Ensayo de infiltración bacteriana de la hoja por Fine Caracterización de las respuestas de defensa de la planta utilizando el

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar cuantitativamente la respuesta inmune de Arabidopsis diliana mediante un ensayo optimizado de infiltración con jeringa. Esto se logra primero utilizando la infiltración con jeringa para entregar manualmente bacterias en la hoja a través de las aberturas naturales llamadas sada. El segundo paso consiste en obtener discos de tejido foliar infectado tras el desarrollo de los síntomas de la enfermedad.

A continuación, las bacterias se extraen de los discos foliares mediante homogenización de alto rendimiento. El paso final consiste en la dilución en serie y la siembra en placas de recuento bacteriano para enumerar las colonias. En última instancia, el crecimiento bacteriano dentro de cada disco foliar puede correlacionarse con la intensidad relativa de la respuesta inmune de la planta.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunidad vegetal, como la identificación de genes que contribuyen a las respuestas de defensa contra el estrés biótico. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que permite la cuantificación precisa del crecimiento del patógeno en el tejido vegetal infectado y ayuda a evitar errores experimentales causados por el muestreo de hojas con estados de desarrollo variables. Este método puede proporcionar información sobre la respuesta inmune de la planta a una infección con un patógeno bacteriano virulento, y también puede aplicarse a otros sistemas, como las respuestas inmunes inducidas por ácido salicílico o patrones moleculares asociados a microbios.

Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para introducir las bacterias en la hoja sin causar daño al tejido. El procedimiento siguiente será demostrado por el investigador postdoctoral Hindu y las estudiantes de posgrado Shalu y Yali. Pronto, desde mi laboratorio, se demostrará en este video el ensayo para la susceptibilidad mejorada a enfermedades.

Antes del experimento, prepare placas de medio King's B o KB; prepare un litro de medio sólido KB según se describe en el texto del protocolo y déjelo enfriar en una placa agitadora magnética. Cuando el medio se haya enfriado al tacto, añada glicerol al 80 %, sulfato de magnesio uno molar y estreptomicina al medio, y vierta dos tamaños diferentes de placas de medio KB. La placa de Petri más pequeña sirve como placa primaria de cultivo bacteriano y la placa de Petri más grande sirve como placa para el conteo bacteriano.

Almacene las placas a cuatro grados Celsius durante dos días antes de la siembra para el ensayo. PSM ES 43 26. Bacterias de un stock glicerol a menos 80 grados Celsius en una placa de cultivo bacteriano KB con estreptomicina, e incube a 28 grados Celsius durante 24 a 48 horas al día siguiente.

Inicie el cultivo líquido en un tubo de ensayo estéril con cuatro mililitros de medio líquido KB que contenga 50 microgramos por mililitro de estreptomicina. Agite a 250 RPM a 28 grados Celsius durante la noche. Las plantas de Arabidopsis para el experimento se cultivan bajo las condiciones detalladas en el texto del protocolo, el mismo día en que se inicia el cultivo bacteriano líquido.

Marque los pétalos de las hojas número cinco y seis con un marcador opaco e impermeable para facilitar la identificación del tejido infectado durante el muestreo. Para mejorar la apertura de STA y facilitar la entrada de la solución del patógeno en el agua de la hoja. Humedezca bien las plantas sumergiendo la bandeja desde la parte inferior durante 20 minutos.

Después de 20 minutos, retire el exceso de agua. Se lleva a cabo la infección de las plantas de arabidopsis al día siguiente del inicio del cultivo líquido.

Transfiera el cultivo bacteriano a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y centrifugue a 9 600 G durante dos minutos. A temperatura ambiente, deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet bacteriano con un mililitro de cloruro de magnesio estéril al 10 milimolar. Diluya la suspensión bacteriana con nueve mililitros de cloruro de magnesio al 10 milimolar en un tubo centrífugo de 50 mililitros. Después de medir la densidad óptica de las bacterias, diluya la suspensión bacteriana con cloruro de magnesio al 10 milimolar hasta una DO600 final de 0,0002.

Para el ensayo de infección por EDS. Se utiliza una jeringa de extremo romo de un mililitro sin aguja, comúnmente conocida como jeringa de insulina, para la infiltración. Llene la jeringa con 0.5 a 0.6 mililitros de la solución bacteriana diluida para un mejor control durante el proceso de infiltración; no llene la jeringa hasta su capacidad máxima.

Exponga la superficie inferior de la hoja sobre la parte superior del dedo índice y, luego, con la ayuda del pulgar, ajuste suavemente la posición de la hoja. Coloque la jeringa verticalmente contra la superficie de la hoja para garantizar una distribución uniforme de la presión y reducir así el daño foliar. Trate de evitar el área del nervio central durante la infiltración.

Empuje lentamente el émbolo para infiltrar la solución bacteriana. La entrada del líquido en el mesófilo de la hoja se visualizará por el oscurecimiento del color de la hoja; infiltre toda la superficie de la hoja incluso si se requieren varios intentos. Una vez completada la infiltración, seque suavemente la hoja con un papel absorbente para eliminar la solución excedente del patógeno.

Inspeccione visualmente el tejido foliar infectado en busca de daños. Deje que las plantas infiltradas se sequen durante una o dos horas y luego devuélvalas a sus condiciones originales de crecimiento. Rocíe con agua una cúpula transparente y cúbrala sobre las plantas infectadas durante dos horas.

Luego, rompa el domo para generar una abertura de dos a tres pulgadas y déjelo puesto durante el resto del experimento de infección, que generalmente dura tres días. Un día antes de cuantificar el crecimiento del patógeno, seque previamente las placas de medio KB de 150 milímetros por 15 milímetros.

Seque las placas manteniéndolas a temperatura ambiente durante aproximadamente 24 horas. Procese el tejido infectado después de la aparición de esclerosis indicada por el amarilleo del tejido infectado en los genotipos susceptibles, pero antes del desarrollo de lesiones necróticas. Para cada genotipo, prepare seis tubos de molienda.

Coloque una bola de molienda de acero inoxidable y agregue 500 microlitros de cloruro de magnesio estéril, 10 milimolar, en cada tubo. A continuación, desprenda la hoja infectada de la planta y use una perforadora de papel con un orificio para extraer un disco foliar al azar con pinzas; coloque dos discos foliares provenientes de dos plantas diferentes en cada tubo de molienda. Cierre herméticamente los tubos y homogenice el tejido con un homogenizador de alto rendimiento a velocidad máxima durante 10 minutos.

Repita este proceso según sea necesario hasta que el tejido esté bien homogeneizado y las soluciones se vuelvan verdes debido a la liberación de clorofila proveniente de las hojas infectadas durante la espera. Para la homogeneización, agregue 180 microlitros de cloruro de magnesio 10 milimolar en cada pocillo de las primeras seis filas de una placa de cultivo de 96 pocillos. Transfiera 20 microlitros de la suspensión de tejido molido a cada pocillo de la primera fila de la placa de 96 pocillos y mezcle pipetando repetidamente el líquido hacia arriba y hacia abajo.

Si fragmentos pequeños de tejido obstruyen la punta, córtela de dos a tres milímetros para facilitar la adquisición del volumen correcto de la solución y así proporcionar suficiente espacio para la gota en la parte superior de la placa; coloque el tejido de diferentes genotipos en filas alternas. Para preparar una dilución seriada diez veces, transfiera 20 microlitros de la suspensión de tejido a la segunda fila y repita este procedimiento hasta la sexta dilución. Utilizando puntas de pipeta divididas, transfiera 20 microlitros de la solución desde la placa de 96 pocillos a la placa KB de 150 milímetros por 15 milímetros.

Trabaje desde la suspensión más diluida hasta la más concentrada para que no sea necesario cambiar las puntas de pipeta entre las diluciones. Seque la placa a temperatura ambiente con la tapa entreabierta. Una vez que ya no se observe líquido en la superficie de la placa, cierre la tapa, inviértala e incube la placa a temperatura ambiente.

Incube las placas durante 40 a 60 horas hasta que las colonias sean visibles. Confirme que las bacterias en las placas reflejen la reducción predecible en un factor de diez de las unidades formadoras de colonias.

Contar las bacterias antes de que crezcan en exceso y las colonias se fusionen. Determinar el número de bacterias en la dilución más baja que no presenta colonias superpuestas. Por lo general, la dilución preferida para contar contendrá entre 10 y 50 colonias, y puede variar entre réplicas técnicas.

Para calcular los niveles de proliferación bacteriana, determine el número de unidades formadoras de colonias por disco foliar utilizando esta fórmula, donde R es el número de la fila y T es el número de bacterias en cada réplica técnica. Luego, los datos se utilizan para generar una gráfica. Cada punto de datos se representa como la media de seis réplicas técnicas en una escala logarítmica.

Las barras representan el intervalo de confianza del 95 % de la media de la enfermedad potenciada. La susceptibilidad frente a P-S-M-E-S 43 26 se evaluó mediante infección con una inócula que tenía una DO 600 de 0,0002. Los resultados muestran que los mutantes NPR uno guion uno altamente susceptibles presentan aproximadamente 2,5 log, o 300 veces más crecimiento del patógeno, en comparación con las plantas silvestres Columbia cero.

El ensayo de infiltración con jeringa puede modificarse para evaluar diferentes capas de la respuesta inmune. Para evaluar la inmunidad inducida por el ácido salicílico, se utiliza la aplicación externa de salicilato sódico para activar la respuesta inmune, la cual se cuantifica mediante el crecimiento del patógeno. La pérdida de NPR1, que actúa como receptor del ácido salicílico y como cofactor transcripcional principal en la regulación de genes diana dependientes del ácido salicílico, conduce a insensibilidad frente a la aplicación exógena del derivado del ácido salicílico.

Para caracterizar la inmunidad inducida por patrones moleculares asociados a microorganismos, las plantas se trataron previamente con dos inductores conocidos. Las plantas silvestres Columbia cero tratadas con FLAG 22 mostraron una reducción de un logaritmo, o diez veces, en la población bacteriana, mientras que las plantas mutantes FLS dos no lograron activar el efecto de restricción del crecimiento bacteriano. De manera similar, las plantas mutantes EFR resultaron insensibles al tratamiento previo con L 18.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la respuesta inmune de Arabidopsis mediante el ensayo de infiltración con jeringa. Al realizar este procedimiento, es importante recordar monitorear el desarrollo de la enfermedad y tomar muestras del tejido tras la aparición de lesiones. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 es un patógeno hemibiotrófico.

Por lo tanto, el muestreo debe realizarse antes de la transición a la etapa neurotrófica. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como PCR cuantitativa en tiempo real y análisis sanguíneo por Western blot para responder preguntas adicionales, como qué vía específica de señalización inmune está alterada. No olvide que está trabajando con bacterias vivas.

Aunque Pseudomona Senge no es patógeno para los seres humanos, recuerde desechar adecuadamente los materiales desechables contaminados y las plantas infectadas mientras realiza este procedimiento.