Eyeblink Condicionamiento clásico bigote-señalado en la cabeza de ratones fijo

El objetivo general de este protocolo es utilizar los avances genéticos en ratones, y nuestra comprensión del sistema de bigotes, para investigar las bases neurobiológicas del condicionamiento del parpadeo, un paradigma traducible para estudiar el aprendizaje y la memoria. Este método puede ayudar a responder preguntas mecanicistas en el aprendizaje y la memoria mediante el uso de imágenes de calcio y electrofisiología en ratones manipulados genéticamente, al tiempo que estimula bigotes específicos durante el acondicionamiento. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de asegurar las cabezas de los ratones mientras se minimiza el estrés, al permitir que los ratones deambulen a su propio ritmo en una cinta de correr cilíndrica.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia posibles tratamientos para los problemas de memoria, incluidos los asociados con el envejecimiento normal y la enfermedad de Alzheimer. La preparación del cilindro y el sistema de estimulación de bigotes se tratan en el protocolo de texto. Esta sección cubre la preparación del tocado.

La tira del tocado es una tira de siete agujeros impresa en 3D modelada a partir de la tira de nailon de la serie Amphenol 221 que ya no se fabrica comercialmente. De la pieza impresa en 3D, golpee el primer orificio de la tira para obtener un tornillo de máquina de 0-80 por una pulgada y deje un orificio vacío después del primer orificio. A continuación, con un tornillo de banco, coloque cinco alfileres chapados en oro en los cinco agujeros restantes.

Empuja los alfileres a través de los agujeros más estrechos del plástico. A continuación, con un decapante térmico, retire medio centímetro de recubrimiento de poliimida. Luego, suelde el extremo pelado a una de las clavijas donde la clavija tiene una abertura.

Corta el alambre soldado a entre seis y siete milímetros y pela unos dos milímetros del alambre. Ahora, repita este proceso para conectar cuatro cables en total a los cinco pines. Los dos primeros conectamientos registrarán las respuestas de EMG de los párpados, mientras que los dos segundos proporcionarán estimulación eléctrica a la región periorbitaria.

Al quinto pin, suelde un cable de acero inoxidable de cinco centímetros sin aislamiento para que sirva como tierra eléctrica. Después de realizar todas las conexiones, revise cada una de ellas con un multímetro para asegurar su continuidad eléctrica. Comience con un animal completamente anestesiado, confirmado por un pellizco en el dedo del pie.

Inyectar una dosis de clorhidrato de buprenorfina como analgésico. A continuación, aplique una pequeña cantidad de ungüento oftálmico en las córneas y afeite la parte superior de la cabeza del animal. A continuación, asegure la cabeza del animal a un marco estereotáxico y desinfecte el cuero cabelludo con tres exfoliantes alternos de povidona yodada y alcohol.

Con una hoja de bisturí número 10 o 15, haga una incisión a lo largo de la línea media del cuero cabelludo, exponiendo el cráneo desde la parte frontal de los ojos hasta más allá del hueso interparietal. Retraiga los colgajos de la piel con seis microclips, exponiendo la mayor parte posible del cráneo, incluidos los lados y la espalda. A continuación, utiliza el bisturí para raspar el periostio del cráneo.

A continuación, limpie la parte superior del cráneo con peróxido de hidrógeno al 3% tres veces. Una vez que el cráneo se haya secado, perfore dos agujeros con una fresa de cono invertido de tamaño 34, teniendo cuidado de no dañar el cerebro. Coloque un orificio delante de bregma, y coloque el otro orificio delante de lambda, a la izquierda de la línea media cuando acondicionen el ojo derecho, o viceversa.

Estos agujeros deben perforarse con cuidado para que encajen en los tornillos, y se debe hacer un gran esfuerzo para no dañar el cerebro. En los agujeros, coloque tornillos para las conexiones eléctricas. Cada vuelta completa bajará el tornillo 0,28 milímetros, por lo que dos vueltas completas son suficientes.

A continuación, crea varias pequeñas divinidades en el cráneo para aumentar la superficie del cemento. A partir del cabezal completo, enrolle el cable de tierra en una configuración en forma de ocho alrededor de los dos tornillos. Deje un poco de holgura en el cable de tierra para que el casco pueda colocarse correctamente.

Ahora, aplique cemento de cementación en frío. Cubre el cráneo y los tornillos generosamente y deja que el cemento se seque. Una vez que el cemento esté seco, coloque el casco verticalmente, con los alfileres levantados por encima del cráneo.

Asegure el casco con un soporte unido a un brazo desde el marco. El soporte debe tener cinco casquillos chapados en oro para aceptar las clavijas del tocado. Coloque los dos cables EMG en la muscular orbicular de los ojos, por encima de la cuenca del ojo.

A continuación, coloque los dos cables estimulantes. Coloque los extremos pelados debajo de la piel de dos a cuatro milímetros directamente caudal al ojo. No dejes que sus extremos se toquen entre sí.

Si los alambres son tan largos que podrían arañar el ojo del animal, recortarlos o doblarlos hacia atrás. Algunos cables desnudos deben permanecer expuestos. Ahora, cementa la base de los alambres al cráneo con un poco más de cemento cementante y deja que se seque.

Utilice aproximadamente la mitad del volumen utilizado anteriormente. Para continuar, retire los microclips y vuelva a colocar la piel. Deje que la piel se asiente naturalmente para evitar tensiones en la piel que distorsionarían el párpado, inhibirían el parpadeo y, por lo tanto, arruinarían el experimento.

Una vez que la piel esté asentada, retire el soporte del casco y selle el área expuesta con cemento dental. Evite gotear cemento en los ojos o en los alfileres del tocado. A continuación, utilice un bastoncillo de algodón humedecido con disolvente de cemento dental para alisar y manipular el cemento parcialmente curado según sea necesario.

Una vez que el cemento se haya secado por completo, retire al animal del marco estereotáxico y permita que se recupere en una superficie cálida antes de devolverlo a su jaula de origen. Comience a habituar a los ratones después de que hayan tenido al menos cinco días de tiempo de recuperación. Para asegurar al ratón, sujétalo brevemente por la cola para pellizcarlo detrás de los hombros.

A continuación, levanta el ratón por debajo del abdomen y el torso. A continuación, conecte un conector al casco y gire el tornillo de bloqueo. Luego, coloque el mouse suavemente sobre el cilindro y manténgalo quieto mientras usa dos tornillos para sujetar el conector a las barras sobre el cilindro.

A continuación, suelte el ratón. En las dos primeras sesiones, deje que el ratón se habitúe al cilindro durante el mismo tiempo que una sesión de acondicionamiento. Durante la habituación, registre la frecuencia de parpadeo espontáneo.

Además, preexponga a los ratones al estimulador de vibración de bigotes sin aplicar estimulación eléctrica. Con el sistema piezoeléctrico cerca del lado acondicionado, deslice los dientes del peine sobre los bigotes individuales. Selecciona los mismos bigotes para cada sesión.

A continuación, proceda con el entrenamiento de condicionamiento clásico tal como se presenta en el texto. Ratones machos C57 Black 6J de ocho a diez semanas de edad fueron entrenados con condicionamiento de parpadeo en la cinta de correr cilíndrica fijada a la cabeza. Se tomaron grabaciones EMG de cada ensayo.

Los EMG se rectificaron e integraron con una constante de tiempo de 10 milisegundos, y luego se promediaron en todos los ensayos. La evolución de las respuestas condicionadas a lo largo de 10 sesiones de entrenamiento muestra que gradualmente la respuesta se hizo más grande en amplitud y la latencia de respuesta se hizo más corta. Esta evolución no se observa en las respuestas de los ratones pseudocondicionados, donde los estímulos se presentan en orden aleatorio.

La evolución de las respuestas condicionadas bien sincronizadas y, por lo tanto, bien aprendidas, también se puede ver en los histogramas del tiempo hasta el pico de la respuesta después del inicio de la CS. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar el tocado, implantar quirúrgicamente el tocado en un mouse y colocar el mouse en la cinta de correr cilíndrica, para el acondicionamiento de parpadeo fijo en la cabeza. Sus ratones deben exhibir una buena curva de aprendizaje a lo largo de los días a medida que adquieren el acondicionamiento.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una hora si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe permanecer atento para observar cualquier angustia de los animales. Se deben tomar las medidas adecuadas para minimizar el estrés de los animales.