La cuantificación de la intra-peritoneal del cáncer ovárico Metástasis

El objetivo general de este experimento es determinar la carga tumoral relativa de la metástasis del cáncer de ovario intraperitoneal en un modelo murino de xenoinjerto ortotópico singénico. Este nuevo método para obtener imágenes y cuantificar la carga tumoral relativa puede ayudarnos a responder preguntas clave en la regulación de la metástasis del cáncer de ovario. La ventaja fundamental de esta técnica es que, al desmezclar los espectros fluorescentes, se elimina la autofluorescencia tisular de las imágenes, lo que permite medir la carga tumoral relativa estandarizada.

Esta técnica aporta información sobre la metástasis del cáncer de ovario humano con implicaciones para el seguimiento de la eficacia de los tratamientos. La demostración visual de este método es fundamental porque estamos acoplando una técnica de imagen robusta con un procedimiento analítico para extraer datos cuantitativos de las imágenes. La demostración del procedimiento estará hoy a cargo de Yueying Liu, Gerente del Programa de Laboratorio del Stack Lab.

Después de 10 semanas de crecimiento de células tumorales, coloque el cuerpo de cada ratón anestesiado en un sistema de imágenes ópticas para animales pequeños, uno a la vez. Escanee todos los ratones de la cohorte en cada punto de tiempo. Para observar las células tumorales marcadas con fluorescencia, ejecute una adquisición multiespectral para recopilar un total de cinco imágenes.

Seleccione una exposición estándar de 15 segundos, agrupación de dos en dos, un campo de visión de 16 centímetros y un número F de 1,1. A continuación, adquiera una imagen de reflectancia de todo el animal utilizando luz blanca de un filtro de excitación abierto, un filtro de emisión abierto, una exposición estándar de 0,2 segundos con agrupación de dos por dos y un campo de visión de 16 centímetros, con un número F de 2,8. Después de la eutanasia, use tijeras de disección puntiagudas para cortar la piel anteriormente a lo largo de la línea media ventral del ratón, desde la parte superior de los muslos hasta la parte inferior de la caja torácica.

Separe suavemente la piel del tejido peritoneal, asegurándose de no perforar la pared peritoneal. Luego corte lateralmente, tanto a lo largo de la parte inferior de la caja torácica como en la parte superior de los muslos, para crear dos colgajos de piel. Coloque el ratón sobre su lado ventral en el escáner, de modo que la cavidad peritoneal quede hacia abajo con los colgajos de piel abiertos.

Escanee el ratón con sus órganos in situ, utilizando los mismos parámetros que se utilizaron anteriormente para el ratón vivo. Ahora, continúe diseccionando el ratón extrayendo el hígado, el epiplón, el páncreas, el estómago, el diafragma y el intestino delgado y grueso utilizando técnicas estándar. Además, extirpa el peritoneo izquierdo y derecho, los ovarios, los riñones, el mesenterio y, por último, la almohadilla de grasa.

Observe, enumere y registre cada uno de los tumores visibles en los órganos. Use un calibrador para medir el diámetro de cada tumor. Designa los tumores que tienen menos de dos milímetros de diámetro como pequeños, entre dos y cinco milímetros como medianos y mayores de cinco milímetros como grandes.

A continuación, coloque los órganos en la plantilla de escaneo de órganos, que se encuentra en la Figura Cuatro del protocolo de texto adjunto, y utilícela para organizar la ubicación de cada órgano durante la próxima exploración. Escanee cada lámina de órganos utilizando el sistema óptico de imágenes de animales pequeños y los parámetros que se utilizaron anteriormente.

Después de la exploración, coloque los órganos en formaldehído al 10% y procéselos para la histología utilizando técnicas estándar. Para reducir la cantidad de fluorescencia automática en cada escaneo multiespectral, primero cargue el archivo espectral de proteína fluorescente roja in vivo seguido del archivo rojo de piso automático in vivo en la ventana de imágenes sin mezclar y seleccione desmezclar. A continuación, exporte los archivos punto bip en un formato punto tif sin escala de 16 bits y cárguelos en la imagen J, yendo a archivo, abrir y seleccionando el archivo punto tif de 16 bits correcto.

A continuación, vaya al menú de la imagen y seleccione ajustar, luego contraste de brillo y establezca el valor mínimo mostrado en cero y el valor máximo mostrado en más 35353. Luego, en el menú de imagen nuevamente, vaya a buscar tablas y seleccione rojo activo. Varios modelos animales requerirán diferentes niveles de brillo, pero es importante mantener el brillo constante a lo largo de un estudio determinado.

Con la herramienta de selección a mano alzada, dibuje una selección de región de interés de forma libre alrededor de cada órgano. La región de interés de la forma libre debe acercarse a los bordes del órgano. A continuación, escriba control y M para utilizar la herramienta de medición para calcular el área de superficie de cada órgano.

Registre estos datos en una hoja de cálculo. Con la región de interés que se dibujó alrededor de cada órgano, haga clic con el botón derecho y seleccione duplicar para incluir solo el órgano. Luego, en la imagen, vaya a ajustar, luego umbral, y establezca el nivel de umbral inferior en más 1, 200 y el nivel de umbral superior en más 1, 700.

Además, verifique el fondo oscuro y luego seleccione Aceptar. Esto seleccionará solo las regiones fluorescentes más brillantes. Es posible que las imágenes requieran la manipulación manual de los controles deslizantes de umbral en la imagen J para que se seleccionen las áreas previamente más brillantes para el paso de análisis, como se muestra arriba.

Los diferentes modelos de enfermedad requerirán diferentes restricciones de umbral, pero es importante mantener los niveles de umbral consistentes a lo largo de un estudio determinado. En Analizar, seleccione analizar partículas y cambie el tamaño del píxel al cuadrado de 10 a infinito. Elija mostrar contornos y active la opción Mostrar solo resultados y, a continuación, haga clic en Aceptar.

Esto medirá tanto las áreas como las densidades integradas brutas de las regiones brillantes consideradas tumores. Registre los valores del área de superficie y la densidad integrada bruta de cada selección de tumores juntos en la misma hoja de cálculo que contiene las áreas de superficie de los órganos. A continuación, en Analizar, seleccione herramientas y vaya a la barra de calibración.

Agregue una barra de escala de calibración a las imágenes de los órganos. Los montajes pueden contener un mayor o menor número de órganos, según lo dicte un estudio determinado. A continuación, en archivo, vaya a guardar como y guarde el montaje como un punto tif y un punto jpeg.

A continuación, abra el archivo jpeg de puntos de los órganos y vaya al menú de inserción para añadir un cuadro de texto a cada imagen. Agregue etiquetas de órganos creando un cuadro de texto debajo de cada una de las tres filas de órganos. Abra cada uno de los archivos tif de puntos de 16 bits de los escaneos de cuerpo completo en la imagen J en orden del número del mouse.

Luego, vaya al menú de la imagen y seleccione ajustar y luego contraste de brillo. Establezca el valor mínimo mostrado en cero y el valor máximo mostrado en más 35353. A continuación, vuelva al menú de la imagen, busque tablas y, a continuación, seleccione rojo activo.

Una vez que se haya completado, guarde el montaje como un archivo punto tif y un archivo jpeg de punto. La línea celular de cáncer de ovario murino ID8 que se inyecta en los ratones 10 semanas antes de la obtención de imágenes emite fluorescencia en el canal rojo y continúa haciéndolo durante todo el crecimiento. La obtención de imágenes en vivo mediante un sistema óptico de imágenes para animales pequeños es capaz de ver las células ID8 en expansión en el ratón y proporciona un enfoque más preciso que simplemente pesar al ratón para evaluar la carga tumoral.

Después de la eutanasia y la extirpación de la capa ventral de la piel, los órganos intactos se pueden ver con más detalle. Sin embargo, los órganos individuales colocados en la plantilla de exploración de órganos muestran claramente la carga tumoral en cada órgano. La carga tumoral en el epiplón y el páncreas, los ovarios y el mesenterio del ratón que se muestra a la izquierda es mucho mayor que la de los mismos órganos en el ratón que se muestra a la derecha.

La observación de la carga tumoral diferencial se confirma cuantitativamente tanto en términos de área de servicio tumoral como de intensidad de la señal tumoral. Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para obtener imágenes de hasta 18 ratones vivos por hora. La disección y la obtención de imágenes ex vivo de órganos individuales tardan aproximadamente 20 minutos por muestra.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la resonancia magnética cuantitativa para abordar hipótesis como el impacto de la obesidad en la metástasis del cáncer de ovario, como se muestra en nuestro artículo de investigación sobre el cáncer de 2015.