Name: Fácil y Precisa mecanoterapia perfiles en micropost Arrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprende a cuantificar interacciones mecánicas entre células adherentes y sustratos microestructurados usando el software MechProfiler. Esta técnica de mecanobiología permite estudiar propiedades de células de cáncer óseo humano con microscopía estándar y alto rendimiento.

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Este trabajo fue financiado por la subvención 14796-PFLS-LSCTI del Comité de Tecnología e Innovación (CTI) Suiza. MicroDuits GmbH proporcionó generosamente matrices MicroPost.

1. Las células de cultivo en micropost Arrays Nota: Todos los pasos deben realizarse en una cabina de bioseguridad para garantizar la esterilidad. Los volúmenes que se dan aquí son para frascos de cultivo de células T25. La densidad media de la receta y la siembra de células de cultivo de células están optimizados para líneas celulares de cáncer de hueso HuO9 y M132. <ol><li> Preparar un cultivo de células para la siembra en una matriz micropost. <ol><li> Inspeccione la calidad del cultivo celular colocando el frasco de cultivo en un microscopio óptico estándar. Asegúrese de que las células muestran un crecimiento y morfología típicos mediante la estimación de la cantidad del fondo frasco de cultivo está cubierto. Una cobertura de 70% -80% refleja una tasa de crecimiento saludable. Preste atención a la cantidad de células flotantes ya que representan las células muertas y / o una cultura con mucha vegetación. </li><li> Trypsinize células mediante la eliminación de medio y el lavado con 4 ml de 1x tampón fosfato salino tampón (PBS). Añadir 0,8 ml de 1x tripsina / ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y se incuba a RT hasta que la células dislodge, que toma alrededor de 2-4 min. Compruebe el proceso con el microscopio y, ocasionalmente, golpee suavemente el frasco para apoyar el desalojo. </li><li> Añadir 5 ml de medio de cultivo celular (medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) / F12 con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de penicilina / estreptavidina (Pen / Strep)) para detener la reacción y para lavar las células residuales que todavía se sientan en la parte inferior del matraz. Posteriormente, verter esta suspensión hacia arriba y abajo varias veces para obtener una mezcla homogénea. Asegúrese de pipeta todas las soluciones en todo el área de crecimiento original del matraz para obtener un desalojo efectivo. </li><li> Transferir la suspensión celular en un tubo de 15 a ml y centrifugar usando una centrífuga de mesa en 0,5 xg durante 3 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento celular en 5 ml de medio pipeteando arriba y abajo 5 veces. Asegúrese de evitar la generación de burbujas mientras lo hace. </li><li> Determinar la densidad celular mediante el uso de una cámara de recuento celular y un microsco luzEducación física. Consultar la suspensión celular en cámara de recuento celular para los agregados de células y garantizar tener solamente células individuales para el experimento posterior. Pipetear otra vez hacia arriba y abajo varias veces si las células tienden a formar agregados para separarlas. </li><li> Diluir la suspensión de células con medio suficiente para obtener una solución de células de 25.000 células / ml. Mezclar bien invirtiendo el tubo cerrado en varias ocasiones. </li></ol></li><li> Preparar una matriz micropost para la siembra de células. Nota crítico: No pipetear en la matriz micropost directamente como esto podría dañar las microposts, sobre todo cuando se introducen burbujas no deseadas. Además, asegúrese de que la matriz micropost nunca se seca como se producen fuerzas capilares conducen al colapso de los microposts. <ol><li> Coloque el sustrato de vidrio con la matriz micropost boca arriba en un pocillo de una placa de 12 pocillos usando un par de pinzas y mojar mediante la adición de 1 ml de etanol (99%). Incubar a temperatura ambiente durante 20 a 30 segundos. </li><li> Diluir el etanolpaso a paso mediante la adición de aproximadamente 1 ml de agua desionizada estéril (agua DI) en el lado de aspiración bien y aproximadamente 1 ml usando una pipeta de transferencia o dispositivo de aspiración. Repita este paso al menos 3 veces. </li><li> Sustituir el agua DI con PBS-buffer de la misma manera mediante la adición y la aspiración de aproximadamente 1 ml. Repita este paso 3 veces. </li><li> Sustituir el tampón PBS con medio mediante la adición de aspiración y aproximadamente 1 ml de medio. Repita este paso 3 veces. </li></ol></li><li> Pipeta solución de 1 ml de células (25.000 células) en la parte superior de cada matriz micropost preparado. Cerrar placa de pocillos múltiples y transferirlo a una incubadora (CO 2 al 5%, 37 ° C). Deje que las células se adhieren y crecen en la parte superior de microposts para 6 -7 horas. </li><li> Inspeccione el proceso de adhesión en ocasiones mediante el uso de una luz de un microscopio. Compruebe que la mayoría de las células aparecen extendían a través de múltiples microposts. </li></ol> 2. Fijación y tinción de las células Nota: Todas las medidas yvolúmenes que se dan aquí son para un solo pocillo de una placa de 12 pocillos. Se recomienda para procesar no más de cuatro de los doce pozos en un momento para evitar una desecación de los pocillos después de la aspiración de cualquier líquido, lo que resultará en un colapso de los microposts. <ol><li> Aspirar medio del pozo y lavar las células 2 veces con 1 ml de PBS-buffer. Asegúrese de aplicar una fuerza suave mientras se lava con PBS para eliminar los desechos celulares que se acumuló en la matriz micropost durante la incubación y para desprender las células muertas. </li><li> Fijar las células con una solución de formaldehído tamponado 0,5 ml 3,7% durante 5 min. </li><li> Reemplace la solución de formaldehído por lavado de las 2x matriz micropost con 1 ml de agua DI estéril. </li><li> Teñir las células con colorante (0,05% Coomassie azul brillante en el 50% de agua, 40% de etanol y ácido acético al 10%) por alrededor de 90 segundos. Lave solución de tinción exceso de 2 veces con 1 ml de agua DI estéril. Añadir agua DI 1 ml a micropost matriz. </li><li> Compruebe la tinción con un microscopio óptico. Repita tque manchaba paso, si el cuerpo celular es demasiado débil para ser visualizado. </li><li> Matrices micropost tienda con las células teñidas en la parte superior en un refrigerador a 4 ° C. Asegúrese de mantenerlos bajo el agua en todo momento. </li></ol> Imagen 3. celular Nota: El paso 4 sólo se aplica a los microscopios y sin infinito corregido la óptica. <ol><li> Añadir 2 ml de agua DI a una placa de Petri con un fondo de cristal fino para obtener imágenes de alta resolución. </li><li> Transferencia array micropost usando un par de pinzas en el plato de imagen con las microposts hacia arriba. </li><li> Coloque la imagen placa de Petri en un escenario móvil de un microscopio de luz. </li><li> Girar el anillo de compensación de la lente utilizada para formación de imágenes hasta que el número en la escala representa el espesor total de todos los materiales a lo largo de la trayectoria óptica para compensar la falta de coincidencia en los índices de refracción del sustrato de vidrio, el elastómero de silicona y el líquido en la parte superior. Esto debería conducir a un aspecto brillante de los micropostsnúcleos. </li><li> Cerrar el iris en el lado de la iluminación a 50% y eliminar cualquier anillos de contraste de fase de la trayectoria óptica que permite un modo de campo brillante ordinaria. </li><li> Alinear la matriz micropost que los microposts forman una línea horizontal a través del campo de observación. Definir un punto de partida (por ejemplo, arriba a la izquierda) y mover el plato de Petri por etapas a través del escenario escanear la matriz micropost mientras toma numerosas imágenes. </li><li> Tome todas las imágenes con la configuración más alta resolución de la cámara utilizando un objetivo 20X o 40X. Objetivo es tener una sola célula en el centro de la imagen. </li><li> Barrer lo largo del eje z a través del sustrato hasta que las puntas micropost están en foco. Utilice la rueda de enfoque fino de sintonización del microscopio y gire hacia centrándose en la parte inferior micropost durante unos 2-3 micras. </li><li> Establecer un procedimiento de imagen estándar tomando serie de imágenes de prueba de una sección matriz barriendo a través de los parámetros de una imagen a la vez (por ejemplo, tiempo de exposición,ajuste de iris, la configuración de la lámpara, etc.). Analizar imágenes con MechProfiler y determinar un conjunto de parámetros adecuados para un análisis rápido y fiable. </li></ol> Análisis 4. Imagen con Open Source Software &quot;MechProfiler&quot; Nota: Todas las funciones de software se pueden activar con un dispositivo señalador con el botón izquierdo del ratón. Sin embargo, un operador entrenado utilizará la combinación de teclas documentados diseñados para estar en la media izquierda del teclado para permitir un procesamiento de imagen de dos manos eficiente. <ol><li> Comience el análisis de imágenes MechProfiler software y abrir una serie de imágenes que necesitan ser analizados haciendo clic en &quot;Abrir&quot;. </li><li> Inserte todos los parámetros en la sección &quot;Configuración&quot; propuesta por el desarrollador de software. Determinar los parámetros que se deben configurar a medida (es decir, el umbral de contorno y distancia mínima) de acuerdo con los procedimientos descritos en detalle en el manual de software. </li><li> Analizar imagens uno por uno a los cultivos a la zona de interés mediante el uso de &quot;Recortar&quot; (haga clic y arrastre con el botón del ratón pulsado). Haga doble clic dentro del rectángulo dibujado para terminar esta acción. </li><li> Marcado cada contorno celular visible uno por uno haciendo clic en &quot;Dibujar contornos celulares&quot; y utilice el cursor de cruz para el dibujo incluyendo todos microposts la célula está unido a. </li><li> Deseche cualquier microposts no deseados haciendo clic en &quot;Descartar Mensajes&quot; y utilice el cursor de cruz para el dibujo. Adjunte todos microposts que pertenecen a una celda fuera de la sección de imagen o que son desviados por cualquier otra razón, pero no por la célula de interés. </li><li> Inicie el software de subrutina &quot;Encuentra centroides&quot; por clic del ratón. Ajustar la configuración justo al lado del botón &quot;Buscar centroides&quot; hasta que todos microposts están registrados, que es visible por una cruz roja en su centro de filtro. Si el ajuste del filtro es demasiado serán ignorados microposts bajas, si es demasiado alta muposiciones ltiple estarán marcados por un solo micropost. Mantenga el filtro de la creación constante durante una sesión de análisis. </li><li> Utilice la función de edición manual &quot;Edición manual&quot; para centroides con múltiples o perdidas posiciones micropost. Utilice la cruz del ratón para seleccionar el micropost en cuestión haciendo clic y arrastrando al otro lado. Haga doble clic dentro del rectángulo y colocar el marcador rojo que falta en la sección de imagen ampliada, que se cierra automáticamente. Descartar una micropost como si está fuera del contorno celular dibujado (véase el paso 4.5) antes de continuar. </li><li> Encuentra la red micropost ideales mediante la activación de la función &quot;Generar cuadrícula&quot; con un clic del ratón. Asegúrese de que la posición se corresponde con la verdadera cabeza micropost, que se muestra por un anillo azul, adentro de la línea celular dibujado. </li><li> Corrija cualquier fabricante de rejilla fuera de lugar dentro del área de la celda donde sea necesario el uso de la función correspondiente &quot;Manuel Editar&quot; con un clic del ratón. Utilice la cruz para seleccionar el micropost en question haciendo clic y arrastrando al otro lado. Haga doble clic dentro del rectángulo que aparece y colocar el marcador azul perdido en la sección de imagen ampliada, que se cierra automáticamente. </li><li> Utilice el botón &quot;Calcular&quot; deflexiones por clic del ratón para obtener un histograma de los valores de deflexión estimado a partir de la diferencia entre la posición de un micropost dentro de la sección de imagen y la rejilla ideal generado. </li><li> Guarde el análisis completo que incluye las tablas de valores por un clic del ratón en &quot;Guardar&quot;. </li><li> Continuar con el análisis de la imagen, ya sea haciendo clic en &quot;Reset View&quot; y analizar otra sección de imagen o clic con el ratón en &quot;Siguiente Imagen&quot;, que convenientemente se puede hacer con la tecla de cursor derecha del teclado. </li></ol> 5. Análisis de Datos - Mechanoprofiling <ol><li> Abra el archivo &quot;Results.xls&quot; con un programa de hoja de la oficina de la carpeta con las imágenes analizadas. Contiene los datos con otrosl valores calculados incluyendo todos deflexiones micropost y medidas derivados estándar, tales como el trabajo (es decir, la energía de deformación del sustrato) por la célula analizada. </li></ol>

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</ol>

El autor principal (NG) es cofundador de MicroDuits GmbH, el proveedor comercial de las matrices de micropostes utilizadas en este estudio. Ningún otro autor tiene ningún conflicto de intereses potencial con este trabajo.

Este trabajo busca avanzar en el campo de la microscopía de fuerza de tracción al reducir sustancialmente los obstáculos técnicos y prácticos a la entrada. Estas barreras provienen de dos lados. En primer lugar están los numerosos desafíos técnicos no triviales que se deben superar para fabricar de forma reproducible y poner en marcha una serie micropost experimentalmente. En segundo lugar, es la necesidad de manera similar no trivial para un análisis semiautomatizado fiable de las fuerzas de células individuales - teni...

Ensayos basados ​​en células de mecanoterapia sensibles permiten investigar las células adherentes, con una amplia gama de aplicaciones que reflejan el papel central que la mecánica pueden desempeñar en la biología celular. Estas aplicaciones suelen centrarse en los mecanismos subyacentes que impulsan procesos subcelulares o el comportamiento de células enteras. Por un lado, los factores ambientales externos, tales como composición de la matriz extracelular o la rigidez de la matriz puede afectar dramáticamente la respuesta mecánica y biológica de una célula. 1 El mismo se puede observar después de su uso de muchas clases de compuestos farmacéuticamente activos, los efectos de los cuales son caracterizan a menudo el uso de modelos de cultivo celular. 2 En las otras propiedades genotípicas de mano, tales como las causadas por mutaciones genéticas espontáneas o inducidas experimentalmente, puede inducir cambios marcados en el fenotipo celular que están asociadas con alteraciones en la estructura y función del citoesqueleto. 3 Estos ejemplos son sólo algunos de los muchos posiblestemas para los que fenotipificación mecánica de las células es relevante, y todos ellos han sido útilmente investigado con matrices micropost. Al momento de escribir esto, alrededor de 200 artículos han sido publicados describiendo la interacción célula-micropost. Estas obras discuten aspectos teóricos de micropost principios de desviación, así como instrucciones prácticas sobre su fabricación. El primer artículo que describe la interacción de las células y matrices micropost flexibles fue publicado por Tan y sus colegas en 2003. 4 En contraste con la microscopía de fuerza de tracción clásica (TFM), donde se utilizan sustratos blandos continuos para estimar la contractilidad celular nanonewton escala, Tan et al. se describe un método que utiliza múltiples vigas verticales espaciados estrechamente hechos de elastómero de silicona. Las principales ventajas de esta técnica emergen de dos características principales. En primer lugar con el fin de cambiar la rigidez del sustrato de células aparente sólo se necesita cambiar las dimensiones micropost mientras se mantienela composición de otra manera constante y evitando de esta manera las diferencias en la topología de la superficie y la química del sustrato. Segundo microposts actúan como resortes individuales que se pueden analizar de forma discreta con la fuerza y ​​la resolución espacial del orden de adhesiones focales individuales y pueden reducir los desafíos analíticos que son inherentes al análisis análoga por la norma TFM. Hoy en día la gama de aplicaciones para las matrices micropost excede en gran medida sólo el mapeo de las fuerzas de unas pocas células individuales. Por ejemplo, Akiyama informa el uso de un aislado de tejido vaso dorsal a partir de una oruga de la polilla como un actuador para una matriz de micropost, con el fin de desarrollar un robot autónomo micro-músculo-accionado de insectos. 5 Sin embargo, las aplicaciones más publicadas de microposts se han centrado en los estudios de las condiciones médicas como infección o cáncer. Por ejemplo, las matrices micropost se han utilizado para estudiar la generación de la fuerza de liado IV pili tipo de Neisseria gonorrhOEA colonias que se asocia con la mejora de cascadas de señales infección. 6 Otros han utilizado microposts para estudiar las células de cáncer de mama tratados con compuestos farmacéuticos dirigidos a la citoesqueleto. 7 Desviación de un micropost se describe a menudo utilizando la teoría clásica de haz para un voladizo con una carga final asumiendo la célula se une sólo a la punta de la micropost. Aquí la fuerza aplicada F que provoca una deflexión δ depende de k &quot;rigidez a la flexión&quot; de la micropost y se calcula por: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq1.jpg" /> (1) con E, I, L y siendo el módulo de Young, área de momento de inercia y haz de longitud respectivamente. Sin embargo, los resultados de esta ecuación sólo dan una aproximación general de las fuerzas en el trabajo ya esquila viga y flexión, así como la deformación del sustrato no se tienen en accontar. Teniendo en cuenta que microposts se hacen típicamente de materiales blandos como polidimetilsiloxano (PDMS) basado en caucho de silicona estos factores deben ser incluidos. . Schoen et al demostraron que existe un factor de corrección tales basada en la relación de aspecto de la micropost (L / D) y del polímero correspondiente relación de Poisson v 8 Lo administra.: <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq2.jpg" /> (2) Con T de inclinación (v) un coeficiente de inclinación que incluye como se puede encontrar en el mismo artículo de ajuste de parámetros a = 1,3: <img alt="Ecuación 3" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq3.jpg" /> (3) Eso significa que la rigidez corregida de un micropost k corr es el producto de la rigidez a la flexión pura k = k se doblan y el factor de corrección corrdada por: <img alt="Ecuación 4" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq4.jpg" /> (4) Por lo tanto, los cálculos de fuerza células deben realizarse utilizando la variación más refinada de la ecuación (1) ya la lectura: <img alt="Ecuación 5" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq5.jpg" /> (5) El impacto de la corrección se hace más evidente tan pronto como se utilizan los valores típicos para las dimensiones micropost. Por ejemplo, una larga micropost 15 micras con una sección transversal circular y un diámetro de 5 micras hecha de caucho de silicona a base de PDMS conduce a un factor de corrección de 0,77 y por lo tanto un cálculo no corregida sería sobreestimar las fuerzas de células ejercida por 23%. Esto se hace aún más grave para microposts con relaciones de aspecto más pequeños. Tradicionalmente, el análisis de imagen micropost también se ha basado en la viga idealizada teoría de la flexión. En 2005 el grupo que fue pionero en el uso de micrmatrices opost publicaron un software de análisis de imagen adecuado para el análisis micropost 9 El software requiere una licencia de software y el usuario debe tomar tres imágenes para cada posición.; uno de cada uno de los planos superior e inferior de la micropost en modo de transmisión y otro en modo de fluorescencia con la célula teñida. Después de comparar las posiciones superior e inferior para cada micropost el software determina un campo vector de fuerza y ​​calcula los parámetros relacionados como la fuerza por correo. Existen otros paquetes de software y sus principios de análisis se mencionan brevemente en los artículos correspondientes que los describen, pero estos paquetes de software de análisis generalmente no están disponibles al público. 10,11 Las matrices micropost diseñados para las fuerzas de células mapeo se pueden clasificar como estar en una disposición ortogonal micropost o un ser hexagonal, el último de los cuales tienen la ventaja de huecos equidistantes entre todos microposts vecinos. Microposts típicos jave una sección transversal circular y sus dimensiones varían desde 1.0 micras a 10 micras de diámetro y de 2 a 50 micras de longitud. 4 Sin embargo, microposts con sección transversal elíptica o cuadrada también se han reportado 12,13. El uso de mezclas de silicona a base de PDMS como material de micropost permite la adición de las nanopartículas en la mezcla. Por ejemplo la adición de cobalto nano-barras permite una activación magnética del micropost y por lo tanto da otro grado de libertad de los posibles diseños experimentales. 14 La mayoría de los grupos producen sus matrices micropost en sustratos rígidos planos como cubierta de vidrio o en el interior de una caja de Petri. Sin embargo, Mann y sus colaboradores informaron recientemente una serie micropost formado sobre una membrana elástica. 15 Esto permite que la aplicación de fuerzas de células estiramiento a células adherentes mientras estudiaba de células en vivo subcelular respuestas dinámicas en cuanto a la contractilidad celular. El estab y más ampliamente empleadocido proceso para la fabricación de matrices micropost se basa en litografía blanda como se describe en los protocolos de Sniadecki interesantes y sus colegas 16-18. En los procesos de sala limpia estándar cortos se utilizan para generar las microestructuras en la parte superior de una oblea de silicio usando fotorresistente SU8. Esto es seguido por un proceso de copiado en el que el caucho de silicona se proyecta sobre las estructuras de la transferencia de ellos en los moldes. En una segunda etapa estos moldes se usan para replicar la microestructura inicial usando caucho de silicona en la parte superior de un sustrato elegido. Sin embargo a pesar del número grande y creciente de publicaciones relacionadas con su aplicación, estableciendo un proceso de fabricación de microposts lleva una considerable cantidad de tiempo incluso para los expertos micro-ingeniería; hay muchos pasos de proceso que requieren la optimización y adaptación al entorno de laboratorio específica y el diseño micropost para producir un nivel de calidad aceptable. Matrices micropost comerciales están ahora disponibles en una lista-tformato o-uso (&quot;off-the-shelf&quot;) con una alta calidad constante. Como tales, son una alternativa al proceso de fabricación complejo y largo requerido para la producción in situ. En este trabajo se utilizó una matriz micropost disponible en el mercado para el mapeo de las fuerzas celulares utilizando imagen de microscopía un solo campo brillante. Más importante este artículo describe y documenta un software de código abierto completamente funcional llamado MechProfiler, que está disponible para su descarga como material complementario a este manuscrito. Una versión mantenido activamente del software también se puede encontrar en http://www.orthobiomech.ethz.ch. La combinación de un ensayo de &quot;off-the-shelf&quot; y un software de análisis de código abierto compatible reduce notablemente el obstáculo de entrada para lograr experimentos TFM precisos. Los investigadores no tienen acceso a cualquiera de las instalaciones de sala limpia o experiencia en el desarrollo de software pueden analizar las fuerzas celulares con éxito. Permite a un usuario a centrarse en los mechanossalida ensayo ensitivity en lugar de la tecnología en sí, y hace mediciones de fuerza de tracción a disposición de una comunidad más amplia. Además, este es un paso importante para allanar el camino hacia la detección completamente automática de matrices micropost. El software de análisis MechProfiler procesa imágenes en formato tiff archivo, png, bmp y gif. Las imágenes pueden ser tomadas usando la fluorescencia, contraste de fase o el microscopio óptico de campo claro. El programa independiente se ejecuta junto con el Compiler Runtime libre de Matlab (disponible en: Figura 12) y los algoritmos subyacentes permite el procesamiento de imágenes aerodinámico, que permite al usuario procesar las imágenes con células individuales o múltiples en aproximadamente 1 min. Además, estas células o bien pueden estar viviendo o &quot;fijos&quot;. El software MechProfiler es capaz de aumentar en gran medida el análisis de datos de rendimiento basándose en la reproducibilidad de arrays micropost calidad comercial, más específicamente, el valor predeterminado &amp; #8220; no desviada &quot;posición de cada mensaje en la matriz puede presumirse en contra de una rejilla ideales (desviaciones de fabricación de la red en las matrices utilizadas para este estudio tenían menos de 100 nm). En resumen se abre una selección de archivos de imágenes para el análisis, los cultivos de la región de interés, define los puestos de trabajo regulados por las células o que deben ser desechados, determina las posiciones de correos, calcula las desviaciones / fuerzas contra la red de ideales, y, finalmente, guarda todos los datos específicos de la célula con una posibilidad para la exportación, incluyendo a una hoja de cálculo estándar de oficina.

<table><tbody><tr><td>Matraces de cultivo celular T25</td><td>Nunc 156367</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x tampón PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Medio DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>FBS South America</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina 100x</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Viales de centrífuga de 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matriz Micropost pre-recubierta con Colágeno I/Fibronectina</td><td>MicroDuits</td><td>MPA-col1/FN</td><td>Dimensiones del micropost: &Oslash;=6.4&#160; y micro; m, l=18,2 y micro; m; cuadrícula=13 &micro; m, kcorr=2.87&#160; nN/&micro; m</td></tr><tr><td>Etanol abs p.A.</td><td>Merck</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 pocillos</td><td>Nunc</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formol, tamponada neutra 10%</td><td>Sigma</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>Azul brillante G-250</td><td>Sigma</td><td>27815</td><td>Azul Coomassie</td></tr><tr><td>Metanol ACS p.A.</td><td>Merck</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Plato con fondo de vidrio</td><td>WillCo Wells BV</td><td>GWSb-3522</td><td>35 mm de diámetro, apertura 22&nbsp; mm</td></tr><tr><td>T-100 Eclipse</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Microscopio invertido</td></tr><tr><td>D3-L3</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Controlador de cámara</td></tr><tr><td>DS Fi2</td><td>Cámara Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Los sustratos de cultivo celular con micropostes flexibles integrados permiten al usuario estudiar las interacciones mecánicas entre las células y su entorno inmediato. En particular, las interacciones célula-sustrato son el principal interés. Hoy en día, las matrices de micropostes son un método bien caracterizado y establecido con una amplia gama de aplicaciones que se han publicado en la última década. Sin embargo, parece haber una reserva entre los biólogos para adaptar la técnica debido al largo y desafiante proceso de fabricación de micropostes, junto con la falta de software fácilmente accesible para analizar imágenes de células que interactúan con micropostes. 
La lectura forzada de las micropublicaciones es sorprendentemente fácil. Un microposte actúa como un resorte con la celda idealmente unida en su punta. Dependiendo del tamaño, una célula aplica fuerza desde su citoesqueleto a través de uno o varios puntos focales de adhesión al microposte, desviando así el microposte. La cantidad de deflexión se correlaciona directamente con la fuerza aplicada en dirección y en magnitud. El número de micropostes cubiertos por una celda y los patrones de deflexión posterior son característicos y permiten determinar valores como la fuerza por poste y muchos parámetros biológicamente relevantes que permiten el "mecanoperfilado" de los fenotipos celulares.
Aquí se describe un método conveniente para la creación de perfiles mecanométricos, que combina la primera generación de micropostes disponibles comercialmente listos para usar con un paquete de software desarrollado internamente que ahora es accesible para todos los investigadores. Como demostración de la aplicación típica, se tomaron imágenes individuales de células de cáncer óseo en microscopía de campo claro para el mecanoperfilado de modelos de líneas celulares de metástasis. Esta combinación de sensores comerciales de fuerza de tracción y software de código abierto para el análisis permite, por primera vez, una rápida implementación de la técnica de matriz de micropostes en el trabajo de laboratorio rutinario realizado por usuarios no expertos. Además, un proceso de análisis robusto y optimizado permite al usuario analizar un gran número de imágenes de micropublicaciones de una manera muy eficiente en el tiempo.

La principal ventaja de la técnica descrita radica en su simplicidad y su potencial para la integración rápida y efectiva sobre el trabajo de laboratorio de rutina. La combinación de redes de sensores comerciales de alta calidad combinados con software de código abierto proporciona información acerca de mecano-sensibilidad que de otro modo requiere el acceso a las instalaciones de sala limpia y un profundo conocimiento de análisis de imagen y desarrollo de software. La figura 1 ilustra el flujo de traba...

Se describen protocolos para cuantificar las interacciones mecánicas entre las células adherentes y los sustratos microestructurados. Estas interacciones están estrechamente relacionadas con comportamientos celulares esenciales, como la migración, la proliferación, la diferenciación y la apoptosis. Los protocolos presentan un software de análisis de imágenes de código abierto llamado MechProfiler, que permite la determinación de las fuerzas involucradas para cada microposte.

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Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

El objetivo general de esta técnica es obtener propiedades mecanobiológicas relevantes de células individuales aisladas mediante la visualización de las fuerzas generadas por sus interacciones características con el sustrato celular, utilizando microscopía óptica convencional. El método presentado es una tecnología de plataforma para la mecanobiología. Puede ayudar a investigar preguntas clave en la investigación del cáncer, como el papel de la contracción celular en la metástasis de las células cancerosas.Las principales ventajas de la técnica son que extrae de forma robusta información neurobiológica con escaso entrenamiento del usuario. Es compatible con la microscopía óptica estándar y está diseñada para un alto rendimiento. En tercer lugar, este método proporciona información sobre las propiedades mecanobiológicas de las células cancerosas óseas humanas.También puede aplicarse a tipos celulares autólogos, como células musculares lisas o cardiomiocitos. Comience colocando el sustrato de vidrio de manera que la matriz de micropostes quede orientada hacia arriba dentro del pocillo de una placa de 12 pocillos; agregue indirectamente un mililitro de etanol al 99% al pocillo, de mod

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

En este vídeo, que muestran cómo fabricar y utilizar microfabricated detectores de POST (mPADs) para evaluar la modulación de la contractilidad celular.

Microfabricated Post-Array-detectores (mPADs): un enfoque para aislar las fuerzas mecánicas

En este protocolo, se demuestra la fabricación de una amplia microactuator de mensajes desplazadas verticalmente en que se basa la tecnología, y cómo esta tecnología de base pueden ser modificados para llevar a cabo de alto rendimiento de cultivo de células mecánica dinámica, tanto en la cultura de dos dimensiones y tres dimensiones paradigmas.

Plataformas microfabricated para el cultivo celular mecánico dinámico

Una descripción de la formación de un microarray de polímero utilizando una técnica de fotopolimerización en el chip. La caracterización rendimiento de alta superficie mediante microscopía de fuerza atómica, las mediciones de ángulo de contacto del agua, de rayos X y espectroscopía de fotoelectrones de tiempo de vuelo espectrometría de masa iónica secundaria y un ensayo de adhesión celular también se describe.

Microarrays de polímeros de alto rendimiento para el descubrimiento de Biomateriales

Este artículo detalla la construcción de un multiplexado basado en el sensor de microagujas. El dispositivo está siendo desarrollado para el muestreo in situ y el análisis electroquímico de múltiples analitos en una manera rápida y selectiva. Tenemos la visión de la medicina clínica y la investigación biomédica utiliza para estos sensores de microagujas basadas en.

Hollow Microneedle basado en sensores para la detección electroquímica multiplexado transdérmica

Un método combinatorio cribado funcional para obtener ideas sobre los impactos de la composición molecular de los microambientes sobre las funciones celulares se describe. El método aprovecha existentes basados ​​en las tecnologías de microarrays para generar matrices de microambientes definidos combinatorias que soportan la adhesión de células y análisis funcional.

Fabricación y uso de microarrays microambiente (MEArrays)

Este manuscrito presenta un método robusto de la fabricación de los micropocillos cóncavos sin necesidad de instalaciones complejas de alto costo. Usando la fuerza magnética, granos de acero y una matriz a través del agujero, varios cientos los micropocillos fueron formados en un sustrato de polidimetilsiloxano (PDMS) de 3 cm x 3 cm.

Un grano emparejado y arreglo de imán para moldear los micropocillos con geometrías variables cóncavos

El aislamiento de los efectos eléctricos y térmicos sobre la deformación asistida eléctricamente (EAD) es muy difícil utilizando muestras macroscópicas. Se han desarrollado micro y nanoestructuras de muestras metálicas junto con un procedimiento de prueba personalizado para evaluar el impacto de la corriente aplicada sobre la formación sin calentamiento de joule y la evolución de las dislocaciones en estas muestras.

Un nuevo método para<em&gt; In Situ</em&gt; Caracterización electromecánica de especímenes de nanoescala

Aquí presentamos un protocolo para área amplia exploración sonda Nanolitografía habilitado por el alineamiento iterativo de arreglos de discos de punta de prueba, así como la utilización de patrones litográficos para estudios de interacción de la superficie de la célula.

Área análisis sonda Nanolitografía facilitado por alineación automática y su aplicación a la fabricación de sustrato para estudios del cultivo celular

Este artículo describe la metodología detallada para preparar una matriz de multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) para manipulación de alto rendimiento de física y química señales mímico en vivo microambientes celulares y a identificar el entorno celular óptimo para las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) con perfiles de unicelulares.

Fabricación de una Matriz microambiente celular Artificial multiplexados

Aquí se presenta un método para fenotipar mecánicamente células individuales utilizando una plataforma microfluídica basada en electrónica llamada detección mecano-nodo-poro (mecano-NPS). Esta plataforma mantiene un rendimiento moderado de 1-10 células/s mientras mide las propiedades biofísicas elásticas y viscosas de las células.

Detección de poro de nodo mecánico: una plataforma rápida y sin etiquetas para mediciones viscoelásticas unicelulares multiparamétricas

La inspección de muestras a gran escala con resolución a nanoescala tiene una amplia gama de aplicaciones, especialmente para obleas semiconductoras nanofabricadas. Los microscopios de fuerza atómica pueden ser una gran herramienta para este propósito, pero están limitados por su velocidad de imagen. Este trabajo utiliza matrices de voladizos activos paralelos en AFM para permitir inspecciones de alto rendimiento y a gran escala.

Microscopía de fuerza atómica de sonda activa con matrices en voladizo cuatór-paralelas para la inspección de muestras a gran escala de alto rendimiento

Aprende a cuantificar interacciones mecánicas entre células adherentes y sustratos microestructurados usando el software MechProfiler. Esta técnica de mecanobiología permite estudiar propiedades de células de cáncer óseo humano con microscopía estándar y alto rendimiento.

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