Name: La bioluminiscencia de imágenes de un Modelo inmunocompetentes Animal para Glioblastoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprende a monitorizar el crecimiento tumoral intracraneal mediante imagen bioluminiscente in vivo utilizando células GL261 modificadas con luciferasa. Este método permite estudiar la inmunología tumoral y evaluar respuestas terapéuticas en modelos murinos inmunocompetentes.

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Nos gustaría agradecer a Rajwant Kaur por su asistencia técnica. Nos gustaría agradecer a Maxwell Tom por su ayuda con la preparación del lentivirus. Este trabajo fue apoyado por la Cátedra Reza y Georgianna Khatib en Cirugía de Tumores de Base de Cráneo en UCSF, y el Profesor y Presidente Michael J. Marchese en la Universidad Northwestern.

Todos los procedimientos descritos a continuación se han revisado y aprobado por el Institutional Animal Uso y Comité de Cuidado de la Universidad Northwestern y se han realizado en condiciones estériles. 1. Modificación de las células GL261 con el reportero de luciferasa de luciérnaga Expresando NOTA: los vectores lentivirales basados ​​en VIH-1 expresan la luciferasa de luciérnaga (Fluc) bajo el control del promotor de virus de enfoque de formación de bazo (SFFV). El gen indicador óptico ha sido clonado en el plásmido vector pHRSIN-CSGW-dlNotI. <ol><li> Mantener 293-T células en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y GL261 células en medio RPMI suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 95 % de aire y 5% de dióxido de carbono (CO 2). </li><li> Cuando el cultivo de células 293-T alcanza el 80% de confluencia en un matraz T-75, se lavan las células una vez con phsolución salina tamponada con osphate (PBS) sin Ca2 + y Mg2 +, incubar las células con 3 ml de tripsina (0,05%) a 37 ° C durante 5 min, se tritura con una pipeta de 5 ml manteniendo el matraz ligeramente inclinada y recoger todas las células desde el fondo del matraz. Transferir el 3 ml de suspensión celular tripsinizada en un tubo cónico de 15 ml, y añadir 7 ml de medio RPMI carne (un total de 10 ml de la suspensión celular). </li><li> Mezclar la suspensión de células bien con una pipeta de 5 ml. Tomar 100 l de la suspensión celular del tubo y contar el número de las células utilizando un hemocitómetro. Para ello, se mezclan 100 l de la suspensión celular con 300 l de solución de azul de tripano e inserte 2 l de la mezcla en un hemocitómetro. Cuente el número de las células sin tinción con azul de cuatro vistas separadas bajo un microscopio. Promedio, el número de células de cada punto de vista, ya que este número representa 10 4 células / ml. </li><li> Mientras tanto, centrifugar el tubo que contiene la suspensión celular a 300 g durante 7 min. Aspirar los medios de comunicación y resuspender los sedimentos celulares con medio RPMI fresco para hacer una suspensión celular GL261 a una densidad de 1,0 x 10 6 / ml. Semilla de 2,5 x 10 6 células GL261 con 2,5 ml de medio RPMI en un matraz T-175 con 27,5 ml de DMEM (día 1). </li><li> Después de 24 horas, sustituya el medio con 20 ml de DMEM fresco (día 2). </li><li> Para producir el vector lentiviral, mezclar el reactivo de transfección 54 l con 2 ml de DMEM libre de suero durante 5 min. Añadir 3 g de gag-pol, 3 g de virus de la estomatitis vesicular G envolvente (VSV-G), y 4,5 g de Fluc (pSIN-Fluc) en el DMEM con reactivo de transfección, y se incuba durante 20 min a TA. Caída de toda la mezcla de ADN en 293-T matraz (T-175) y se incuba a 37 ° C en una cámara humidificada que contiene 95% de aire y 5% de CO 2 durante 48 horas (día 2). </li><li> Añadir 10 ml de DMEM fresco a las 24 horas después de la transfección (volumen total de 293-T medio de cultivo celular debe ser de aproximadamente 30 ml) (día 3). </li><li> Para dividir las células GL261 en unPlaca de 24 pocillos, se lavan las células una vez con PBS sin Ca2 + y Mg2 +, incubar las células con 5 ml de tripsina (0,05%) a 37 ° C durante 5 min, se tritura con una pipeta de 5 ml manteniendo el matraz ligeramente inclinado , recoger todas las células de la parte inferior del frasco, y contar las células a través de hemocitómetro como en el paso 1.2. Mientras tanto, Centrifugar el tubo a 300 xg durante 7 min. Aspirar los medios de comunicación y resuspender los sedimentos celulares con medio RPMI fresco para hacer una suspensión celular GL261 a una densidad de 2,5 x 10 4 / ml. Semilla de 2,5 x 10 4 células GL261 con 1 ml de medio RPMI en una placa de 24 pocillos (día 3). </li><li> Recoger 30 ml del sobrenadante con 10 ml lentiviral pipeta del frasco 293-T (T-175) a las 48 h después de la transfección y transferir el sobrenadante a 50 ml de tubo cónico. Aspirar el sobrenadante 30 ml lentiviral a través de una jeringa de 50 ml, a través de un filtro de jeringa de 0,22 m, y alícuota del sobrenadante viral en alícuotas de 1 ml (día 4). </li><li> Reemplace las 1 ml de RMedio PMI en placa celular GL261 (24 pocillos) con 1 ml del sobrenadante lentiviral y se incuba a 37 ° C en una cámara humidificada (día 4). </li><li> Después de 48 h de la infección lentiviral, sustituir el medio con 1 ml de RPMI fresco (día 6). </li><li> Después de 24 horas, repita la infección lentiviral de las células GL261 (día 7). </li><li> Después de la hora de la infección lentiviral 2º 48, sustituir el medio con 1 ml de RPMI (día 9). </li><li> Continuar para crecer las células GL261 luciferasa modificado (que se denominará como células GL261.luc) y expandir el cultivo celular a un matraz T-75. </li><li> Cuando el cultivo celular GL261.luc llega a 70% de confluencia en un matraz T-75, recoger las células por tripsinización y contar por hemocitómetro como en el paso 1.2. Placa de la célula GL261.luc en una placa de 24 pocillos a densidades que se gradúan (1,0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4, 2.5 x 10 4 células / pocillo) y incubar a 37 ° C en un humidicámara cado que contiene 95% de aire y 5% de CO 2 durante 3 horas. </li><li> Medir la actividad luciferasa celular en relación con luciferasa U-87 MG (U87.luc) células por medio de imágenes de bioluminiscencia (Figura 1) modificada. <ol><li> Inicie el software de imagen (haga clic en el icono en el escritorio) e inicializar el sistema de imagen (haga click en &quot;Initialize&quot;). Inicialización comenzará automáticamente y puede tardar varios minutos para que el sistema de facturación y la cámara enfriar a -90 ° C. </li><li> Añadir 25 l de luciferina (sal de potasio de D-luciferina, 150 mg / kg) en cada pocillo. </li><li> Se incuban las células con luciferina durante 1 min a TA y la imagen de la placa durante 10 s. Para configurar el sistema de imagen, seleccione &quot;luminiscentes&quot;, &quot;10 segundos&quot; el tiempo de exposición, y hurgar en la basura &quot;Medium&quot;. Coloque la placa de 24 pocillos en la estación de imagen y haga clic en el botón &quot;Adquirir&quot; para comenzar a imagen. </li><li> Después de que la imagen se adquirió con éxito, usted verá una ventana de la imagen y la herramienta paLette en la pantalla. Haga clic en &quot;ROI (regiones de interés) Herramientas&quot; y seleccione 6 x 4 desde el icono de hendidura. Crear 6 x 4 ranuras para cubrir el área de la señal en la imagen de la placa de 24 pocillos y haga clic en la pestaña mediciones (icono de lápiz). Observar una ventana con una tabla de mediciones de ROI como unidad de fotones por segundo por estereorradián por cm cuadrado (fotones / s / sr / cm 2). </li><li> Las células utilizan U87.luc, modificados previamente con el mismo lentivirus utilizado aquí para la modificación GL261 11, como control para evaluar la actividad de luciferasa en las células transducidas GL261.luc. </li></ol></li></ol> 2. In Vitro Ensayo de proliferación <ol><li> Cuando los cultivos de células GL261 y GL261.luc alcanzan 70% de confluencia en un matraz T-75, cosechar las dos líneas celulares mediante tripsinización y contar como en el paso 1.2, y células de la placa en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1500 células en 80 l de medio RPMI por pocillo usando una pipeta multicanal para minimizar el tiempo y el error de pipeteo. Seed cada línea celular en 20 pozos totales. Para limitar la evaporación en los pocillos pobladas por células, llenar pocillos vacíos con 100 l de medio RPMI fresco. </li><li> Evaluar la proliferación celular utilizando un ensayo de proliferación celular colorimétrico. Aquí se utiliza el ensayo de proliferación celular MTS. Usando una pipeta multicanal, añadir 20 l de reactivo MTS a cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene células. </li><li> Incubar la placa a 37 ° C en una cámara húmeda que contiene 95% de aire y 5% de CO 2 durante 3 horas. Medir la absorbancia a 490 nm usando un lector de microplacas. Esto se repite en los días 1, 2, 4, y 7, después de la siembra. Para normalizar los valores de absorbancia, los valores de cada día están divididas por las lecturas correspondientes obtenidos en el día 1 (Figura 2). </li></ol> 3. Implantación de la célula tumoral Nota: Autoclave todo el equipo. Preparar área quirúrgica por pulverización de una (solución de clorhexidina al 2%) desinfectantes y cubrir con absorbencamisetas oscuras. Con el fin de mantener las condiciones estériles, use guantes quirúrgicos estériles durante la cirugía, y dividir el área quirúrgica en dos áreas de la cinta de color. Área 1 tiene la etiqueta &quot;limpio&quot; y contiene suministros esterilizados; Zona 2 tiene la etiqueta &quot;sucio&quot; y contiene materiales utilizados. <ol><li> Antes de la cirugía animal, preparar una suspensión de células para la inyección intracraneal. Cosecha de células confluentes un 70% T-75 matraz por tripsinización y contar las células a través de hemocitómetro como en el paso 1.2, y hacer una suspensión celular a una densidad de 1,0 x 10 5 células / l en solución salina equilibrada de Hanks sin Ca 2+ y Mg 2+ (HBSS). </li><li> Anestesiar ratones con inyección intraperitoneal de 200 l que contiene mezcla de 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina en 0.9% de solución salina. Para confirmar la anestesia adecuada, apriete la punta del ratón. Si el ratón es completamente bajo la anestesia, el ratón no responde al estímulo. </li><li> Administrar 0,1 mg / kg de buprenorfina por vía subcutánea para aliviar el dolor post-operatorio. </li><li> Afeitarse la parte superior de la cabeza de los animales utilizando tijeras y limpio, con un aplicador de algodón-tip humedecido en solución de clorhexidina al 2%. Aplicar pomada para los ojos para mantener una lubricación adecuada durante la cirugía. </li><li> Haga una incisión sagital aproximadamente 1 cm de longitud sobre el hueso parietooccipital utilizando un bisturí estéril. Para visualizar el bregma, limpie la superficie del cráneo con un aplicador de algodón de punta empapado en una solución de peróxido de hidrógeno al 3%. </li><li> Perforar el cráneo con una aguja de 25 G estéril para hacer un pequeño agujero de 3 mm a la derecha de la bregma y justo detrás de la sutura coronal. </li><li> Para asegurarse de que el sitio de inyección intracraneal es a una profundidad de 3 mm en el cráneo, corte 3 mm fuera de la punta de una punta de pipeta 20 l con unas tijeras e insertar una jeringa en la punta de pipeta. </li><li> Inserte la jeringa perpendicular al agujero creado previamente, e inyectar lentamente el SUS células tumoralespensión que contiene 3,0 x 10 5 células en 3 l HBSS, durante un periodo de 1 min. Deje la aguja en su lugar por un minuto, y luego tire lentamente la aguja. </li><li> Limpie la calavera con aplicador de algodón-tip humedecido en peróxido de hidrógeno al 3% y la solución de clorhexidina al 2%. Seque la superficie del cráneo con el aplicador de algodón de punta. Cortar la cera de hueso estéril aproximadamente 3 mm 3 en tamaño y colocar la cera de hueso en el lado extremo del aplicador de algodón de punta. Aplique la cera de hueso para cubrir el agujero con el aplicador de algodón de punta. </li><li> Dibuje la cada lado del cuero cabelludo a más de cráneo con unas pinzas y grapas para cerrar la herida. Limpie la herida con una punta de algodón humedecido en solución de clorhexidina al 2%. </li><li> Supervisar todos los ratones después de la operación hasta que se convierten ambulante y mantener la actividad normal. Por lo general, el tiempo de recuperación es de aproximadamente 30 min. No devuelva los ratones a la jaula con otros animales hasta que se hayan recuperado totalmente de la anestesia. </li></ol><ol><li> Rocíe una generosa cantidad de desinfectante (solución de cloruro de dimetil amonio 0,05%) en una toalla de papel limpia. Utilice la toalla de papel desinfectante empapados para limpiar a fondo la hoja de negro, conos de ojiva y el divisor dentro de la cámara de imágenes donde los animales estarán en contacto con el dispositivo. Limpie completamente todas las superficies con una toalla de papel limpia y seca. Repita esto una vez más y esperar 5 minutos. </li><li> Inicialice la estación de imagen como en el paso 1.14.1. </li><li> Anestesiar al ratón con una mezcla de 300 l que contiene 200 l de ketamina / xilazina y 100 l de luciferina (sal de potasio de D-luciferina, 150 mg / kg) por inyección intraperitoneal. </li><li> Espere 10 minutos después de la inyección y confirmar si los ratones son completamente bajo anestesia pellizcando la cola. Para configurar el sistema de imagen, seleccione &quot;luminiscentes&quot;, tiempo de exposición &quot;Auto&quot;, y hurgar en la basura &quot;Medium&quot;. Coloca los ratones en el Stati imágenesy haga clic en el botón &quot;Adquirir&quot; para comenzar a imagen. Asegúrese de que el tiempo después de la inyección es consistente con cada sesión de imágenes. </li><li> Después de que la imagen se adquirió con éxito, debería aparecer una ventana de imagen y la paleta de herramientas. Haga clic en &quot;Herramientas de ROI&quot; y seleccione &quot;auto&quot; en el icono de círculo. Para definir regiones de interés, rodear el área de la señal en la imagen, y luego tomar medidas del ROI como unidad de fotones / seg / sr / cm2. </li><li> Tome los ratones fuera de la cámara de formación de imágenes y supervisar los ratones hasta que se convierten ambulante y retener la actividad normal. Normalmente el tiempo de recuperación es de aproximadamente 15 min. No devuelva los ratones a la jaula con otros animales hasta que se hayan recuperado totalmente de la anestesia. </li><li> Monitorear el crecimiento del tumor por imágenes de bioluminiscencia dos veces a la semana hasta que los animales presentan los siguientes síntomas: pérdida de peso (pérdida de más de 20% con respecto al peso antes de la implantación), inapetencia (anorexia completa para 24 hr), y la falta de purposefu sostenidal respuesta a estímulos suaves (débil intento de levantarse), momento en el que deben ser sacrificados. La eutanasia a los animales con estos síntomas utilizando una cámara de CO 2 seguido por dislocación cervical. <ol><li> Coloque los ratones en la cámara de la eutanasia (hacerlo no estaba abarrotada de la cámara) y entrada de comprimidos de CO2 durante 5-6 min. Observe que todos los animales son la inconsciencia y no respira después de aproximadamente 5 minutos. </li><li> Tome los ratones fuera de la cámara. Asegúrese de que el corazón no está latiendo al sentir el pecho entre el pulgar y el índice y compruebe que no hay reflejo de parpadeo. </li><li> Restringir el ratón en una posición boca abajo sobre una superficie plana y captar la parte posterior del cuello en la base del cráneo con una mano y base de la cola con el pulgar y el dedo índice de la otra mano. </li><li> Restringir la cabeza y tirar rápidamente la cola hacia atrás. Asegúrese de que el cráneo está separada de la primera vértebra cervical con el dedo pulgar y el dedo índice. </li></ol></li><li> Normalos valores de luminiscencia alize para cada día contra las lecturas correspondientes obtenidos en el primer día de imágenes de bioluminiscencia como en el paso 2.3 (Figura 3A). </li><li> Para el análisis estadístico, generar curvas de supervivencia utilizando el estimador de Kaplan-Meier 12 y comparar las diferencias entre las curvas de supervivencia mediante una prueba de log-rank 13. </li></ol>

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</ol>

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Células de glioma murino GL261, cuando se implanta intracranealmente en inmunocompetentes singénica C57BL / 6 ratones, ofrecen varias ventajas en comparación con los modelos de xenoinjerto animales de glioma humano. Muchos de los tumores xenoinjertados crecer como lesiones encapsuladas que no recapitulan con precisión la enfermedad humana invasiva. Por el contrario, tumor GL261 no sólo demuestra la invasión en el cerebro adyacente, sino también la neovascularización, mitosis y necrosis profunda 7. Lo más importante en el estudio de la inmunología tumoral o estrategias inmunoterapéuticas 15, 16, el ratón C57BL / 6 retiene un sistema inmunológico intacto 8. Estudios anteriores han demostrado sólida expresión de la citoquina inmunosupresora TGF-β y tumores intracraneales contener células T reguladoras inmunosupresores similares a glioblastoma humano 9, 10. La técnica simple descrito aquí permite la expresión estable de la luciferasa por las células GL261. Recientemente hemos informado de similar in vitro e in vivo el crecimiento de las células GL261.luc comparación con las células GL261, además de las características histológicas del tumor y similares de células inmunes infiltrarse 17. Células expresan de forma estable GL261.luc luciferasa que cataliza la oxidación de la luciferina sustrato convertir la energía química a los fotones de luz y por lo tanto detectable. Luciferina puede administrarse con seguridad a animales y cruza la barrera hematoencefálica después de la inyección intraperitoneal o intravenosa. En los pequeños animales de investigación tales como ratones, la bioluminiscencia se puede detectar externamente de una manera no invasiva 11. Por lo tanto, el crecimiento del tumor puede evaluarse en serie sin la necesidad de sacrificio de animales o costoso IRM o TC. Los pasos críticos en el protocolo implican, no sólo la transducción lentiviral, sino también la verificación de la expresión estable de luciferasa in vitro antes de comenzar cualquier experimentos in vivo. Pérdida de transducción puede REQUIre infección lentivirus repetición. Introducción de un gen de resistencia a los antibióticos en el vector de expresión también se podría utilizar para seleccionar para la expresión de luciferasa. Se requiere una técnica meticulosa para la implantación intracraneal para colocar de manera reproducible un número constante de células en una localización anatómica precisa para permitir la comparación de los diferentes grupos de tratamiento. Una diferencia importante entre el presente estudio y en estudios previos de células que expresan luciferasa GL261 es el uso de una técnica de manos libres para la implantación de células en comparación con el uso de un marco estereotáctico 18. Hemos demostrado anteriormente los resultados de implantación consistentes con la técnica de manos libres 19. La ventaja de la técnica de mano libre es la capacidad de realizar análisis de alto rendimiento de diferentes agentes de tratamiento. En nuestras manos, podemos implantar unos 60 animales en la 1 h. Después de dominar la técnica, las futuras aplicaciones de la técnica son ilimitadas. Como demonstr GL261ates elevados mitosis y rápido crecimiento del tumor similar al glioblastoma humano, tratamientos anti-proliferativos pueden ser evaluados. Del mismo modo, las terapias anti-invasivos y anti-angiogénicos pueden ser utilizados como los tumores GL261 son invasivos y angiogénico. Se debe tener precaución cuando se evalúa el efecto de los agentes quimioterapéuticos dirigidos a blancos humanos. En comparación con estudios previos utilizando xenoinjertos de glioblastoma humano que expresan luciferasa 20, esto sería considerado una limitación de nuestro modelo. Además, el efecto de las estrategias inmunoterapéuticas del crecimiento del tumor puede ser estudiada en el modelo xenoinjertado GL261.

El glioma maligno es el tumor cerebral humano más común y letal. Incluso cuando se trata con resección quirúrgica máxima, radioterapia y quimioterapia, la mediana de supervivencia sigue siendo de 15 a 20 meses en los principales centros de referencia de tumores cerebrales1, 2, 3. La forma más agresiva de glioma maligno, el glioblastoma, se caracteriza por figuras mitóticas, neovascularización, invasión al cerebro adyacente y necrosis pseudoempalizada. Los xenoinjertos ortotópicos de tumores cerebrales que utilizan células tumorales cerebrales humanas han cumplido una función esencial en la investigación neurooncológica y han facilitado la traslación preclínica para las pruebas de nuevos agentes, antes de su entrada en ensayos clínicos en humanos. Mientras que la mayoría de los modelos de xenoinjertos humanos recapitulan muchas características de la enfermedad humana, una limitación fundamental de todos los sistemas de modelos de xenoinjertos basados en humanos es el uso de animales inmunodeficientes4. 
La ausencia de una respuesta intacta del huésped modifica claramente el crecimiento tumoral tanto en términos de morfología tumoral como de eficiencia del injerto. Si bien ciertos supuestos son aceptables en la interpretación de los resultados de los modelos xenoinjertados, es difícil llegar a conclusiones relevantes en el área de la evaluación terapéutica. Es probable que ciertas características biológicas fundamentales sean similares en animales inmunodeficientes e inmunocompetentes, pero otras, como la inflamación asociada a tumores, la invasión de tejidos y la respuesta a las lesiones, son probablemente muy diferentes. Por el contrario, GL261 es una línea celular de glioma murino inducida químicamente que recapitula con precisión el glioma cuando se implanta en el cerebro de ratones singénicos C57BL/6 inmunocompetentes5. Al igual que en la enfermedad humana, el crecimiento rápido y reproducible del tumor intracraneal conduce a síntomas neurológicos y a la muerte de los animales6-10. 
El crecimiento del tumor subcutáneo se puede medir directamente. El crecimiento tumoral intracraneal solo se puede medir con sacrificios de animales o con costosos estudios de imagen. La expresión estable de la enzima luciferasa permite la obtención de imágenes de bioluminiscencia intracraneal no invasiva y rentable11. La bioluminiscencia de las células GL261 transfectadas con luciferasa se correlaciona bien con el crecimiento tumoral intracraneal. Recientemente hemos comparado directamente GL261 con células GL261 modificadas con luciferasa y no hemos demostrado diferencias en el crecimiento e invasión in vitro, el perfil inmunológico de citocinas, la supervivencia in vivo de ratones portadores de C57BL/6 con tumores intracraneales o el infiltrado de células inmunitarias. Esta técnica es aplicable a los estudios preclínicos de glioblastoma que implican la monitorización no invasiva del crecimiento tumoral.

<table><tbody><tr><td>D-Luciferina, Sal de Potasio Oro</td><td>Biotecnología</td><td>LUCK-100</td><td>Tienda lejos de la luz</td></tr><tr><td>Living Image Software</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>Contacto para Cotizar</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Xenogen Lumina</td><td>Caliper Ciencias de la Vida</td><td>Contactar para Cotizar</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>24-well; Cultivo de tejidos estándar; Falcon</td><td></td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Synergy 2 Lector multimodo</td><td>BioTek</td><td>Contacto para cotizar</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>96 pocillos Placa de ensayo, placa negra, fondo transparente con tapa, cultivo de tejidos Tretaed</td><td>Coster</td><td>3603</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Ketaset</td><td>Pfizer</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td>Sustancia de control</td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>23076-35-9</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>28G Aguja (con jeringa)&nbsp;</td><td>Pescador&nbsp; &nbsp;</td><td>22-004-270</td><td>AKA Jeringa de insulina</td></tr><tr><td>2% Clorhexidina</td><td>Fisher</td><td>NC9756995</td><td>AKA " Nolvasan"</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno al 3% Fisher</td><td></td><td>H312P-4</td><td>Tienda lejos de la luz</td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Cardinal Health</td><td>1272830</td><td>AKA " Lágrimas de Akwa"</td></tr><tr><td>25G 1 1/2 aguja</td><td>BD Becton Dickinson</td><td>305127</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Bisturíes desechables</td><td>Feather</td><td>2975</td><td>No. 21</td></tr><tr><td>Gasa</td><td>Fisher</td><td>22028563</td><td>Autoclave antes de usar</td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Grapadora de piel, Grapas, Removedor</td><td>Stoelting</td><td>59020</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>PDI Almohadillas de preparación Alchol</td><td>Fisher</td><td>23-501-711</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Pinzas para heridas Paquete de 100</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>203 1000</td><td>Autoclave antes de usar</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Aplicador de pinzas para heridas</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>204 1000</td><td>Autoclave antes de usar</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Removedor de pinzas para heridas</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>205 1000</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Hisopo de punta redonda de un solo extremo con mango de madera</td><td>Qosmedix</td><td>10107</td><td>Autoclave antes de usar</td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks sin Ca2+ y Mg2+ (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Hamilton Hamilton</td><td>80300</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>FuGENE 6 Reactivo de transfección</td><td>Promega</td><td>E2961</td><td>ninguno</td></tr><tr><td>Cera ósea</td><td>Aparato Harvard 599864</td><td></td><td>ninguno</td></tr></tbody></table>

la bioluminiscencia de imágenes de un modelo inmunocompetentes animal para glioblastoma

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

A diferencia de los modelos animales de xenoinjerto de glioma humano comúnmente reportados, los xenoinjertos de glioma murino GL261 recapitulan casi todas las características clínicas e histopatológicas relevantes de la enfermedad humana. Cuando las células GL261 se implantan intracranealmente en ratones C57BL/6 singénicos, el modelo tiene la ventaja añadida de mantener un microambiente inmunitario intacto. La expresión estable de luciferasa en células GL261 permite la monitorización no invasiva y rentable de la bioluminiscencia del crecimiento tumoral intracraneal. Recientemente hemos demostrado que la expresión de luciferasa en células GL261 no afecta a las propiedades de crecimiento tumoral, a la expresión de citocinas inmunomoduladoras de las células tumorales, a la infiltración de células inmunitarias en el tumor ni a la supervivencia general de los animales portadores del tumor intracraneal. Por lo tanto, parece que el modelo de glioma luciferasa GL261 puede ser útil en el estudio de nuevas modalidades quimioterapéuticas e inmunoterapéuticas. En este trabajo se describe la técnica para generar la expresión estable de luciferasa en células GL261 y cómo estudiar el crecimiento in vitro e in vivo de las células tumorales mediante imágenes de bioluminiscencia.

GL261 células fueron infectadas con lentivirus que contiene luciferasa como se describió anteriormente en los pasos 1. In vitro imágenes de bioluminiscencia demuestra robusta expresión de luciferasa similar a los niveles en el control positivo U87.luc línea celular de glioblastoma humano (Figura 1). Como era de esperar, las células no infectadas GL261 demuestran ninguna expresión fondo luciferasa. Este paso es simple pero fundamental para llevar a cabo antes de que otros estudios utilizando la línea celular infectado para confirmar la expresión de luciferasa estable. La expresión de luciferasa después de la implantación intracraneal. Antes de la implantación intracraneal, se demostró ninguna diferencia en la tasa de crecimiento in vitro de GL261.luc comparación con las células GL261 (Figura 2). Para el crecimiento intracraneal y el análisis de supervivencia, las células se inyectan en el brains de C57BL / 6 ratones según el protocolo el paso 3. El crecimiento del tumor en ratones portadores de tumores GL261.luc se analizó en serie para formación de imágenes de bioluminiscencia utilizando protocolo de paso 4 y demostraron el crecimiento del tumor detectable (Figura 3A). Los ratones portadores de tumores GL261.luc rápida y consistentemente se convirtieron moribundo y se sacrificaron. Es importante destacar que no hay diferencia en la supervivencia global entre GL261.luc y tumor GL261 teniendo animales (Figura 3B). In vivo, por tanto, imágenes de bioluminiscencia se puede utilizar para monitorizar la respuesta a los tratamientos experimentales de glioblastoma. El crecimiento del tumor fiable rápida y corta supervivencia global pueden producir grandes cantidades de datos en un período relativamente corto de tiempo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig1.jpg" /> Figura 1. La actividad de luciferasa en las células GL261.luc U87.luc, las células GL261.luc y GL261 (control negativo) se sembraron a densidades de.1.0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4, y 2,5 x 10 4 células / pocillo de izquierda a derecha. Luminiscencia (fotones / s / sr / cm 2) se midió por la estación de imágenes lumina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53287/53287fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig2.jpg" /> Figura 2. La expresión de luciferasa no afecta a la proliferación celular GL261. GL261.luc células no causan una diferencia en la proliferación como se demuestra por ensayo de proliferación celular MTS. El gráfico muestra veces mayor, con relación al día 1, como se determina comparando el valor medio de absorbancia (media ± SEM) en el punto de tiempo thespecified al valor normal en el día 1 (valores de t-test no apareados para las comparacionesentre cada línea celular: P = 0,7796) 14. Las barras de error representan los valores medios (media ± SEM) a partir de muestras por cuadruplicado en cada día. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53287/53287fig2large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig3.jpg" /> Figura 3. La expresión de luciferasa dosis no afecta sobre el crecimiento in vivo del tumor y la supervivencia animal. (A) el seguimiento bioluminiscencia demuestra el crecimiento progresivo del tumor intracraneal GL261.luc en ratones C57BL / 6. (B) el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier demuestra ninguna diferencia en la supervivencia general para los ratones implantados intracranealmente con células GL261 (línea continua) o GL261.luc (Linea discontinua).Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

GL261 proporcionan un modelo animal inmunocompetente útil de glioblastoma. Los objetivos de este protocolo son demostrar las técnicas adecuadas para monitorizar el crecimiento tumoral intracraneal mediante imágenes de bioluminiscencia in vivo, y verificar la utilidad de las células GL261 modificadas con luciferasa para el estudio de la inmunología tumoral y los enfoques inmunoterapéuticos para el tratamiento del glioblastoma.

La bioluminiscencia de imágenes de un Modelo inmunocompetentes Animal para Glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and ...

El objetivo general de este protocolo es demostrar las técnicas adecuadas para monitorear el crecimiento de células tumorales y tumores intracraneales mediante imágenes de bioluminiscencia in vivo, a fin de verificar la utilidad de la modificación con luciferasa de las células tumorales murinas GL261. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de la inmunología tumoral y los enfoques inmunoterapéuticos, como si la modificación por estrés afecta la proliferación de las células GL261 y su crecimiento in vivo.La principal ventaja de esta técnica es que la modificación de las células tumorales GL261 con luciferasa facilita el monitoreo no invasivo de su crecimiento y respuesta al tratamiento in situ. Cuando el cultivo celular GL261 luciferasa alcance una confluencia del 70 % en un frasco T75, recolecte las células mediante tripsinización. Cuente las células y luego transfiéralas a una placa de 24 pocillos con densidades graduadas.Después de tres horas en una incubadora de cultivo celular, abra el software de imagen bioluminiscente e inicialice el sistema de imágenes. Cuando la cámara haya alcanzado menos 90 grados Celsius, configure el software de imágenes en modalidad luminiscente con un tiempo de exposición de 10 segundos y una binarización media. Luego, incube las células con 25 microlitros de luciferina por pocillo durante un minuto a temperatura ambiente y coloque la placa en la estación de imágenes.Seleccione Adquirir para comenzar la adquisición de imágenes. Cuando se haya obtenido una imagen con éxito, aparecerá una ventana de imagen y una paleta de herramientas. Haga clic en las herramientas de Regiones de Interés y seleccione 6 por 4 en el icono de rendija.Cubra el área de la señal con una rejilla de 6 por 4 ranuras y seleccione el icono de lápiz en la pestaña Mediciones. Aparecerá una ventana con una tabla de mediciones de la región de interés en unidades de fotones por segundo por estereorradián por centímetro cuadrado. Para realizar un ensayo de proliferación in vitro, recoja los cultivos celulares tal como se acaba de demostrar cuando alcancen una confluencia del 70 %.Y use una pipeta multicanal para colocar las células tumorales en 20 pocillos de una placa de 96 pocillos, con 1,5 veces 10 a la 3ª células por 80 microlitros de medio RPMI por pocillo. Para limitar la evaporación de los cultivos celulares, agregue 100 microlitros de medio RPMI fresco a los pocillos vacíos circundantes. Luego, para evaluar la proliferación celular, añada 20 microlitros de reactivo MTS a cada pocillo que contenga células.Y incubar la placa a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Después de tres horas, utilizar un lector de microplacas para medir la absorbancia a 490 nanómetros. Para normalizar los valores de absorbancia, dividir los valores de cada día por las lecturas correspondientes obtenidas el día uno.El día del implante, suspenda uno por diez a la quinta potencia células por microlitro en HBSS sin calcio y magnesio a partir de un cultivo de células tumorales al 70 % de confluencia. A continuación, tras confirmar el nivel adecuado de sedación mediante el pellizco del dedo del pie, afeite la parte superior de la cabeza de cada animal experimental. Con una punta de algodón, limpie cada cráneo con clorhexidina al 2 %.Luego, aplique lubricante en los ojos de cada ratón. Ahora, use un escalpelo estéril para realizar una incisión sagital de aproximadamente 1 centímetro de longitud sobre el hueso parietal occipital del primer animal. Y limpie nuevamente la superficie del cráneo con peróxido de hidrógeno al 3%, observando la bregma aparente.Luego, utilizando una aguja estéril de 25 gauge, perfore un orificio de 3 milímetros en el cráneo a la derecha del bregma y justo detrás de la sutura coronal. Para asegurar la profundidad adecuada de inyección, use tijeras para cortar 3 milímetros del extremo puntiagudo de una punta de pipeta de 20 microlitros y deslice una jeringa Hamilton de 26 gauge dentro de la punta hasta que 3 milímetros de la aguja sobresalgan del extremo de la punta. Introduzca la aguja en el orificio del cráneo e inyecte lentamente 3 microlitros de 3 veces 10 a la 5ª de las células tumorales durante un período de un minuto.Deje la aguja en su lugar durante un minuto más y luego retírela lentamente. Trate el hueso expuesto con peróxido de hidrógeno al 3% y solución de clorhexidina al 2%. A continuación, después de secar el cráneo con un aplicador nuevo con punta de algodón, corte un trozo de cera ósea estéril de 3 milímetros cuadrados y fije la cera al extremo desnudo de un aplicador con punta de algodón.Cubra el sitio de inyección con cera ósea. Luego use pinzas para acomodar cada lado del cuero cabelludo sobre la cera. Tras cerrar la herida y administrar la analgesia postoperatoria adecuada, repita el procedimiento para cada animal experimental.Para obtener imágenes del crecimiento del tumor intracraneal, primero inicialice la estación de imágenes como se acaba de demostrar. A continuación, después de confirmar el nivel adecuado de sedación mediante el pellizco de la cola, configure los parámetros del sistema de imágenes como se acaba de demostrar. Con la excepción de seleccionar Automático para el tiempo de exposición.Cuando el sistema de imagen esté listo, coloque los ratones en la estación de imagen y seleccione Adquirir para obtener imágenes de la expresión de luciferasa. Una vez que la imagen se haya adquirido con éxito, seleccione la Herramienta de Región de Interés de la paleta de herramientas y Auto del icono de círculo. Dibuje un círculo alrededor de las áreas de señal para definir las regiones de interés y luego obtenga las mediciones de las regiones en unidades de fotones por segundo, por estereorradián por centímetro cuadrado.Finalmente, retire los ratones de la cámara de imagen y supervise a los animales con tumores hasta que se recuperen completamente. La imagen de bioluminiscencia in vitro de células GL261 infectadas con lentivirus que contienen luciferasa muestra una expresión robusta de luciferasa similar a los niveles de luciferasa expresados por una línea celular de control positivo de glioblastoma humano U87MG que expresa luciferasa. Como era de esperar, las células GL261 no infectadas no muestran expresión de luciferasa de fondo.Antes del implante intracraneal, no se observa ninguna diferencia en las tasas de crecimiento in vitro de las líneas celulares GL261 luciferasa y GL261. Como demuestra la imagenología seriada de bioluminiscencia en animales con tumores intracraneales, las células tumorales que expresan luciferasa GL261 también exhiben una tasa de crecimiento rápida y constante in vivo, sin diferencias significativas en las tasas de supervivencia entre los grupos experimentales con tumores observadas. Una vez dominada, esta técnica puede utilizarse para obtener imágenes de hasta 25 ratones por hora si se realiza adecuadamente.Después de su desarrollo, esta técnica mejora la capacidad de la imagenología de bioluminiscencia para monitorear de manera útil el crecimiento del tumor GL261 in vivo, impulsando así la investigación de las respuestas inmunoterapéuticas en modelos de ratones inmunocompetentes.

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Investigación

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Medicina

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La bioluminiscencia de imágenes de un Modelo inmunocompetentes Animal para Glioblastoma

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