Un método optimizado para aislar y expandir Invariante Natural Killer células T de ratón Bazo

El objetivo general de este procedimiento es expandirse en variantes de células T o INKT asesinas naturales recolectadas del bazo del ratón. Esto se logra primero aislando las células mononucleares esplénicas, seguido del enriquecimiento de la población de linfocitos CD cinco positivos mediante la separación magnética de las células. A continuación, la fracción de células INKT esplénicas se aísla aún más mediante clasificación de células activadas por fluorescencia.

En el paso final, las células INKT clasificadas se colocan para su expansión in vitro. En última instancia, Eliza puede evaluar el perfil de citocinas de las células INKT expandidas. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, ya que la purificación y expansión de las células INKT requiere la combinación de diferentes técnicas de realización.

Este procedimiento será realizado por un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Después de recolectar el bazo, transfiera el tejido a un filtro de nailon de 70 micras, luego use un émbolo de jeringa de dos mililitros para triturar suavemente el bazo a través del colador en un tubo cónico de 50 mililitros y lave el filtro con cinco mililitros de PBS. A continuación, añada tres mililitros del paquete de carbón a un tubo de 15 mililitros y superponga el gradiente de densidad con los cinco mililitros de suspensión celular.

Separe las celdas por centrifugación y transfiera la interfaz a un nuevo tubo de 15 mililitros. A continuación, lavar las células en 10 mililitros de PBS frío y resuspender el pellet en dos mililitros de tampón de fax para enriquecer para el CD cinco linfocitos esplénicos positivos. Ajuste la dilución de la celda a una vez 10 a la séptima celda por 90 microlitros con más tampón de fax y agregue 10 microlitros de microperlas anti CD cinco a las celdas.

Después de 15 minutos a cuatro grados centígrados, lavar las celdas con cuatro mililitros de tampón de fax y volver a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón de fax nuevo. Aísle las cinco células positivas CD mediante la separación magnética de las células de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. A continuación, diluir el CD enriquecido cinco linfocitos positivos a una vez 10 por las seis células por tampón inax de 20 microlitros que contiene anti CD 16, CD 32 y PE alfa gals conjugado aire CD 1D tetrámero a temperatura ambiente en la oscuridad después de 30 minutos, incubar las células con los anticuerpos de interés a cuatro grados centígrados en la oscuridad durante otros 30 minutos.

A continuación, lavar las células en un tampón de fax nuevo y teñirlas con 10 microlitros de una solución de trabajo de 20 micromolares de DPI por uno por 10 a las seis células durante cinco minutos. A temperatura ambiente, ahora adquieren aproximadamente una vez 10 al cuarto CD enriquecido, cinco eventos de linfocitos positivos en el citómetro de flujo, compuerta electrónicamente en la dispersión hacia adelante con celdas bajas para excluir electrónicamente los dobletes de celdas y agregados. Cierre las celdas positivas CD DAPI, ocho celdas positivas CD 19 positivas dentro de la dispersión directa con baja población y utilice gráficos de dispersión lateral y área de dispersión directa.

Para seleccionar electrónicamente los linfocitos, grafique los tetrámeros alfa gal SER CD 1D por CD tres épsilon y electrónicamente ga el alfa gal ser CD 1D tetrámero positivo CD tres células INKT épsilon positivas como se indica. Luego, adquiriendo no más de dos veces 10 al quinto CD, cinco linfocitos enriquecidos positivos determinan el porcentaje de alfa gal, SER, CD, 1D tetrámero CD, CD, tres células INKT épsilon positivas presentes en la fracción celular enriquecida. Usando este tipo de puerta baja, el alfa alser CD 1D tetrámero positivo CD tres células INKT epsilon positivas en un tubo de fax que contiene un mililitro de suero fetal de ternera al final del tipo.

Enjuague las células NKT aisladas desde el lateral del tubo de fax con 10 mililitros de medio RPMI 1640. A continuación, gire las células, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de RPMI 1640 y utilice una alícuota de 40 microlitros de las células para evaluar la pureza de las células clasificadas. Usando la misma estrategia de compuertas.

En cuanto a la configuración de los parámetros de clasificación para expandir las células INKT, gire hacia abajo las células y vuelva a suspender las células aisladas a cinco veces 10 a la quinta celda por mililitro en un medio RPMI 1640 completo suplementado con IL dos IL 12 y anti CD 28. A continuación, siembre las células de una vez 10 a la quinta célula INKT por pocillo en una placa recubierta de anti CD de tres épsilon de fondo plano de 96 pocillos e incube a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo celular. Después de dos días, transfiera las células a una placa fresca de fondo plano de 96 pocillos sin recubrimiento para el cultivo en condiciones de reposo en RPMI 1640 completo.

Medio para otros dos días de incubación. Al cuarto día después de la clasificación, pipetear suavemente el sobrenadante en cada pocillo para desalojar las células y agruparlas en un tubo cónico de 15 mililitros. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el paladar a cinco veces 10 a la quinta celda por mililitro.

En medio RPMI 16 completo suplementado con IL siete y semilla una vez 10 a la quinta celdas por pocillo. En una nueva placa de 96 pocillos de fondo plano, devuelva las células a la incubadora después de cuatro días, exájelas en un tubo cónico nuevo de 15 mililitros para su centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en un medio RPMI 1640 completo que contenga anti CD 28 soluble y siembre las células en una placa de fondo plano de 96 pocillos recubierta con anti CD tres épsilon a una vez 10 de las quintas celdas por pocillo y devuelva las celdas a la incubadora durante otros tres días, cuatro días, 11 a 18.

Repita el tratamiento con IL seven anti CD 28 y anti CD three epsilon como se acaba de demostrar el día 19. Transfiera las células a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Gírelos hacia abajo y vuelva a suspender el pellet a cinco veces 10 a la quinta celdas por mililitro en RPMI completo 1640.Medio.

A continuación, siembre las células a una vez, de 10 a la quinta célula por pocillo, en una placa de 96 pocillos de fondo plano y deje que las células descansen durante dos días en la incubadora de cultivo celular. La estimulación de células INKT clasificadas con anti CD tres épsilon unidas a placas en presencia de IL, dos IL 12 y anti CD 28 solubles da como resultado una expansión de aproximadamente tres veces los números de INKT después de dos días de cultivo. La expansión posterior de las células INKT en presencia de IL siete da como resultado un aumento de tres a cuatro veces en el número de células INKT presentes en el cuarto día en cultivo.

En particular, la repetición de estas condiciones de cultivo puede producir un promedio de siete veces 10 a la séptima células INKT después de dos rondas de expansión sin ninguna pérdida visible de células entre los cambios en los medios de cultivo en diferentes días, lo que resulta en una expansión de al menos 70 veces en 18 días. Células INKT más expandidas activadas con murina recombinante unida a placas. Las CD 1D cargadas con alfa alser producen IL dos IL, cuatro IFN gamma, TNF alfa e IL seis a las 48 horas después de la estimulación, lo que demuestra que las células INKT conservan su capacidad para producir citocinas TH uno y TH dos después de la expansión.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la tinción adecuada de las células INKT con cdre cargado de alfa ceramida es esencial para identificar las células INKT durante la citometría de flujo. Seguro.