Mapeo espacio-temporal de la motilidad en

Los objetivos generales para crear un mapa espacio-temporal completo de intestinos ex vivo son estudiar la respuesta al contenido luminal mediante la observación del movimiento detallado de la pared intestinal en todo un segmento. La principal ventaja de esta técnica es que permite registrar y comparar en el espacio y en el tiempo la actividad en diferentes regiones del mismo segmento de tejido, lo que posibilita la identificación de patrones complejos de motilidad más allá de una simple contracción o relajación. Aunque este método puede proporcionar información sobre la motilidad intestinal normal, también puede aplicarse para identificar los efectos de diversas drogas y agentes intraluminales, como nutrientes o patrones de motilidad.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque, al principio, los mapas espacio-temporales pueden ser difíciles de interpretar. Pero con el tiempo, se pueden distinguir patrones complejos de un solo vistazo. Para comenzar, retire el colon o intestino de un cuy que haya sido sacrificado.

Fíjelo en solución de Krebs tibia. En la bandeja de disección, elimine todo el contenido intraluminal perfundiendo suavemente tampón de Krebs a través de la luz. Utilice una jeringa con una cánula de extremo romo y evite distender excesivamente el segmento de colon durante la perfusión.

A continuación, sujete dos segmentos de tubo de polietileno de dos o tres milímetros de longitud a dos catéteres de tubo de vidrio pulidos con llama, que tienen tres milímetros de diámetro. En una bandeja de disección calentada, introduzca un catéter en el extremo oral de la preparación de tejido y ate una sutura detrás del pequeño trozo de tubo, rodeando el catéter con un nudo quirúrgico. Intente retirar suavemente el catéter para asegurarse de que el nudo esté bien ajustado.

El pequeño trozo de tubo de polietileno evita el deslizamiento de la sutura. Repita este procedimiento utilizando el otro catéter en el extremo aboral del tejido. A continuación, retire el mesenterio de la preparación del tejido.

Con ambos catéteres asegurados, transfiera el preparado desde la bandeja de disección a uno de los baños de órganos GIMM y coloque el tejido con el extremo oral orientado lejos del usuario. A continuación, asegure los catéteres de tubo de vidrio al baño de órganos utilizando arcilla de modelar, fijando el extremo del tubo de vidrio al costado del baño, o utilizando pinzas de plástico para sujetar los catéteres a los postes situados encima del baño, los cuales se usan para fijar las cámaras. Ahora, conecte un trozo de tubo de cinco centímetros a cada extremo libre de los catéteres.

Para el catéter oral, conecte el tramo corto de tubo a un tramo más largo de tubo con una conexión de bloqueo tipo luer. Luego conecte la jeringa de cinco mililitros al adaptador de bloqueo tipo luer. Esto se utilizará para inyectar tampón en la preparación del tejido.

Para el catéter aboral, utilice el tubo para dirigir el flujo luminal hacia un recipiente de recolección. Ahora, usando la jeringa acoplada, lave lentamente el tejido con tampón de Krebs calentado para asegurar un buen flujo, tal como se observa por la salida de líquido del catéter aboral. Proceda calibrando el sistema de grabación de video mientras el tejido se equilibra durante 30 minutos.

Calibre la altura de colocación de la cámara, la configuración de video para el brillo y el contraste, y la distancia horizontal utilizando el software GIMM. Haga clic en la pestaña de experimento para la cámara que se va a calibrar. Luego, en el menú Archivo, haga clic en Calibrar.

Una vez que el video aparezca en la ventana de la estación de calibración, coloque la cámara a una altura en la que la imagen incluya los extremos de los catéteres insertados en la luz colónica. Luego, calibre la distancia horizontal que se ve en la imagen en pantalla utilizando la calcomanía de regla translúcida fijada a cada baño. En la misma ventana de la estación de calibración, ajuste las guías verticales rojas para que estén separadas 10 milímetros.

Luego, escriba esta distancia en la ventana del cursor de distancia y haga clic en el botón Cal. A continuación, ajuste los controles deslizantes de ganancia, brillo y obturación dentro de la ventana de la estación de calibración para que el segmento de tejido aparezca como una silueta oscura sobre un fondo claro. Luego, ajuste los controles de enfoque y diafragma en la cámara misma para mejorar aún más la imagen.

Para completar la calibración de la imagen, haga clic en Guardar seguido de Sí en la pantalla emergente. Finalmente, haga clic en Salir. Después del período de equilibración de media hora, comience el experimento.

Comience nombrando el ensayo experimental. A continuación, ocluya la luz del tubo que sobresale del catéter aboral con la pinza de plástico. Luego inyecte aproximadamente 7 mililitros de tampón de Krebs en la luz colónica proximal.

El objetivo es proporcionar una distensión suficiente para iniciar contracciones propulsivas. Una vez que el segmento esté distendido por el líquido luminal, comience la grabación de video. En el software, haga doble clic en el ensayo nombrado para abrir la vista de la cámara experimental y luego haga clic en el interruptor de conmutación para activarlo y ver el campo de la cámara.

Recopile una longitud predeterminada de datos de video. Al final de este ensayo inicial de distensión controlada, afloje o retire la pinza para permitir que el segmento de tejido impulse el líquido distensor fuera de la luz. Deje que el tejido se reequilibre durante 10 a 20 minutos y luego repita el procedimiento utilizando el tratamiento.

Una única preparación de tejido puede someterse a hasta cinco tratamientos de 10 minutos con los períodos de reposo adecuados entre las pruebas. Tenga en cuenta la descamación de la mucosa, que indica degradación del tejido. Para analizar el registro, haga doble clic en el nombre de un ensayo específico para abrir la ventana de análisis y construir un mapa ST.

Dentro del área de reproducción del video, ajuste los controles deslizantes de contraste y brillo para hacer que la imagen sea adecuada para el análisis. Cree un silueta negra del tejido sobre un fondo claro. A continuación, configure las guías rojas horizontales y verticales dentro de la ventana de imagen del video para aislar la región del tejido a analizar y eliminar las áreas que contienen artefactos.

Luego, configure el tiempo para el análisis. Haga clic en el botón verde A para seleccionar el punto de inicio y en el botón amarillo B para el punto de finalización cuando el control deslizante de tiempo esté en las posiciones correctas. A continuación, seleccione la pestaña Análisis de motor para abrir la ventana del mapa ST y, luego, haga clic en el botón del cronómetro.

Comience la generación del mapa ST haciendo clic en el cursor de mira dentro de la silueta negra del tejido. La generación del mapa puede tardar unos minutos en completarse. Una vez construido el mapa ST, seleccione la función de zoom para ampliar la imagen.

Luego, seleccione la opción de color para ver la imagen a color en lugar de escala de grises. A continuación, seleccione activar para que el cursor pueda utilizarse para seleccionar el píxel para el análisis. Para el tejido asociado con los píxeles seleccionados, el cambio en el diámetro luminal a lo largo del tiempo se analiza y muestra como un trazado del diámetro del grano a la derecha del mapa ST.

Después de los análisis, seleccione Salir. Ahora exporte el mapa ST para otros fines seleccionando Archivo y luego Exportar datos, y a continuación Archivo de metarchivos. Asigne un nombre al archivo y guárdelo como un archivo emf haciendo clic en Guardar.

Los mapas generados por esta técnica muestran los cambios en el diámetro luminal del tejido tanto en distancia como en el tiempo. La distancia horizontal se representa en el eje X, y el tiempo en el eje Y, con el tiempo inicial en la parte superior y el tiempo final en la parte inferior. En la esquina superior derecha se encuentra una leyenda que muestra los diámetros luminos mínimos y máximos, así como la escala para los ejes X e Y.

Por lo tanto, diferentes tonos de píxeles dentro de la imagen en escala de grises corresponden a diferentes diámetros luminos. Los píxeles más oscuros corresponden a diámetros más anchos, y los píxeles más claros corresponden a diámetros más pequeños. Las ondas contráctiles del músculo circular aparecerán como regiones de mayor claridad en los píxeles debido a la reducción del diámetro luminoso.

En contraste, la distensión luminal debida a la relajación del músculo circular o a un bolo grande de líquido se muestra con píxeles más oscuros. Además de las ondas de contracción propagada, también puede visualizarse el patrón de motilidad de mezcla conocido como segmentación. Ocurren pequeñas contracciones estacionarias en diferentes áreas al mismo tiempo.

Con el tiempo, estas pequeñas contracciones se desplazan hacia el extremo anal aboral. El mesenterio que permanece en el tejido puede causar artefactos, que se observan como líneas verticales oscuras. El movimiento horizontal de estas líneas verticales artificiales puede utilizarse para determinar el momento del movimiento del músculo longitudinal.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar segmentos intestinales para la grabación de video y de cómo generar la representación subsiguiente de la motilidad intestinal como mapas espacio-temporales. Siguiendo este procedimiento, se pueden añadir diferentes nutrientes a la solución luminal para determinar cómo los componentes naturales inducen patrones específicos de motilidad con el fin de facilitar la digestión y la absorción. El uso de agonistas o antagonistas farmacológicos específicos de receptores para agentes humorales neurales puede emplearse para determinar los mecanismos mediante los cuales se inicia y propaga la motilidad.

Esta técnica podría ayudar a producir datos útiles para determinar compuestos útiles para el tratamiento de trastornos de la motilidad.