Evaluación de pulmón metástasis en el ratón mamarias modelos tumorales mediante PCR cuantitativa en tiempo real

El objetivo general de este procedimiento es detectar la cantidad de un ARNm específico de las células tumorales en el pulmón, como método para analizar la metástasis. La principal ventaja de esta técnica es que es una medida cuantitativa de la metástasis. Para realizar una disección de un tumor de pulmón, después de sacrificar a un ratón con una dosis letal de isofluoruro de acuerdo con el protocolo de texto, coloque al ratón en una tabla de espuma boca arriba con las extremidades extendidas y use alfileres de disección para asegurarlo a la tabla.

Después de usar etanol para rociar el ratón, use pinzas para agarrar la parte inferior del animal en el centro y, con unas tijeras, corte hacia arriba hacia el cuello a través de la piel, teniendo cuidado de no perforar la cavidad peritoneal del ratón. Ahora, agarre el peritoneo en el extremo inferior del animal y comience a cortar hacia arriba, hacia la base del cuello. Corta con cuidado a lo largo de los lados izquierdo y derecho de la caja torácica, teniendo cuidado de no cortar ningún vaso sanguíneo que pueda sangrar en la cavidad torácica.

Retire los huesos de las costillas cortando hacia la izquierda y hacia la derecha, a través del diafragma y las partes superiores de la caja torácica. Luego, con fórceps, agarre la tráquea del ratón y tire hacia adelante, y use unas tijeras de disección para cortar la tráquea antes de extraer los pulmones del ratón. Use PBS para lavar suavemente el tejido pulmonar.

Luego, después de la evaluación macroscópica del tejido pulmonar de acuerdo con el protocolo de texto, si los pulmones deben analizarse de inmediato, se proceda al aislamiento del ARN. Para aislar el ARN del tejido, comience por homogeneizar el tejido utilizando uno de los métodos enumerados en el protocolo de texto. Prepare el tampón de lisis a partir de un kit de aislamiento de ARN y agregue 20 microlitros de captoetanol tumoral a cada mililitro de tampón de lisis.

Resuspender cada 30 gramos de tejido en 300 microlitros de tampón de lisis y, con un sonicador ajustado al 30% de amplitud, sonicar el tejido durante 10 segundos. Añadir 10 microlitros de protinasa K a 590 microlitros de tampón TE, y añadir 600 microlitros de tampón a 300 microlitros de tejido sonicado. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

A continuación, centrifugar las muestras a una velocidad mayor o igual a 13.000 veces G durante 10 minutos para eliminar los residuos. A continuación, transfiera el sobrenadante a nuevos tubos. Agregue 450 microlitros de etanol por cada 900 microlitros de sobrenadante para precipitar el ARN.

A continuación, transfiera 700 microlitros de la mezcla de etanol lisado a una columna de ARN. Gire de nuevo a más o igual a 13.000 veces G durante un minuto para unir el ARN a la columna. Luego deseche los desechos líquidos, agregue el sobrenadante restante a la columna y vuelva a centrifugar.

A continuación, añada 350 microlitros de tampón de lavado en la parte superior de la columna y centrifugue las muestras durante 30 segundos. Deseche los residuos líquidos y vuelva a colocar la columna en el tubo. Prepare la DNasa mezclando cinco unidades de enzima DNasa uno con cinco microlitros de tampón de DNasa 10X y 40 microlitros de agua libre de DNasa RNasa para cada muestra.

Agregue 50 microlitros de mezcla de DNasa a cada columna e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, añada 350 microlitros de tampón de lavado a las columnas y centrifugue las muestras durante 30 segundos. Después de desechar la solución de desecho, agregue 600 microlitros de tampón de lavado dos y centrifugue durante 30 segundos más.

Deseche el líquido antes de agregar 250 microlitros de tampón de lavado dos y luego revuelva durante dos minutos. Transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección y agregue de 50 a 100 microlitros de agua libre de RNasa y DNasa a la columna. Después de incubar durante un minuto, gire durante un minuto.

Vuelva a pasar el eluido recolectado a través de la columna para aumentar el rendimiento de ARN. Para su uso inmediato, mantenga las muestras en hielo. Para su uso posterior, congele rápidamente sobre hielo seco o nitrógeno líquido y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta que lo necesite.

Usando un espectrofotómetro, cuantifique el ARN. A continuación, en tubos o placas de PCR estériles sin ARNasa y DNasa, utilice de 0,5 a 2 microgramos de ARN total para preparar la mezcla de reacción para la primera transíntesis, como se muestra en esta tabla. Mezcle, centrifugue suavemente y programe una máquina de PCR estándar usando el programa que se muestra aquí.

Cuando se complete la reacción, use agua estéril y libre de nucleasas para diluir la reacción terminada al volumen deseado. Para llevar a cabo la PCR en tiempo real, utilice un ADN C de control positivo, como el HER2 humano, para establecer una curva estándar para cada conjunto de cebadores mediante la preparación de una a cuatro diluciones en serie del ADN C para generar cinco estándares. A continuación, calcule el número total de muestras, que debe incluir la curva estándar y las muestras experimentales.

A continuación, en tubos estériles sin ARNasa y DNasa, se prepara una mezcla maestra para cada gen experimental de interés, así como un control interno, como el gapdh. Prepare una placa de prueba que contenga un microlitro de ADNasa C para cada muestra estándar o experimental. Asigne al menos una muestra de ADN C por pocillo, para cada sonda de cebador.

Agregue 19 microlitros de mastermix por pocillo, para cada sonda de cebador. Este experimento de bioluminiscencia demuestra que los pulmones de ratón tratados con ACT1, que se dirige a la proteína de unión gap Connexin 43, parecen negativos para la actividad de la luciferasa, lo que sugiere la ausencia de células tumorales en el tejido. Sin embargo, el análisis de secciones de H&E del tejido pulmonar muestra micrometástasis que no fueron iluminadas por la luciferasa, lo que sugiere que las imágenes de luciferasa no son lo suficientemente sensibles como para detectar un número bajo de células tumorales.

A continuación se muestran los resultados de un experimento qRT-PCR, utilizando una sonda específica para HER2, para detectar células tumorales humanas HER2 más JIMT1 en tejido pulmonar de células trasplantadas originalmente a la almohadilla de grasa de memoria del ratón. Aunque no se observaron metástasis macroscópicas visibles en ninguno de los pulmones, en dos de las 11 muestras, la qRT-PCR detectó metástasis. En esta figura, se preparó un análisis de curva estándar para determinar los niveles relativos de HER2 normalizados a la brecha pulmonar del ratón en una serie de números celulares.

Los resultados indican que la qRT-PCR, utilizando la sonda HER2, fue lo suficientemente sensible como para detectar los niveles de HER2 en tan solo 10 células. Finalmente, este análisis de regresión muestra el número relativo de células en cada muestra de pulmón, incluyendo los controles positivos y negativos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en seis a ocho horas, si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener precaución para mantener la integridad del ARN durante el aislamiento del ARN y la reacción inversa a la transcriptasa. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo detectar metástasis en todo el tejido pulmonar, mediante PCR cuantitativa en tiempo real.