Circunscrita capsular del infarto de modelado mediante técnica photothrombotic
2 de junio de 2016
Este manuscrito describe una técnica de modelado de infarto capsular. Aquí hemos utilizado una técnica photothrombotic modificado con baja intensidad de la luz después de la cartografía de destino antes de la cirugía. Usando esta técnica, hemos creado un modelo de infarto capsular circunscrita con deficiencia motora persistente.
El objetivo general de esta técnica es crear un modelo de infarto capsular circunscrito con una afectación motora persistente mediante la técnica fototrombótica. Antes de crear el infarto capsular, es necesario identificar el área de la extremidad anterior en la cápsula interna mediante la introducción de un virus adenoasociado que expresa GFP en el área de la extremidad anterior de la corteza motora. Comience colocando una rata anestesiada en un marco estereotáxico.
Luego afeitar la cabeza de la rata y esterilizar el cuero cabelludo con alcohol al 70% y una solución de povidona y yodo. Inyecte clorhidrato de lidocaína al 2% debajo del cuero cabelludo en el área de la incisión prevista en el cuero cabelludo para reducir el dolor intraoperatorio. Aplique ungüento oftálmico para prevenir la sequedad de los ojos.
Y coloque una cortina estéril sobre el animal. Después de hacer una incisión en la línea media de dos centímetros en el cuero cabelludo, coloque el brazo estereotáxico para identificar el área de la extremidad anterior de la corteza motora de acuerdo con las coordenadas estereotáxicas. Taladre un orificio de entrada en esta posición.
Mueva la aguja hasta el orificio perforado y baje la aguja un milímetro a través de la duramadre y dentro de la corteza motora. Utilice una microbomba de alta precisión para inyectar lentamente un microlitro de virus. Deje la aguja en su lugar durante 10 minutos más para evitar el reflujo por el tracto de la aguja.
Una vez transcurridos 10 minutos, retire lentamente la aguja. Después de limpiar el sitio operatorio con irrigación salina, asegure la herida con sutura de nailon 3-0. A continuación, libere a la rata del marco estereotáxico y transfiérala a una cámara de recuperación para su monitorización.
Administrar analgésico para el control del dolor postoperatorio. Después de dos o tres semanas, sacrifique la rata de acuerdo con los métodos aprobados y corte el cerebro crioprotegido. Después de la tinción para GFP, observe los axones transducidos por AAV-GFP en la cápsula interna con un microscopio fluorescente.
Compare las ubicaciones de los axones transducidos como se ven en la imagen fluorescente con el atlas del cerebro de rata para determinar con precisión las coordenadas estereotáxicas de los axones transducidos. Para preparar la interfaz neuronal óptica, primero use un taladro de corte para cortar aproximadamente cuatro centímetros de una aguja espinal de calibre 27 con un estilete en su interior. A continuación, retire 10 centímetros de la cubierta de una fibra óptica.
Inserte la pieza de fibra óptica sin camisa en un tubo de metal. Y sujete el tubo alrededor de la fibra. A continuación, utilice un prensador para sujetar la mitad inferior del tubo metálico dos veces.
El tubo de metal llena el espacio entre la fibra óptica y el centro de la aguja espinal. Aplique epoxi curable por calor sobre la fibra óptica. Aplique epoxi adicional al espacio vacío en el cubo.
E inserte la fibra óptica en la aguja espinal. Cura el epoxi durante 20 minutos a 100 grados centígrados para una fijación estable. Una vez curado, corte la fibra óptica que sobresale de la aguja espinal y luego use láminas de diamante para pulir la fibra óptica en la punta de la aguja espinal.
Por último, conecte la parte del conector FCPC del cable de conexión al acoplador del sistema láser verde. Luego, use un medidor digital de energía y potencia óptica para medir la intensidad de la luz desde la punta de la fibra óptica para garantizar una emisión precisa de luz. Coloque una almohadilla térmica debajo del cuerpo del animal para mantener la temperatura corporal a 37,5 grados centígrados durante la cirugía.
Comience por anestesiar y preparar a la rata para la cirugía como antes. Después de hacer una incisión de dos centímetros en la línea media, ajuste la altura de la pinza nasal hasta que el Bregma y el Lambda estén alineados al mismo nivel. La alineación correcta es fundamental para apuntar correctamente a la cápsula interna.
Coloque el brazo estereotáxico para localizar el sitio de la fototrombosis. A continuación, perfora un agujero de dos milímetros en este punto. A continuación, pula y limpia la punta de fibra óptica de la ONI, luego fíjala al marco estereotáxico sin doblarla.
Revise la punta del ONI para asegurarse de que esté limpio e intacto. Mida la intensidad del láser desde la punta de la fibra óptica antes de la inserción de la interfaz óptica hasta el sitio objetivo del cerebro de la rata. Ajuste la intensidad del láser a 3,5 milivatios en la punta de la fibra óptica.
Ahora, baje el ONI en el área objetivo de la cápsula interna usando la coordenada dorsoventral determinada en la primera sección del protocolo. Luego, inyecte dos miligramos por kilogramo de Rose Bengal a través de la vena de la cola y luego inicie un temporizador de cuenta regresiva configurado en un minuto. Cuando haya transcurrido el minuto, encienda el láser verde de 532 nanómetros durante 90 segundos para crear el infarto.
Después de una radiación, retire suavemente el ONI del cerebro. Después de limpiar el sitio operatorio, asegure la herida con una sutura de nailon 3-0. A continuación, retira la rata del marco estereotáxico y transfiérela a una cámara de recuperación.
Esta imagen muestra la extensión de las lesiones de infarto a través de diferentes intensidades de luz láser de dos milivatios a cinco milivatios dos semanas después de la lesión fototrombótica. Las flechas indican la lesión del infarto. Se considera que la intensidad de la luz óptica está entre tres milivatios y cuatro milivatios en este entorno experimental.
Las dos imágenes siguientes muestran el aspecto microscópico del infarto capsular tres semanas después de la fototrombosis. En esta sección coronal del cerebro de rata, las puntas de flecha indican el tracto de la aguja que contiene la fibra óptica en el tálamo y hasta la cápsula interna. Estas secciones teñidas en serie muestran la extensión de la lesión del infarto en la cápsula interna.
Las flechas indican la lesión del infarto.
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Visión general
Este manuscrito describe una técnica de modelado de infarto capsular utilizando una técnica fototrombótica modificada. Este enfoque permite la creación de un modelo de infarto capsular circunscrito que resulta en deterioro motor persistente.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Neurobiología
- Deterioro motor
Antecedentes
- Los infartos capsulars están asociados con déficits motores.
- Las técnicas fototrombóticas se utilizan para inducir lesiones cerebrales localizadas.
- Entender los mecanismos del deterioro motor es crucial para desarrollar estrategias terapéuticas.
- El mapeo de objetivos es esencial para la creación precisa del modelo.
Propósito del estudio
- Desarrollar un modelo confiable de infarto capsular.
- Investigar los efectos de los infartos capsulars en la función motora.
- Utilizar una técnica fototrombótica modificada para un objetivo preciso.
Métodos utilizados
- Identificación del área de la extremidad anterior en la cápsula interna utilizando virus adeno-asociado que expresa GFP.
- Preparación de la rata mediante anestesia y colocación de marco estereotáxico.
- Esterilización del cuero cabelludo y preparación de la incisión.
- Inyección de lidocaína para minimizar el dolor intraoperatorio.
Resultados principales
- Creación exitosa de un modelo de infarto capsular circunscrito.
- Demostración de deterioro motor persistente post-infarto.
- Validación de la técnica fototrombótica modificada.
- Establecimiento de un método reproducible para estudios futuros.
Conclusiones
- La técnica fototrombótica modificada es efectiva para modelar infartos capsulars.
- Este modelo puede ser utilizado para estudiar deterioros motores e intervenciones potenciales.
- Se necesita más investigación para explorar los mecanismos subyacentes de los déficits motores.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This photothrombotic technique enables precise modeling of white matter stroke by selectively targeting the internal capsule while sparing adjacent gray matter. The resulting circumscribed capsular infarct produces persistent motor deficits, providing a disease-relevant system for mechanistic de-risking of neurotherapeutic candidates. The model supports target validation and preclinical assessment of interventions aimed at white matter pathology, addressing a critical gap in stroke research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to white matter stroke pathophysiology.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system for functional target validation in motor circuitry.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking infarct location to persistent motor impairment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable lesion volumes via optical intensity titration for dose-response assessment.
- Operational Value: Delivers highly replicable infarct models with consistent motor deficit readouts.
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening in neuroprotection or neurorepair.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models white matter stroke at behavioral, circuit, and cellular levels for preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions based on lesion specificity and functional outcome correlation.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of infarct extent with motor deficit severity for predictive biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through preclinical efficacy testing, enabling iterative refinement of neurotherapeutic strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of white matter vulnerability and circuit-specific motor pathway disruption.
- Screening: Enables assay standardization through precise lesion control and quantitative motor deficit scoring.
- Analytics: Provides volumetric infarct measurements and behavioral readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity via persistent motor deficit phenotyping.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of neuroprotective and rehabilitative compounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement through selective white matter infarct modeling.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via laser intensity calibration and stereotaxic targeting.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk by enabling early mechanistic de-risking of white matter pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on ability to mitigate persistent motor deficits in a validated model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral vector delivery, stereotaxic surgery, and optical neural interface fabrication.
- Depends on precision instrumentation including stereotaxic frames, microinjectors, and calibrated laser systems.
- Necessitates cross-team standardization for viral titer consistency, optical fiber preparation, and postoperative monitoring.
- Adaptation considerations include species-specific stereotaxic coordinates and optical properties of gray versus white matter.
- Practical limitations include surgical complexity and the need for postoperative validation via histology and behavior.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Identification of the Forelimb Area in the Internal Capsule Using AAV-GFP
3:09
Construction of the Optical Neural Interface
4:41
Photothrombotic Infarct of the Internal Capsule
6:44
Results: Microscopic Appearance of Capsular Infarct after Photothrombosis
7:38
Conclusion
