Ensayo de infiltración bacteriana de la hoja por Fine Caracterización de las respuestas de defensa de la planta utilizando el Thaliana-Pseudomonas syringae Arabidopsis Patosistema

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar cuantitativamente la respuesta inmunitaria de Arabidopsis diliana mediante un ensayo optimizado de infiltración con jeringa. Esto se logra usando primero la infiltración de jeringas para administrar manualmente las bacterias en la hoja a través de las aberturas naturales llamadas sada. El segundo paso es obtener discos de tejido foliar infectado después del desarrollo de los síntomas de la enfermedad.

A continuación, las bacterias se extraen de los discos de las hojas mediante una homogeneización de alto rendimiento. El paso final es la dilución en serie y el manchado en placas de recuento de bacterias para enumerar las colonias. En última instancia, el crecimiento bacteriano dentro de cada hoja puede correlacionarse con la fuerza relativa de la respuesta inmunitaria de la planta.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunidad de las plantas, como la identificación de genes que contribuyen a las respuestas de defensa contra el estrés biótico. La principal ventaja de esta técnica sobre el método existente es que permite una cuantificación precisa del crecimiento del patógeno en el tejido vegetal infectado y ayuda a evitar el error experimental causado por el muestreo de hojas con un estado de desarrollo variado. Este método puede proporcionar información sobre la respuesta inmunitaria de las plantas a una infección por un patógeno bacteriano virulento, y también puede aplicarse a otros sistemas como el ácido salicílico o los patrones moleculares asociados a los microbios que desencadenan respuestas inmunitarias.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para introducir las bacterias en la hoja sin dañar los tejidos. Demostrarán el siguiente procedimiento el becario postdoctoral hindú y los estudiantes de posgrado shalu y yali. Pronto desde mi laboratorio, el ensayo para mejorar la susceptibilidad a las enfermedades se demostrará en este video.

Antes del experimento, prepare placas de medios King B o KB, haga un litro de medio sólido KB como se describe en el texto del protocolo y déjelo enfriar en una placa de agitación magnética. Cuando el medio se enfría para tocar al 80% de glicerol, un molar de sulfato de magnesio y estreptomicina en el medio, vierta dos tamaños diferentes de placas de medios KB. La placa de Petri más pequeña sirve como placa de cultivo de bacterias primarias y la placa de Petri para mascotas más grande sirve como placa de recuento de bacterias.

Almacene las placas a cuatro grados centígrados dos días antes de la racha del ensayo. PSM ES 43 26. Las bacterias de un stock de glicerol negativo de 80 grados Celsius en una placa de cultivo de bacterias estreptocócicas KB e incuban a 28 grados Celsius durante 24 a 48 horas al día siguiente.

Iniciar el cultivo líquido en un tubo de ensayo estéril con cuatro mililitros de medio kb líquido que contenga 50 microgramos por mililitro de estreptomicina. Agite 250 RPM a 28 grados centígrados durante la noche. Las plantas de Arabidopsis para el experimento se cultivan en las condiciones detalladas en el texto del protocolo el mismo día que se inicia el cultivo bacteriano líquido.

Marque los pétalos de las hojas número cinco y seis con un marcador romo e impermeable para facilitar la identificación del tejido infectado en la toma de muestras. Para mejorar la apertura de STA y facilitar la entrada de la solución de patógenos en el agua de la hoja. Las plantas se adaptan bien remojando el piso desde el fondo durante 20 minutos.

Después de 20 minutos, escurre el exceso de agua. Se lleva a cabo la infección de las plantas de arabidopsis. Al día siguiente del inicio del cultivo líquido.

Transfiera el cultivo bacteriano a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y centrifugue a 9.600 Gs durante dos minutos. A temperatura ambiente, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender la pelletza bacteriana con un mililitro de cloruro de magnesio estéril de 10 milimolares diluya la suspensión de bacterias con nueve mililitros de cloruro de magnesio de 10 milimolares en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Después de medir la densidad óptica de las bacterias, diluya las bacterias con cloruro de magnesio 10 milimolares hasta un OD final de 600 de 0,0002.

Para el ensayo de infección por EDS. Para la infiltración se utiliza una jeringa sin aguja de un mililitro de extremo romo, comúnmente conocida como jeringa de insulina. Llene la jeringa con 0,5 a 0,6 mililitros de la solución bacteriana diluida para un control mucho mejor durante el proceso de infiltración, no llene la jeringa a su máxima capacidad.

Exponga la superficie inferior de la hoja en la parte superior del dedo índice y luego, con la ayuda del pulgar, ajuste suavemente la posición de la hoja. Coloque la jeringa verticalmente contra la superficie de la hoja para asegurar una distribución uniforme de la presión y reducir el daño a la hoja. Trate de evitar el área de la nervadura central durante la infiltración.

Empuje lentamente el émbolo para infiltrar la solución bacteriana. La entrada de líquido en el mesófilo de la hoja se visualizará como lo indica el color más oscuro de la hoja, infiltrándose en toda la superficie de la hoja incluso si requiere múltiples intentos. Una vez completada la infiltración, seque suavemente la hoja con tejido absorbente para eliminar la solución patógena adicional.

Inspeccione visualmente el tejido de la hoja infectada en busca de daños. Deje secar las plantas infiltradas durante una o dos horas, devuelva las plantas a sus condiciones originales de crecimiento. Rocíe un domo transparente con agua y cubra las plantas infectadas durante dos horas.

A continuación, rompe la cúpula para generar una abertura de dos a tres pulgadas y déjala puesta durante el resto del experimento de infección, que suele ser de tres días. Un día antes de cuantificar el crecimiento del patógeno. Seque las placas de medios KB de 150 milímetros por 15 milímetros.

Seque los platos manteniéndolos a temperatura ambiente durante unas 24 horas. Procesar el tejido infectado después de la aparición de la esclerosis indicada por el color amarillento del tejido infectado en los genotipos susceptibles, pero antes del desarrollo de lesiones necróticas. Para cada genotipo, prepare seis tubos de molienda.

Coloque una bola de molienda de acero inoxidable y agregue 500 microlitros de cloruro de magnesio estéril de 10 milimolares en cada tubo. A continuación, separe la hoja infectada de la planta y perfore un disco de hoja con una perforadora de papel de un orificio usando pinzas al azar, coloque dos discos de hojas de dos plantas diferentes en cada tubo de molienda. Sellar los tubos, homogeneizar el tejido con un homogeneizador de alto rendimiento a máxima velocidad durante 10 minutos.

Repita este proceso si es necesario hasta que el tejido esté bien homogeneizado y las soluciones se vuelvan verdes debido a la liberación de clorofila de las hojas infectadas mientras espera. Para la homogeneización, llene cada pocillo en las primeras seis filas de una placa de cultivo de 96 pocillos con 180 microlitros de cloruro de magnesio de 10 milimolares. Transfiera 20 microlitros de la suspensión de tejido molido a cada pocillo de la primera fila de la placa de 96 pocillos y mezcle pipeteando repetidamente el líquido hacia arriba y hacia abajo.

Si pequeños fragmentos de tejido obstruyeron la punta, córtela de dos a tres milímetros para ayudar a adquirir el volumen correcto de la solución y proporcionar suficiente espacio para que la gota en la parte superior de la placa espacie el tejido de diferentes genotipos en filas alternativas. Para preparar una dilución en serie diez veces, transfiera 20 microlitros de suspensión de tejido a la segunda fila y repita este procedimiento hasta la sexta dilución. Con puntas de pipeta divididas, transfiera 20 microlitros de la solución de la placa de pared de 96 a la placa KB de 150 milímetros por 15 milímetros.

Trabaje desde la suspensión más diluida hasta la más concentrada, por lo que no es necesario cambiar las puntas de pipeta entre la dilución. Seque la placa a temperatura ambiente con la tapa agrietada. Una vez que no se pueda observar más líquido en la superficie de la placa, cierre la tapa invertida e incube la placa a temperatura ambiente.

Incubar las placas durante 40 a 60 horas hasta que las colonias se hagan visibles. Confirme que las bacterias en las placas reflejan lo predecible diez veces. Caída en unidades formadoras de colonias.

Cuente las bacterias antes de que crezcan demasiado y las colonias se fusionen. Determine el número de bacterias en la dilución más baja que no tenga colonias superpuestas. Por lo general, la dilución preferida a contar contendrá entre 10 y 50 colonias, y puede variar entre las réplicas técnicas.

Para calcular los niveles de proliferación bacteriana, determine el número de unidades formadoras de colonias por disco foliar utilizando esta fórmula, donde R es el número de la fila y T es el número de bacterias dentro de cada réplica técnica. A continuación, los datos se utilizan para producir un gráfico. Cada punto de datos se representa como la media de seis réplicas técnicas en una escala logarítmica.

Las aerobarras representan el intervalo de confianza del 95% de la enfermedad aumentada media. La susceptibilidad frente a P-S-M-E-S 43 26 se evaluó mediante infección con un inóculo con un OD 600 de 0,0002. Los resultados muestran que los mutantes NPR altamente susceptibles tienen aproximadamente 2,5 log o 300 veces más crecimiento de patógenos en comparación con las plantas Columbia zero de tipo salvaje.

El ensayo de infiltración de jeringas puede modificarse para evaluar diferentes capas de respuesta inmunitaria. Para evaluar la inmunidad desencadenada por el ácido salicílico, se utiliza la aplicación externa de salicilato de sodio para desencadenar la respuesta inmunitaria, que se cuantifica mediante el crecimiento del patógeno. La pérdida de NPR R one, que funciona como receptor de ácido salicílico y la principal corregulación transcripcional de los genes diana dependientes del ácido salicílico, conduce a la insensibilidad a la aplicación exógena del derivado del ácido salicílico.

Para caracterizar la inmunidad desencadenada por patrones moleculares asociados a microbios, las plantas fueron pretratadas con dos desencadenantes conocidos. FLAG 22 y L 18, las plantas Columbia cero de tipo silvestre tratadas con FLAG 22 permitieron una reducción de un log o 10 veces en la población bacteriana, mientras que las dos plantas mutantes FLS no lograron desencadenar el efecto de restricción del crecimiento bacteriano. De manera similar, las plantas mutantes EFR fueron insensibles al pretratamiento con L 18.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la respuesta inmune de opsys árabe a través del ensayo de infiltración de jeringas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar monitorear el desarrollo de la enfermedad y tomar muestras del tejido después de la aparición de corsis. El patógeno pseudomona cul cola S phos 3, 2 6 es un patógeno hemioatrófico.

Por lo tanto, el muestreo debe realizarse antes de la transición a la etapa neurotrófica. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la PCR cuantitativa en tiempo real y el análisis de sangre occidental, para responder a preguntas adicionales, como qué vía de señalización inmunitaria concreta está alterada. No olvides que estás trabajando con bacterias vivas.

Aunque Pseudomona Senge no es patógena en humanos, recuerde desechar adecuadamente los consumibles contaminados y las plantas infectadas mientras realiza este procedimiento.