Name: Un método optimizado para aislar y expandir Invariante Natural Killer células T de ratón Bazo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprenda a aislar y expandir células iNKT del bazo de ratón mediante separación magnética y citometría de flujo. Este protocolo optimizado maximiza el rendimiento celular para estudios inmunológicos.

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D.E. y M.B.D. son miembros de una plataforma de investigación multidisciplinaria (MRP) de la Universidad de Gante, y del consorcio de Investigadores de Gante sobre Proteínas Desplegadas en Enfermedades Inflamatorias (GROUP-ID).

En este estudio, se utilizaron adultos (6-8 semanas) hembra C57Bl / 6 ratones. Los animales fueron alojados y criados de acuerdo con las directrices del vivero Universidad de Gante. Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Ética Animal Institucional. 1. Preparación de células mononucleares (CMN) de ratón Bazo <ol><li> Sacrificar el ratón por dislocación cervical. </li><li> Coloque el mouse hacia abajo en el tablero de disección y fijar la cierva y patas delanteras con alfileres. </li><li> Esterilizar la superficie de la piel con 70% (vol / vol) de etanol / H 2 O. </li><li> Cortar la piel a lo largo de la línea media abdominal al tórax y exponer el bazo usando instrumentos quirúrgicos estériles. </li><li> Después de recortar los tejidos grasos circundantes, colocar el bazo en una placa de 24 pocillos que contenía 1 ml de 1x tampón fosfato salino (PBS) a TA. </li><li> Diseccionar el bazo utilizando un bisturí estéril y transferir las piezas en un filtro de nylon de 70 micras colocado dentro de una tina 50 mle. </li><li> El uso de un émbolo de la jeringa 2 ml, puré suavemente las piezas de bazo a través de la filtro de células y lavar con 5 ml de PBS 1x. </li><li> Añadir 3 ml de Ficoll-Paque a un tubo de 15 ml y superponer el medio de gradiente de densidad con el 5 ml de suspensión celular. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 20 min a TA sin freno. </li><li> La transferencia de la interfase a un tubo de 15 ml fresca, añadir 10 ml de PBS frío 1x y centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender las células en 2 ml de 1x PBS que contenía 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA) y 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (tampón FACS). Transferencia de 10 l de la suspensión celular a un tubo pequeño, se mezcla con 10 l de 0,4% </li></ol> 2. Enriquecimiento, detección y purificación de células de ratón iNKT <ol><li> Enriquecimiento de esplénicas de ratón CD5positive (CD5 +) linfocitos. <ol><li> (Opcional) Manchas 10 5 células con FITC-conjugado anti-CD5 (4 l de 1:30 dilución / 10 6 células)durante 30 min a 4 ° C en la oscuridad, se lava con 200 l de tampón FACS y resuspender en 500 l de tampón FACS. Preparar una solución de trabajo 20 mM de 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en PBS 1x, añadir 1 l del mismo a 10 5 células en tampón FACS y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min. Adquirir 10 4 células pre-enriquecido en el citómetro de flujo. <ol><li> Usando FCS-H y FCS-W, electrónicamente puerta en las células del lo FSC-W para excluir dobletes de células y agregados (Figura 1a). Entonces electrónicamente puerta hacia fuera + células (muertos) DAPI dentro de la W-FSC lo población (Figura 1B), y utilizan SSC-A y FCS-A para seleccionar electrónicamente la población de linfocitos por tamaño (Figura 1C). </li><li> El uso de células dentro de la puerta de linfocitos, trazar SSC-A versus CD5 y electrónicamente puerta CD5 + linfocitos como se muestra en la Figura 1D. Adquirir el resto de la muestra pre-enriquecido en el citómetro de flujo. </li&gt; </ol></li><li> Ajustar los recuentos de células a 10 7 células por 90 l de tampón FACS y añadir 10 l microperlas anti-CD5. </li><li> Se incuba a 4 ºC durante 15 min, se lava una vez con 4 ml de tampón FACS y resuspender en 500 l de tampón FACS frío. Enriquecer para CD5 + linfocitos utilizando separación celular magnética (MACS) columnas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. </li><li> Opcional) Stain 10 5 células con FITC-conjugado anti-CD5 (4 l de dilución 1:30 / 10 6 células) y DAPI como en 2.1.1. Adquirir 10 4 linfocitos enriquecidos en el citómetro de flujo y verifique que las puertas electrónicas creadas en 2.1.1. seleccionar CD5 + linfocitos en la fracción celular enriquecida. Adquirir 10 5 células en el citómetro de flujo y analizar el porcentaje CD5 + linfocitos presentes en la fracción enriquecida como se muestra en la Figura 1E - H. </li></ol></li><li> Detección y aislamiento de ratón iNKT ceLLS por FACS. <ol><li> Resuspender CD5 + linfocitos enriquecidos en una concentración de aproximadamente 10 6 células por 20 l en tampón FACS que contiene anti-CD16 / CD32 (4 l de dilución 1:50 / 10 6 células) y αGalCer PE-conjugado / tetrámero CD1d (1 g / 10 6 células). </li><li> Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Diluir los anticuerpos de ratón (mAb) anti-CD3ε V500 (4 l de dilución 1:20 / 10 6 células), anti-CD19 E450 (4 l de dilución 1:50 / 10 6 células) y anti-CD8a E450 (4 l de dilución 1:50 / 10 6 células) en tampón FACS, añadir a CD5 + linfocitos e incubar durante 30 minutos a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Lavar las células con 1 ml de tampón FACS mediante centrifugación a 300 xg durante 10 min a 4 ° C y resuspender en 4 ml de tampón de FACS a una concentración final de 10 7 células / ml. </li><li> Filtrar las células a través de un filtro de células de 30 micras y colocar las células en hielo. </li><li> Calibrar el citómetro de flujo para la clasificación de células de acuerdo con las recomendaciones del fabricante 14,15. Nota: La calibración de un citómetro de flujo para la clasificación de células requiere entrenamiento y puede ser realizada por un operador con experiencia, o un técnico capacitado. </li><li> Añadir 10 l de una solución de trabajo 20 mM de DAPI por cada 10 6 células y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min. Adquirir aproximadamente 10 4 CD5 + linfocitos enriquecidos en el citómetro de flujo. Puerta electrónicamente en las células del lo FSC-W para excluir dobletes de células y agregados (Figura 2a). Entonces electrónicamente puerta a cabo DAPI + CD8 + CD19 + células (canal volcado) dentro de la FSC-W lo población (Figura 2B), y el uso de SSC-A y FCS-A para seleccionar electrónicamente linfocitos (Figura 2C) como se describe en 2.1.1.1 . <ol><li> Terreno αGalCer / CD1d tetrámero por CD3ε y electrónicamente puerta αGalCer / CD1dcélulas tetrámero + CD3ε + iNKT como se muestra en la Figura 2D. Células presentes en la fracción celular enriquecida Adquirir no más de 2 x 10 5 CD5 + linfocitos enriquecidos para determinar el porcentaje αGalCer / CD1d tetrámero + CD3ε + iNKT. </li></ol></li><li> Utilizando las puertas electrónicas creadas en 2.2.7., Células FACS tipo αGalCer / CD1d tetrámero + CD3ε + iNKT en el citómetro de flujo a 70 psi utilizando una boquilla de 70 micras, con un caudal de &#39;1.5&#39;. Recoger las células iNKT ordenados en un tubo de FACS que contiene 1 ml de 100% de FCS. Posteriormente enjuague células iNKT ordenadas por el lado del tubo de FACS utilizando 10 ml RMPI 1640 y centrifugar las células a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender las células ordenadas iNKT en 1 ml de medio RPMI 1640 y adquirir 40 l del mismo sobre un citómetro de flujo para evaluar la pureza de las células iNKT ordenados. Seleccione FSC-W lo DAPI - linfocitos como se describe en 2.2.7. (Figura 2E - G) y electrónicamente puerta αGalCer / células tetrámero + CD3ε + iNKT CD1d, como se muestra en la figura 2H. </li></ol></li></ol> 3. Cultura y expansión de células de ratón iNKT Día 0 <ol><li> Escudo una placa de pocillos de fondo plano con 96 anti-CD3ε purificada (3 mg / ml) por pocillo durante 1 hora a RT. Lavar dos veces con 200 l de 1x PBS y una vez con 200 l de medio RPMI 1640 completo (10% FCS vol / vol, 100 U / ml de penicilina-estreptomicina, 5,5 mM β-mercaptoetanol). </li><li> Contar el número de células viables según iNKT (paso 2.2.8) utilizando 0,4% como en un hemocitómetro 1.11., Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C y resuspender en 5 x 10 5 células / ml en RPMI 1640 medio completo que contiene IL-2 murina (10 ng / ml) recombinante, IL-12 murina (1 ng / ml) recombinante soluble y anti-CD28 de ratón (5 mg / ml). Platosorted células iNKT a 10 5 células / pocillo en placas revestidas anti-CD3ε y se incuba a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante 2 días. </li></ol> Dia 2 <ol start="3"><li> Transferir las células a una placa fresca sin recubrimiento de fondo plano de 96 pocillos y la cultura de las células bajo condiciones de reposo en medio completo RPMI 1640 a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante 2 días. </li></ol> Día 4 <ol start="4"><li> Desalojar a los células de la placa por pipeteado suave y transferir las células a un tubo de 15 ml fresco. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C, se resuspenden a 5 x 10 5 células / ml en RPMI completo 1640 que contienen IL-7 murina (5 ng / ml) recombinante, y la placa 10 5 células / pocillo en una Flat- fondo placa de 96 pocillos durante 4 días a 37 ° C en una incubadora de CO 2. </li></ol> Día 8 <ol start="5"><li> Recoger las células en un tubo nuevo, centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C y resuspender en 5 x 10 5 células / ml en medio completo RPMI 1640 que contenía soluble anti-CD28 (5 g / ml). </li><li> Escudo una placa de fondo plano 96 con anti-CD3ε purificada (3 mg / ml) por pocillo y lavar como en 3.1. Placa 10 5 células / pocillo en CD3ε anti-placas recubiertas y se incuba a 37 ° C en una incubadora de CO 2 hasta 11 días. </li></ol> Día 11-18 <ol start="7"><li> Repita los pasos 3,4 a 3,6. </li></ol> Día 19-20 <ol start="8"><li> Transferir las células a un tubo de 15 ml fresca, centrifugar a 300 xg y resuspender en 5 x 10 5 células / ml en medio RPMI 1640 completo. </li><li> Células de la placa en 10 5 células / pocillo en una placa de pocillos de fondo plano 96 y permitir que las células en reposo durante 2 días a 37 ° C en una incubadora de CO 2 antes de su uso en un experimento. </li></ol> 4. Producción de citoquinas por el ratón células iNKT Utilizando un CD1d PlatEnsayo de e-unido <ol><li> Escudo una placa de pocillos de fondo plano 96 con 100 l de murina recombinante CD1d (10 g / ml en PBS 1x) por pocillo e incubar durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Lavar cuatro veces con 200 l de 1x PBS, añadir 200 l de 2% de FCS en 1x PBS (solución de bloqueo) por pocillo y se incuba durante 2 horas a 37 ° C. </li><li> Eliminar la solución de bloqueo, añadir 200 l de αGalCer (5 ng / l) por pocillo, y se incuba la placa a 37 ° C durante 16 horas. [Para la preparación de la solución αGalCer, añadir 1,085 μ 1x PBS a 55 g de αGalCer disuelto en vehículo que contiene 96 mg / ml de sacarosa, 10 mg / ml y desoxicolato de sodio 5 mg / ml tween 20]. </li><li> Después de la incubación, desechar la solución αGalCer y lavar el pozo dos veces con 200 l 1x PBS seguido de 200 l completa medianas RPMI 1640. </li><li> Recoger las células iNKT expandidas in vitro en el día 21, de centrifugación las células a 300 xg durante 10 min a 4 ° C y resuspender en completa RPMI 1640 a una concentración de 0,5 x 10 6 células / ml. </li><li> Añadir 200 l de la resuspensión de células iNKT por pocillo y se incuba durante 72 horas a 37 ° C en una incubadora de CO 2. </li><li> Recoger el sobrenadante y la medición de las citoquinas de interés por el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li></ol>

<ol><li>Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+CD1-specific+NK1+T+cells%3A+development%2C+specificity%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function.</a> Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).</li>
<li>Kronenberg, M., Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unconventional+lifestyle+of+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immuno%22%5BJournal%5D)">The unconventional lifestyle of NKT cells.</a> Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).</li>
<li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+CD1d-restricted+repertoire+is+dominated+by+a+few+autoreactive+T+cell+receptor+families%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families.</a> J Exp Med. 193, 893-904 (2001).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+glycosphingolipid+recognition+by+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells.</a> Science. 306, 1786-1789 (2004).</li>
<li>Cardell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1-restricted+CD4%2B+T+cells+in+major+histocompatibility+complex+class+II-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice.</a> J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).</li>
<li>Kawano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1d-restricted+and+TCR-mediated+activation+of+valpha14+NKT+cells+by+glycosylceramides%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides.</a> Science. 278, 1626-1629 (1997).</li>
<li>Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells+in+rheumatic+disease%3A+a+joint+dilemma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).</li>
<li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKT+cells+in+immunoregulation+of+tumor+immunity%3A+a+new+immunoregulatory+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis.</a> Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).</li>
<li>Molling, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+sustained+expansion+of+mouse+spleen+invariant+NKT+cell+lines+with+preserved+cytokine+releasing+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity.</a> J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).</li>
<li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128, 324-333 (2009).</li>
<li>Gumperz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+CD1d-restricted+T+cell+recognition+of+cellular+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids.</a> Immunity. 12, 211-221 (2000).</li>
<li>Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+TCRs+recognize+murine+CD1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diverse TCRs recognize murine CD1.</a> J Immunol. 162, 161-167 (1999).</li>
<li>Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection%2C+isolation+and+culture+of+mouse+and+human+invariant+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells.</a> Nature protocols. 3, 70-78 (2008).</li>
<li>Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).</li>
<li>Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+quantifying+cell+sorting+yield+in+%27real+time%27%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).</li>
<li>Drennan, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thymic+microenvironment+differentially+regulates+development+and+trafficking+of+invariant+NKT+cell+sublineages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages.</a> J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses contrapuestos que divulgar.

Los pasos críticos en el actual protocolo incluyen el aislamiento y posterior enriquecimiento de CD5 + linfocitos (Sección 1 y 2), FACS clasificación (Sección 3) y el recubrimiento inicial de células iNKT (Sección 4). De los pasos realizados en la Sección 1, recuerda a la capa cuidadosamente la suspensión celular esplénica sobre el medio de gradiente de densidad tal que una interfase celular distinta se genera después de la centrifugación. El enriquecimiento posterior para CD5 + linfocitos por sepa...

Murine células asesinas naturales invariantes T (iNKT) son una población distinta de los linfocitos T innatas seleccionados en el timo por timocitos corticales que expresan CD1d 1,2. iNKT células expresan un receptor de células T (TCR) compuesto de una cadena invariante Vα14-Jα18 TCR se combina con cualquiera de Vß8, Vβ7 o Vβ2 TCR 3, que es capaz de reconocer endógena, así como antígenos lipídicos extranjeros en el contexto de CD1d. Por ejemplo, las células murinas iNKT reconocen y se activan por una llamada isoglobotrihexosylceramide antígeno de lípidos endógenos (iGb3) 4, así como α-galactosylceramide (αGalCer) 5,6, un glicolípido aislado de esponjas marinas. TCR dependiente de la activación de células iNKT promueve el cebado de la respuesta inmune adaptativa, y como resultado, las células iNKT han demostrado ser funcionalmente implicado en la mejora o desarrollo de una gama de patologías incluyendo la enfermedad reumática 7 y el cáncer &lt;sup&gt; 8. Actualmente, los ligandos de células iNKT sintéticos constituyen prometedores nuevos adyuvantes de vacunas que pueden ser capaces de regular una serie de condiciones inmunopatológicas. Previamente se ha demostrado que las células iNKT pueden ser generados in vitro tras el aislamiento a partir de tejido de ratón sin embargo; muchos de estos estudios emplean el uso de células primarias presentadoras de antígeno (APC) y / o líneas celulares 9, Vα14 TCR transgénicos (Tg) 10 ratones, timomas o para la generación de hibridomas de células derivadas de iNKT 11,12. Por otra parte, un gran número de ratones, los altos volúmenes de reactivos tales como dímeros CD1d cargados-αGalCer y largos tiempos de cultivo hacen algunos protocolos publicados menos ética y económicamente atractiva 9,13. En este informe se describe un método adaptado para el aislamiento y en la expansión in vitro de células iNKT de bazo de ratón. Más específicamente, el protocolo describe un métodopara enriquecer células iNKT de bazo de ratón que reduce los ratones, los reactivos y el tiempo necesario para la clasificación de células FACS, y propone un enfoque optimizado para la expansión de las células iNKT esplénica ordenados in vitro.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>il-2 murino recombinante</td><td>eBiosciences</td><td>14-8021</td><td></td></tr><tr><td>IL-12 murino recombinante</td><td>eBiosciences</td><td>39-8122-65</td><td></td></tr><tr><td>IL-7 murino recombinante</td><td>eBiosciences</td><td>14-8071</td><td></td></tr><tr><td>purificado anti-ratón CD3e (145-2C11)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0032-86</td><td></td></tr><tr><td>purificado anti-ratón CD28 (37.51)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td></td></tr><tr><td>e450-conjugado anti-ratón CD19 (eBio1D3)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>e450-conjugado anti-ratón CD8&alpha; (53-6.7)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>CD5 anti-ratón conjugado por FITC (53-7.3)</td><td>eBiosciences</td><td>11-0051-81</td><td></td></tr><tr><td>V500-anti-ratón conjugado CD3&épsilon; (500A2)</td><td>BD biosciences</td><td>560771</td><td></td></tr><tr><td>microperlas anti-ratón CD5 (Ly-1)</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-049-301</td><td></td></tr><tr><td>purificado anti-ratón CD16/32 (2.4G2)</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS Columnas</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Azul Tripano, 0.4% (peso/volumen)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 mediano</td><td>Gibco</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-056</td><td>[Ca2+/Mg2+ - gratis]</td></tr><tr><td>Suero fetal de ternera</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-123</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina</td> <td>sérica bovinaSigma-Aldrich</td><td>A7906-100MG</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00 AF</td><td></td></tr><tr><td>Equipment Placa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 96 pocillos F-bottom</td><td>Greiner-bio one</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos</td><td>Greiner-bio one</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>Greiner-bio one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>15 ml falcon tubo</td><td>Greiner-bio one</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubo halcón</td><td>Greiner-bio one</td><td>227-261</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m filtro</td><td>Greiner-bio one</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>30 &micro; Filtro m</td><td>Millipore</td><td>SVGP01050</td><td></td></tr><tr><td>Separador MiniMACS</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MS Columnas</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 con camisa de agua</td><td>Hemocitómetro VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de disección</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR BD FACSAria III</td><td>BD Biociencias</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un método optimizado para aislar y expandir invariante natural killer células t de ratón bazo

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

La capacidad de secretar citocinas rápidamente tras la estimulación es una característica funcional de la invariante natural killer T (iNKT) linaje de células. Por lo tanto, las células iNKT se caracterizan como una población innata de las células T capaz de activar y adaptativa de dirección respuestas inmunes. El desarrollo de técnicas mejoradas para la cultura y la expansión de las células iNKT murinos facilita el estudio de la biología de las células iNKT en in vitro y en sistemas modelo in vivo. Aquí se describe un procedimiento optimizado para el aislamiento y expansión de las células esplénicas murinas iNKT. Se eliminan los bazos de ratones C57BL / 6 ratones, diseccionaron y tensas y la suspensión celular resultante se acoda sobre medios de gradiente de densidad. Después de la centrifugación, las células mononucleares del bazo (CMN) se recogen y (CD5 +) linfocitos CD5 positivas son enriquecidos por usar perlas magnéticas. células iNKT dentro de la fracción CD5 + son posteriormente teñidas con ^5; GalCer-cargado tetrámero CD1d y se purificó mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). FACS ordenadas células iNKT son entonces cultivaron inicialmente in vitro usando una combinación de citocinas murinas recombinantes y receptor de células T unido a placa (TCR) estímulos antes de ser expandido en presencia de IL-7 murina recombinante. Usando esta técnica, aproximadamente 10 8 células iNKT se pueden generar dentro de 18-20 días de cultivo, después de lo cual se pueden utilizar para los ensayos funcionales in vitro, o in vivo experimentos de transferencia en ratones.

Aislamiento de células mononucleares del bazo utilizando un gradiente de densidad tarda aproximadamente 1 hora y se elimina el uso de reactivos necesarios para lisar los glóbulos rojos (GR). Se obtiene un alto rendimiento de células viables utilizando este método y los escombros generados durante el esfuerzo del órgano es eliminado. Típicamente, la frecuencia de células iNKT dentro de la piscina de linfocitos del bazo oscila entre 1 y 5% del total de linfocitos T sin embargo, esto puede variar dependiendo del estado de ...

Aquí presentamos un protocolo adaptado que se puede utilizar para generar un gran número de células T asesinas naturales invariantes murinas a partir del bazo de ratón. El protocolo describe un enfoque mediante el cual las células iNKT esplénicas pueden enriquecerse, aislarse y expandirse in vitro utilizando un número limitado de animales y reactivos.

Un método optimizado para aislar y expandir Invariante Natural Killer células T de ratón Bazo

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

El objetivo general de este procedimiento es amplificar las células T naturales invariantes o INKT, aisladas del bazo de ratón. Esto se logra primero aislado células mononucleares esplénicas, seguido del enriquecimiento de la población de linfocitos positivos para CD5 mediante separación magnética de células. La fracción de células INKT esplénicas se aísla posteriormente mediante clasificación celular activada por fluorescencia.En el paso final, las células INKT ordenadas se siembran para su expansión in vitro. En última instancia, el perfil de citocinas de las células INKT expandidas puede evaluarse mediante ELISA. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, ya que la purificación y expansión de células INKT requiere la combinación de diferentes técnicas que deben realizarse.Este procedimiento será realizado por un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Después de extraer el bazo, transfiera el tejido a un filtro de nylon de 70 micrones y luego use el émbolo de una jeringa de dos mililitros para machacar suavemente el bazo a través del colador hacia un tubo cónico de 50 mililitros, y lave el filtro con cinco mililitros de PBS. A continuación, agregue tres mililitros del medio de carbón a un tubo de 15 mililitros y superponga el gradiente de densidad con los cinco mililitros de suspensión celular.Separar las células por centrifugación y transferir la interfase a un nuevo tubo de 15 mililitros. Luego lavar las células con 10 mililitros de PBS frío y resuspender el precipitado en dos mililitros de tampón fax para enriquecer los linfocitos esplénicos positivos para CD5. Ajustar la dilución celular a 1 × 10⁷ células por 90 microlitros con más tampón fax y añadir 10 microlitros de microesferas magnéticas anti-CD5 a las células.Después de 15 minutos a cuatro grados Celsius, lave las células con cuatro mililitros de tampón fax y re suspenda el precipitado en 500 microlitros de tampón fax fresco. Aísle las células CD cinco positivas mediante separación magnética de células según la recomendación del fabricante. Luego, diluya los linfocitos enriquecidos CD cinco positivos a una vez 10 a la seis células por 20 microlitros de tampón inax que contenga anti CD 16, CD 32 y tetrámero de alfa gals aire CD 1D conjugado con PE a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de 30 minutos, incube las células con los anticuerpos de interés a cuatro grados Celsius en la oscuridad durante otros 30 minutos.Luego lave las células con tampón fax fresco y tiña con 10 microlitros de una solución de trabajo de 20 micromolar de DPI por un vez 10 a la seis células durante cinco minutos. Ahora, adquiera aproximadamente un vez 10 a la cuarta eventos de linfocitos positivos para CD5 enriquecidos en el citómetro de flujo, seleccionando electrónicamente la dispersión hacia adelante con baja células para excluir dobletes y agregados celulares electrónicamente. Excluya las células positivas para DAPI, positivas para CD8 y positivas para CD19 dentro de la población con baja dispersión hacia adelante, y utilice gráficos de área de dispersión lateral y dispersión hacia adelante.Para seleccionar electrónicamente los linfocitos, grafique los tetrámeros de alfa gal SER CD 1D frente a CD tres épsilon y seleccione electrónicamente las células INKT positivas para el tetrámero de alfa gal SER CD 1D y positivas para CD tres épsilon, como se indica. Luego, tras adquirir no más de dos veces 10 a la quinta linfocitos enriquecidos positivos para CD cinco, determine el porcentaje de células INKT positivas para el tetrámero de alfa gal SER CD 1D y positivas para CD tres épsilon presentes en la fracción celular enriquecida. Utilizando esta puerta de clasificación baja, ordene las células INKT positivas para el tetrámero de alfa alser CD 1D y positivas para CD tres épsilon hacia un tubo FACS que contiene un mililitro de suero de feto bovino al final del ordenamiento.Lave las células T NK aisladas del costado del tubo de centrífuga con 10 mililitros de medio RPMI 1640. Luego, centrifugue las células, resuspenda el precipitado en un mililitro de RPMI 1640 y use una alícuota de 40 microlitros de las células para evaluar la pureza de las células ordenadas. Utilizando la misma estrategia de selección.En cuanto al ajuste de los parámetros de clasificación para expandir las células INKT, centrifugar las células y resuspender las células aisladas a una concentración de cinco veces 10 a la quinta células por mililitro en medio RPMI 1640 completo suplementado con IL-2, IL-12 y anti-CD28. A continuación, sembrar las células a una densidad de una vez 10 a la quinta células INKT por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo plano recubierta con anti-CD3 epsilon e incubarlas a 37 grados Celsius en una incubadora de cultivo celular. Después de dos días, transferir las células a una placa fresca de 96 pocillos de fondo plano sin recubrir para su cultivo en condiciones de reposo en RPMI 1640 completo.Medio para otra incubación de dos días. Al cuarto día después de la clasificación, pipetee suavemente el sobrenadante de cada pocillo para desprender las células y reúnalas en un tubo cónico de 15 mililitros. Después de la centrifugación, re suspenda el paladar a cinco veces 10 a la quinta células por mililitro.En medio RPMI 1640 completo suplementado con IL-7, siembre 1 × 10⁵ células por pocillo. En una nueva placa de 96 pocillos de fondo plano, devuelva las células al incubador durante cuatro días, luego transfiéralas a un tubo cónico de 15 mL fresco para centrifugación. Resuspenda el precipitado en medio RPMI 1640 completo que contenga anti-CD28 soluble y siembre las células en una placa de 96 pocillos de fondo plano recubierta con anti-CD3ε, a una densidad de 1 × 10⁵ células por pocillo, y devuelva las células al incubador durante otros tres a cuatro días, del día 11 al 18.Repita el tratamiento con IL-7, anti-CD28 y anti-CD3 epsilon tal como se acaba de demostrar el día 19. Transfiera las células a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugue y re suspenda el precipitado a 5 × 10⁵ células por mililitro en medio RPMI 1640 completo.Luego siembre las células a una concentración de un por diez a la quinta células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo plano y permita que las células reposen durante dos días en el incubador de cultivo celular. La estimulación de las células INKT ordenadas mediante anti-CD3 epsilon inmovilizada en placa en presencia de IL-2, IL-12 y anti-CD28 soluble da como resultado una expansión de aproximadamente tres veces el número de células INKT tras dos días de cultivo. La expansión subsiguiente de las células INKT en presencia de IL-7 provoca un aumento de tres a cuatro veces el número de células INKT presentes al día cuatro de cultivo.Es notable que la repetición de estas condiciones de cultivo puede producir un promedio de siete veces 10 a la séptima células INKT después de dos rondas de expansión, sin pérdida visible de células entre los cambios de medio de cultivo en diferentes días, lo que resulta en una expansión de al menos 70 veces en 18 días. Las células INKT ampliadas adicionalmente, activadas con CD1D recombinante murino inmovilizado en placa y cargado con alfa-alser, producen IL-2, IL-4, IFN-gamma, TNF-alfa e IL-6 a las 48 horas posteriores a la estimulación, demostrando que las células INKT conservan su capacidad para producir citocinas TH1 y TH2 tras la expansión.Al realizar este procedimiento, es importante recordar que la tinción adecuada de las células INKT con cdre cargado con alfa ceramida es esencial para identificar las células INKT mediante citometría de flujo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video describe el enriquecimiento de células T del bazo de un ratón mediante selección negativa utilizando un separador magnético. La técnica consiste en dirigirse a las otras células de la muestra para su agotamiento mediante el uso de anticuerpos o ligandos dirigidos contra antígenos específicos de la superficie celular.

Enriquecimiento de células T: una técnica para aislar células T de una población de células mixtas mediante separación magnética

Este video muestra el aislamiento de linfocitos, incluidas las células asesinas naturales o células NK, del tejido hepático humano para su expansión selectiva. La digestión enzimática y mecánica, seguida de la separación por gradiente de densidad, promueve el aislamiento de linfocitos, incluidas las células NK. Los linfocitos recolectados se pueden utilizar posteriormente para la expansión selectiva de las células NK.

Aislamiento de células asesinas naturales del tejido hepático para la expansión selectiva

Este video describe un protocolo para aislar células T CD8+ específicas de antígenos raros utilizando células presentadoras de antígenos artificiales (aAPCs) basadas en nanopartículas magnéticas funcionalizadas con MHC-Igs cargadas de péptidos antigénicos y anticuerpos anti-CD28. La interacción de las aAPC con los linfocitos T CD8+ que expresan específicamente los receptores de linfocitos T dirigidos a péptidos antigénicos, seguida de su expansión in vitro, da como resultado el enriquecimiento...

Enriquecimiento y expansión basados en nanopartículas de linfocitos T CD8+ específicos de antígenos

Este video muestra la inducción de la enfermedad de injerto contra huésped intestinal, EICH, en un ratón receptor irradiado letalmente utilizando células madre hematopoyéticas alogénicas y linfocitos T aloreactivos esplénicos inductores de EICH. Este protocolo ayuda a establecer un modelo de EICH intestinal aguda grave para comprender el mecanismo de la enfermedad y desarrollar opciones terapéuticas innovadoras.

Inducción de la enfermedad de injerto contra huésped en modelos de ratón mediante trasplante alogénico de médula ósea y células esplénicas

Este video ilustra un método para aislar células T asesinas naturales invariantes, también conocidas como células iNKT. El procedimiento comienza con la inyección de un glicolípido sintético en un ratón para estimular la activación y proliferación de las células iNKT en el bazo. Posteriormente, se preparan suspensiones unicelulares a partir del bazo y se incuban con complejos de reconocimiento de células iNKT marcados con fluoróforos, seguidos de una separación basada en perlas magnéticas, para...

Aislamiento de linfocitos T asesinos naturales invariantes de un modelo de ratón

+ &gt; 'jove_content'Naïve se polarizan en varios subconjuntos dependiendo del entorno en el momento de la activación.  La diferenciación de los linfocitos T CD4+ naïve a varios subconjuntos efectores se puede lograr in vitro mediante la adición de estímulos del receptor de linfocitos T y señales específicas de citocinas.

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Existen distintos subconjuntos de células dendríticas como poblaciones raras en los órganos linfoides y, por lo tanto, son difíciles de aislar en número y pureza suficientes para los experimentos inmunológicos. Aquí describimos un método de alta eficiencia y alto rendimiento para el aislamiento de todos los principales subconjuntos actualmente conocidos de células dendríticas esplénicas de ratón.

Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

Aquí, presentamos un protocolo que describe el trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas y permite evaluaciones repetitivas mini-endoscópica del colon distal in situ para la presencia, características y severidad de inflamación colónica en vivo ratones de intestinal injerto - versus - host disease.

Inducción de Intestinal injerto - versus - host Disease y su evaluación Mini-endoscópica en ratones vivos

Describimos un protocolo rápido y robusto para enriquecer células T asesinas naturales invariantes (iNKT) del bazo de ratón y expandirlas in vitro a números adecuados para estudios in vitro e in vivo.

Purificación y expansión de células T asesinas naturales invariantes de ratón para estudios in vitro e in vivo

Aquí, presentamos un método para expandir el asesino natural de sangre periférica (PBNK), las células NK de los tejidos hepáticos y las células NK del receptor de antígeno quimérico (CAR) derivadas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o sangre del cordón umbilical (CB). Este protocolo demuestra la expansión de las células NK y CAR-NK utilizando células alimentadoras 221-mIL-21, además de la pureza optimizada de las células NK expandidas.

Método de expansión celular Natural Killer (NK) y CAR-NK utilizando línea de células B modificada con IL-21 unida a la membrana

Aprenda a aislar y expandir células iNKT del bazo de ratón mediante separación magnética y citometría de flujo. Este protocolo optimizado maximiza el rendimiento celular para estudios inmunológicos.

Un método optimizado para aislar y expandir Invariante Natural Killer células T de ratón Bazo

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