya sido centrifugado, deseche el sobrenadante y resuspenda. Suspenda el tejido en un mililitro de papaína precalentada, suplementada con 0,01 miligramos por mililitro de DNAasa I. Incube la mezcla durante 10 minutos en un baño de agua a 37 grados Celsius.

Luego, centrifugue nuevamente a 200 veces G durante cinco minutos y deseche el sobrenadante. Añada un mililitro de la solución OVO MOID precalentada para detener la digestión enzimática. A continuación, use una punta de micropipeta P1000 para pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo 20 veces, disociando mecánicamente el tejido picado en una suspensión de células individuales mientras pipetea.

Evite introducir burbujas de aire en la mezcla, ya que causarían estrés adicional a las células. Pase la suspensión celular a través de un filtro estéril de 20 micrones en un tubo nuevo de 15 mililitros. Lave el filtro celular con dos mililitros de PBS que contenga 0,15 % de BSA para evitar la pérdida de células.

Luego, centrifugue la suspensión celular a 200 veces G durante 10 minutos. Descarte el sobrenadante. Realice la tinción con anticuerpos suspendiendo primero las células de cada ratón en 100 microlitros de PBS que contenga 0,15 % de BSA.

Utilice una décima parte de las células de uno de los ratones para preparar cada uno de los cuatro controles según se describe en el protocolo de texto adjunto. Añada los anticuerpos primarios enumerados aquí a cada uno de los tubos utilizados para la clasificación celular e incube las mezclas durante 20 minutos a oscuras a cuatro grados Celsius. Tras la incubación con los anticuerpos primarios, lave las células con un mililitro de PBS que contenga 0.15% BS, A, y luego centrifugue las células a 200 veces G durante 10 minutos.

Re suspender las células en 200 microlitros de PBS que contenga 0,15 % de BSA por cerebro y transferirlas a los tubos de ordenación adecuados. Colocar los tubos de ordenación celular en hielo y añadir un colorante vital, como el colorante Hoechst 33258, a una concentración de dos microgramos por mililitro a las células inmediatamente antes de la ordenación para discriminar entre células vivas y muertas.

A continuación, pase las células del tubo de control negativo a través del citómetro y seleccione las células utilizando los parámetros de dispersión lateral y dispersión directa. Excluya las células muertas mediante la selección solo de los picos correspondientes a la fracción negativa y los dobletes al seleccionar el pulso con fracción negativa. Ejecute controles de un solo color y ajuste los voltajes del tubo fotomultiplicador si es necesario.

Realice la compensación de color en la ventana de compensación del software. Ejecute los tres controles de fluorescencia menos uno y dibuje las compuertas de ordenación. Una vez que todas las compuertas estén configuradas, ordene directamente las células marcadas en 100 microlitros de cultivo.

Plaquear en placa mediana las células recién ordenadas a una densidad de 1000 a 3000 células por pocillo sobre placas de 96 pocillos recubiertas con poli-lisina, utilizando 300 microlitros de medio de cultivo. Incubar las placas de cultivo a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante al menos una hora.

Para permitir la adhesión celular, prepare un microscopio confocal de barrido láser para la adquisición de imágenes precalentando la cámara controlada por temperatura adjunta a 37 grados Celsius bajo una atmósfera de 5% de dióxido de carbono. Coloque la placa de 96 pocillos dentro de la cámara del microscopio precalentada y enfoque el primer pocillo. A continuación, abra el software de adquisición de imágenes y haga clic con el botón derecho en la ventana principal para seleccionar los controles de adquisición y la adquisición de DEAC.

Para abrir la almohadilla de TI y seleccionar a continuación el objetivo plan A PO VC 20 XDIC, haga clic en los controles de adquisición y luego abra las opciones de lapso de tiempo. Establezca el centro de cada pocillo como posición de la platina y seleccione la opción de imagen grande a siete por siete milímetros cuadrados. Observe una imagen en mosaico alrededor del centro de cada uno.

Establezca la superposición para la imagen mosáica grande en un 5 % y configure la frecuencia para que se tomen imágenes cada 20 minutos durante 24 horas. En la configuración de uno más, seleccione el nivel de voltaje del tubo multiplicador de foto para cada fluorescencia que aparece en la barra de menú. Seleccione adquirir imágenes utilizando un escáner de resonancia de alta velocidad en un formato de cincocientos doce por quinientos doce píxeles y use DIC para visualizar las células.

Luego, seleccione una carpeta para guardar los archivos de datos. Seleccione el botón ejecutar ahora en la ventana de adquisición ND para comenzar la adquisición. Siga el trabajo en la computadora durante al menos un ciclo completo para asegurarse de que todo funcione correctamente.

Se utilizaron ratones rojos Fuji para seguir la fase G1 mediante fluorescencia roja usando microscopía de video con lapso de tiempo. Las células aisladas son fluorescentes rojas durante la primera fase de crecimiento y nuestro ciclo de colores durante la síntesis, la segunda fase de crecimiento y la mitosis. Lex positivo eeg FR positivo y eeg.

Se sembraron y rastrearon mediante microscopía células FR positivas de ratones adultos jóvenes y de mediana edad. La duración de las fases S y G2/M no mostró diferencias entre células EGFR positivas y células EGFR positivas, ya sea en ratones jóvenes o de mediana edad. Sin embargo, se encontró que la duración de la siguiente fase de crecimiento, desde la primera división hasta que se apaga la fluorescencia roja, fue más larga en las células más viejas debido al aumento en la duración de la fase G1.

Las neuroesferas obtenidas cinco días después del siembra son más pequeñas en células positivas para Lex y positivas para EGFR obtenidas de ratones mayores. Todo el protocolo no debe exceder tres horas para la disección y la preparación del fax, y otras tres horas para el ordenamiento celular cuando se trabaja con 12 ratones. Tenga en cuenta que trabajar con demasiados ratones en el mismo día conducirá a una mayor duración del ordenamiento celular y posiblemente a un aumento en la muerte celular o diferenciación celular.