Fácil y Precisa mecanoterapia perfiles en micropost Arrays

El objetivo general de esta técnica es recopilar propiedades biológicas mecanológicas relevantes a partir de células individuales aisladas mediante la visualización de las fuerzas de sus interacciones características con el sustrato celular mediante microscopía óptica estándar. El método presentado es una tecnología de plataforma para la mecanobiología. Puede ayudar a investigar preguntas clave en la investigación del cáncer, como el papel de la contracción celular en la metástasis de las células cancerosas.

Las principales ventajas de la técnica son que extrae información neurobiológica de forma robusta con poca formación del usuario. Es compatible con la microscopía óptica estándar y está orientado a un alto rendimiento. En tercer lugar, este método proporciona información sobre las propiedades mecanobiológicas de las células de cáncer de hueso humano.

También se puede aplicar a tipos de células autocélulas, como las células lisas de musco o los cardiomiocitos. Comience colocando el sustrato de vidrio de modo que la matriz de micro postes mire hacia arriba en el pocillo de una placa de 12 pocillos, agregue indirectamente un mililitro de etanol al 99% al pocillo para que el sustrato quede cubierto. Asegúrese de que no se formen burbujas durante los pasos de manipulación de líquidos, y de que el conjunto de micro postes esté siempre cubierto por una fina capa de líquido.

Luego, incube la matriz a temperatura ambiente durante 20 a 30 segundos antes de agregar un mililitro de agua desionizada estéril en el costado del pozo. Una vez que se mezcle con el etanol, aspire aproximadamente un mililitro de la solución de etanol del pozo y agregue un mililitro adicional de agua desionizada. Repita este proceso al menos tres veces para humedecer la muestra.

A continuación, reemplace el agua desionizada en el pozo con PBS de la misma manera agregando y luego aspirando aproximadamente un mililitro a la vez durante tres repeticiones. A continuación, utilice este mismo proceso para sustituir el PBS por el medio. Ahora que el conjunto está cubierto con aproximadamente un mililitro de medio pipetea 25.000 células de interés en un mililitro de medio en el pocillo con un conjunto de micro postes preparado.

A continuación, cierre la placa de pocillos múltiples y transfiérala a una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Deje que las células se adhieran y crezcan sobre los micropostes durante seis o siete horas, inspeccionando el proceso de adhesión. De vez en cuando, utilizando un microscopio óptico, aspire el medio del pocillo y luego lave las células dos veces con un mililitro de PBS.

Asegúrese de aplicar una fuerza suave mientras lava con PBS para eliminar los restos de células que se acumulan en la matriz de micro postes durante la incubación y para separar las células muertas. A continuación, agregue 0,5 mililitros de una solución de formaldehído tamponada al 3,7% durante cinco minutos para fijar las celdas. A continuación, retire la solución de formaldehído y lave el micro post array dos veces con un mililitro de agua desionizada estéril.

Para cada lavado, cubra las celdas fijas con un 0,05% de tinte azul brillante kumasi en 50% de agua, 40% de etanol y 10% de ácido acético durante unos 90 segundos, lave el exceso de solución de tinción con dos enjuagues en un mililitro de agua desionizada estéril. A continuación, añada un mililitro de agua desionizada a la matriz de micro postes y compruebe el resultado de la tinción con un microscopio óptico. Comience agregando dos mililitros de agua desionizada a una placa de Petri con un fondo de vidrio delgado con un par de pinzas, transfiera la matriz de micro postes de la placa de 12 pocillos a la placa de imágenes con un micro poste hacia arriba.

A continuación, coloque la placa de Petri de imágenes en la platina móvil de un microscopio óptico. Si la óptica del microscopio no está corregida al infinito, gire el anillo de compensación de la lente utilizada para la obtención de imágenes hasta que el número en la escala represente el espesor total de todos los materiales a lo largo de la trayectoria óptica. A continuación, retire los anillos de contraste de la cara de la ruta óptica para habilitar el modo de campo claro ordinario y luego reduzca el iris en el lado de iluminación hacia abajo al 50%Alinee la placa de Petri para que los micro postes de la matriz formen una línea horizontal o vertical a través del campo de observación.

Defina un punto de inicio en la parte superior izquierda y mueva la placa de Petri paso a paso por el escenario. Escaneo de la matriz de micro postes mientras se toman numerosas imágenes de alta resolución con un objetivo de 20 x o 40 x. Intenta tener una sola celda en el centro de cada imagen en cada nueva posición.

Barre a lo largo de los ZX desde la parte inferior del micro poste hacia la punta del micro poste hasta que la punta esté enfocada. Usando la rueda de ajuste fino del microscopio. A continuación, baje el plano de enfoque de dos a tres micras hacia la parte inferior del microposte.

Comience cargando el software mec, el perfilador y cargando una variedad de imágenes que deben analizarse haciendo clic en abrir y seleccionando las imágenes. A continuación, vaya a la sección de configuración e ingrese los parámetros según las instrucciones del manual del software. A continuación, analice las imágenes una por una.

Comience seleccionando el botón de recorte y luego haga clic y arrastre para formar un contorno rectangular alrededor del área de interés. Cuando termines, haz doble clic dentro del rectángulo dibujado para finalizar la acción. A continuación, seleccione dibujar el contorno de la celda y use el cursor en cruz para dibujar un contorno alrededor de todas las micro publicaciones cubiertas por la celda visible en la imagen.

Descarte cualquier micro publicación no deseada haciendo clic en para descartar publicaciones y use el cursor en cruz para dibujar. A continuación, incluya todas las micropublicaciones que pertenezcan a una celda fuera de la sección de la imagen o que estén desviadas por cualquier otro motivo, pero no por la celda de interés. A continuación, haga clic en Buscar OID para iniciar la subrutina de software.

Ajuste la configuración del filtro justo al lado del botón buscar OID hasta que se registren todas las micro publicaciones, lo que se hace visible mediante una Cruz Roja en su centro. Si hay varias posiciones de micro publicaciones o se han perdido, use la función de edición manual haciendo clic en edición manual y use la cruz del mouse para seleccionar la micro publicación en cuestión. Haga doble clic dentro del rectángulo y coloque un solo marcador rojo en la sección de la imagen ampliada, que se cierra automáticamente.

Encuentre la micro cuadrícula de publicaciones ideal activando la función de generar cuadrícula con un clic del mouse. Asegúrese de que la posición corresponda con la verdadera cabeza del micro poste que se muestra mediante un anillo azul dentro de la línea de contorno de la celda dibujada. A continuación, corrija los marcadores de cuadrícula mal colocados dentro del área de la celda donde sea necesario.

Usando la función de edición manual correspondiente con un clic del ratón, use la cruz para seleccionar la pregunta de micro publicación haciendo clic y arrastrándola. Haga doble clic dentro del rectángulo que aparece y coloque el marcador azul corregido en la sección de la imagen ampliada, que se cierra automáticamente. A continuación, haga clic en calcular deflexiones para obtener un histograma de los valores de deflexión calculados en función de la diferencia entre una posición de micro poste dentro de la sección de la imagen y la cuadrícula ideal generada.

Por último, guarde el análisis completo, incluidas las tablas de valores. Continúe el análisis de la imagen haciendo clic en restablecer vista para analizar otra sección de la imagen o haga clic en la siguiente muestra de imagen. Mostrado. A continuación, se muestra un ejemplo de perfil meno de dos líneas celulares de cáncer óseo Q oh nueve células, que tienen un bajo potencial metastásico, y las células M 132 altamente metastásicas se asentaron en una elevación del mismo lote de producción.

El resultado muestra que las células Q oh nueve tienden a aplicar más fuerza en sus puntos de unión que las células altamente metastásicas al categorizar los valores de fuerza. Con respecto al área de la celda, se encuentra que la fuerza promedio por celda es elevada para las celdas huo nine en comparación con M 132. Además, la fuerza promedio por micro poste aumenta a medida que las celdas se extienden hasta que la fuerza promedio por poste alcanza un valor más estable.

Aparte de las diferencias en las varianzas morfológicas se pueden cuantificar con resultados interesantes. Por ejemplo, a diferencia de las células M 132 altamente metastásicas, que tienden a ocupar menos micro postes, las células HU oh nueve presentan un perfil más heterogéneo en términos de cobertura de micro postes. En resumen, el perfil Meno para la línea celular parental HU oh nine revela que normalmente cubren más área y aplican un poco más de fuerza a los micro postes.

Mientras que la línea celular metastásica M 132 y el tipo de célula agresivo cubren característicamente menos micro postes y aplican menos fuerza por micro poste. Al realizar este procedimiento, es importante recordar canalizarlo con mucho cuidado y nunca directamente sobre el conjunto de micro postes. Evitando introducir burbujas, ya que provocan el colapso de los micropostes.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer información menobiológica de células individuales aisladas utilizando micro post Aries en combinación con nuestro perfil de malla o software. Disfruta de tus resultados.