Name: Ensayo de infiltración bacteriana de la hoja por Fine Caracterización de las respuestas de defensa de la planta utilizando el Thaliana-Pseudomonas syringae Arabidopsis Patosistema (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Aprende a cuantificar el crecimiento de Pseudomonas syringae en Arabidopsis thaliana mediante infiltración con jeringa. Este método optimizado permite estudiar con precisión las respuestas inmunitarias vegetales.

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Agradecemos al Dr. Shahid Mukhtar por criticar el manuscrito y al Dr. Xinnian Dong por el archivo de análisis de datos de muestra. Este trabajo está respaldado por un premio NSF-CAREER (IOS-1350244) a KPM y al Departamento de Biología de la UAB.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Con la disminución de las tierras agrícolas disponibles y el aumento de la población, los investigadores de todo el mundo tienen el reto con las necesidades apremiantes para el mejoramiento de cultivos. El rendimiento puede ser muy influenciada por diversos estreses bióticos y abióticos. Entre ellos, la infección por patógenos es una de las principales causas de la reducción del rendimiento de los cultivos, responsable de aproximadamente 12% las pérdidas sólo en los EE.UU. 45. Para resolver este problema, la ...

Debido a su naturaleza sésiles, las plantas están constantemente amenazados por una gran cantidad de patógenos que presentan diferentes estilos de vida y estrategias nutricionales 1. En una primera aproximación, los patógenos biotróficos mantienen su huésped vivo para recuperar los nutrientes, mientras que los agentes patógenos necrotróficos toxinas activamente secretas y enzimas para matar tejido del huésped y se alimentan de las células muertas de la 1. Otro grupo de agentes patógenos, hemibiotrophs denominados, comienza su curso con la etapa de la infección biotrófico y los cambios a la etapa necrotrófico al alcanzar un cierto umbral de acumulación patógeno 2. Con el fin de defender eficazmente contra estos microorganismos, las plantas han desarrollado un sistema inmune innato complicada equipado con múltiples mecanismos de vigilancia para detectar el ataque de patógenos y desencadenar la muerte celular localizada 3, así como resistencia sistémica adquirida (SAR) 4 programado. La investigación actual se centra en la caracterización de la sig esencialcomponentes naling y cruzadas conversaciones dentro del sistema inmunológico planta 5. Tal como se propone en el modelo de &quot;Zig-Zag&quot; 5, la primera capa de la respuesta inmune innata planta requiere la presencia de la membrana plasmática-localizada Patrón receptores de reconocimiento (PRRS) para detectar la invasión de un microbio. Derechos y responsabilidades parentales son capaces de reconocer patrones Microbio asociada Moleculares (mAmps) y establecer Inmunidad-Triggered MAMP (MTI) 6. Además de inducir una regulación positiva de la transcripción de genes que codifican proteínas PR antimicrobianos 7, MTI conduce a una variedad de eventos que la detención del crecimiento de patógenos, incluyendo la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) y reactivas de nitrógeno Especies (RNS), deposición de callose a la pared celular así como la activación de la señalización de vías múltiples quinasa 8. Hasta ahora, varios MAMPs se han identificado para desencadenar MTI en Arabidopsis, incluyendo flg22 bacteriana 9 </sup&gt; (Un fragmento de ácido 22 amino derivado de flagelina), elf18 10 (18 aminoácidos del factor de elongación de la traducción bacteriana Tu) y un componente estructural de la pared celular peptidoglicanos 11. Para establecer una infección exitosa, algunos patógenos especializados han desarrollado la capacidad de las proteínas efectoras secretas virulencia en los espacios intercelulares o intracelulares, y en consecuencia reprimir MTI y desencadenar Susceptibilidad-Triggered efectoras (ETS) 12,13. Por ejemplo, efectores de virulencia pueden inactivar proteína activada por mitógeno cascadas de quinasas (MAPK) fosforilación de MTI para inducir el desarrollo de la enfermedad dentro del tejido infectado 14-16 de. Durante la co-evolución dinámica entre los ejércitos y agentes patógenos, las plantas también desarrollaron la estrategia de contraataque para reconocer las proteínas efectoras y atenuar la virulencia de patógenos moléculas 17. Este reconocimiento directo o indirecto efector está mediada por resistencia a enfermedades (R) 18 proteínas. La mayoría de tdobladillo son miembros de NB-LRR (nucleótidos vinculante y ricos en leucina repite) la familia 19. La percepción de un efector no virulenta por una proteína R provoca una respuesta más fuerte y más amplia inmunológico caracterizado como Inmunidad Accionado efector (ETI) 20. Además de inducir la expresión de genes de defensa 21 y la producción de metabolitos de defensa 22, ETI menudo conduce a una localizada muerte celular programada conocida como hipersensible rápida respuesta (HR) para restringir el patógeno se propague en el tejido adyacente 3. Además de la muerte celular programada localizada 23, las plantas son capaces de iniciar un largo plazo y la respuesta inmune en todo el sistema denominado Systemic Acquired Resistencia (SAR) 4. Tras la estimulación con un patógeno biotrófico, las células vegetales desencadenan la biosíntesis y acumulación de un ácido fitohormona endógena salicílico (SA) y proteínas PR en ambos tejidos locales y sistémicos 24. A través de tsu proceso, se logra un mayor estado de preparación en las hojas infectadas que permite para el montaje de las respuestas de defensa más rápidos durante una infección posterior por un amplio espectro de patógenos 24. SA y sus análogos sintéticos como el benzo (1,2,3), 7-carbotioico tiadiazol éster del ácido S metil (BTH) y ácido 2,6-dicloroisonicotínico (INA) son capaces de inducir químicamente ácido salicílico (SA) Inmunidad -Accionados (ITS) tras la aplicación externa de 24. Nonexpressor de los genes relacionados con la patogénesis (1 NPR1) se propone para ser uno de los receptores SA y funciona como un importante regulador transcripcional durante la respuesta de defensa mediada por SA en ambos tejidos locales y sistémicos 21,25,26. Se ha demostrado de manera concluyente que NPR1 se requiere para el establecimiento SAR y la pérdida de NPR1 conduce a la susceptibilidad dramática hacia Pseudomonas syringae 25. Para caracterizar ampliamente la contribución molecular de plantascomponentes en las interacciones planta-patógeno, múltiples bioensayos se han desarrollado para medir acontecimientos de defensa específicos, incluyendo ROS estalló 27, deposición callose 28, genes de defensa expresión y acumulación de sus productos proteicos 21. Si bien estos ensayos individuales pueden proporcionar información en una forma específica de la respuesta inmune de la planta, ninguno de ellos, sin embargo, son capaces de representar la respuesta de defensa completa sobre todo el nivel de la planta. Por el contrario, la cuantificación del crecimiento de patógenos después de la infección proporciona una estimación global de la respuesta inmune a nivel del organismo. Por lo tanto, el desarrollo y optimización de un ensayo de inoculación de patógenos preciso y altamente estandarizado es crítico para alimentar la investigación y descubrimientos en las respuestas inmunes de Arabidopsis. Pseudomonas syringae, una bacteria Gram-negativa, se identificó como un fitopatógeno capaz de causar enfermedad en una gama de huéspedes vegetales incluyendo Arabidopses 29. A medida que el sistema de la planta de patógenos modelo, la Arabidopsis - P. interacción syringae se ha aplicado ampliamente para comprender los mecanismos moleculares respuestas de defensa de las plantas subyacentes 29. Hasta ahora, más de 50 P. patovares syringae se han identificado basándose en su capacidad para infectar diferentes especies de plantas 30 . P. syringae pv. DC3000 tomate (Pst DC3000) 31 y P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 son las dos cepas virulentas más usados ​​y ampliamente caracterizados. Aparte de ser reconocido por la planta y la activación de la respuesta de MTI, Pst DC3000 y PSM ES4326 son capaces de secretar proteínas efectoras virulentas para suprimir MTI y desencadenar ETS para favorecer el 31,33 crecimiento de patógenos. Para diseccionar funcionalmente la interacción entre Arabidopsis y P. syringae, múltiple0; métodos de infección de patógenos se han desarrollado sobre la base del enfoque de prestación de patógenos. Para las plantas de suelos cultivados, patógeno puede ser entregado por la infiltración de la jeringa, la infiltración de vacío, la inoculación por inmersión y la inoculación aerosol 29,34. Recientemente, ensayo de inundación de la inoculación de las plántulas fue desarrollado para realizar pantallas de gran escala en el cultivo de tejidos placas cultivadas plantas de Arabidopsis jóvenes 35. Infiltración Jeringa, como uno de los método más comúnmente utilizado, entrega manualmente el patógeno en el apoplasto través de las aberturas de las hojas naturales estomas 29 llamados. A través de este enfoque, la misma cantidad de P. syringae se puede infiltrar en la hoja infectada y la fuerza de la respuesta inmune planta está inversamente correlacionada con los niveles de crecimiento de patógenos. Por lo tanto, la cuantificación del crecimiento de patógenos sirve como un enfoque óptimo para evaluar la función inmune a nivel de planta entera. Además, la infiltración de la jeringa puede distinguir el tejido local y sistémica, que puede be aplicable en la caracterización de los mecanismos moleculares que subyacen a SAR 36. En el siguiente protocolo, se describe un ensayo de infiltración jeringa optimizado con PSM ES4326 para detectar mutantes de Arabidopsis para una mayor susceptibilidad a la enfermedad (EDS). Este protocolo empleará dos genotipos de Arabidopsis: una de tipo salvaje ecotipo Columbia-0 (Col-0) plantas (de control) y npr1-1 mutantes de pérdida de función (hipersusceptibles) que se infectaron con la cepa bacteriana virulenta PSM ES4326 37. El mutante npr1-1 lleva una mutación puntual dentro de la secuencia de consenso-ankyrin repetida de la molécula NPR1, que altera la histidina altamente conservada en tirosina y hace que la proteína no funcional 25. Además, una serie de modificaciones del ensayo de infiltración de la jeringa se describen que permiten la cuantificación de defectos en las capas específicas de la respuesta inmune, incluyendo MTI y STI.

<table><tbody><tr><td>MetroMix 360&nbsp;</td><td>Grosouth</td><td>SNGMM360</td><td></td></tr><tr><td>Macetas grandes</td><td>Grosouth</td><td>TEKUVCC10TC</td><td></td></tr><tr><td>12 x 6 Insertos</td><td>Grosouth</td><td>LM1206</td><td></td></tr><tr><td>11x 21 Pisos sin agujeros</td><td>Grosouth</td><td>LM1020</td><td></td></tr><tr><td>11x 21 Pisos con agujeros</td><td>Grosouth</td><td>LM1020H</td><td></td></tr><tr><td>Domos de propagación de vinilo</td><td>Grosouth</td><td>CW-221</td><td></td></tr><tr><td>Proteose Peptona</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0122-17-4</td><td></td></tr><tr><td>Trihidrato de fosfato de potasio dibásico&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>151946</td><td></td></tr><tr><td>Agar&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A360-500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>Bio Basic Inc</td><td>SB0494</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>150 x 15 mm Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>R80150</td><td></td></tr><tr><td>Placa rectangular</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-450&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 Hexahidrato</td><td>Bio Básico Inc</td><td>MB0328</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Bio Básico Inc</td><td>GB0232</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp; </td><td>Bio Basic Inc</td><td>MN1988</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 1 ml</td><td>Fisher Scientific NC9992493</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de molienda&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>B1257</td><td></td></tr><tr><td>Tapones para tubos de molienda Denville</td><td>Scientific</td><td>B1254</td><td></td></tr><tr><td>Bola de molienda de acero inoxidable</td><td>Fisher Scientific</td><td>2150</td><td></td></tr><tr><td>placa de 96 pocillos&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-556-008</td><td></td></tr><tr><td>Salicilato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>s3007-1kg</td><td></td></tr><tr><td>flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA)</td><td>Genescript</td><td>Hecho por encargo</td><td></td></tr><tr><td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td><td>Genescript</td><td>Hecho por encargo</td><td></td></tr><tr><td>Grapas perforadoras 146308</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biofotómetro plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>952000006</tr><tr><td>Homogeneizador de alto rendimiento PowerGen</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-503</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga de espín Accu</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal (10-100 y micro; l)</td> <td>Eppendorf</td><td>3122 000.043</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal (30-300 y micro; l)</td> <td>Pipeta Eppendorf</td><td>3122 000.060</td><td></td></tr><tr><td>(20&micro; l)</td><td>Eppendorf</td><td>3120 000.038</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>3552-HR</td><td></td></tr><tr><td>Sharpie marcador permanente</td><td>Grapas</td><td>507130</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 1,5 ml</td><td>Pinzas Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>08-890</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de infiltración bacteriana de la hoja por fine caracterización de las respuestas de defensa de la planta utilizando el<em&gt; thaliana-pseudomonas syringae arabidopsis</em&gt; patosistema

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

En ausencia de las células inmunes móviles especializadas, las plantas utilizan su localizada muerte celular programada y sistémica resistencia adquirida a defenderse contra el ataque de patógenos. La contribución de un gen de Arabidopsis específica a la respuesta inmune general de la planta puede ser específicamente y cuantitativamente evaluado ensayando el crecimiento de patógenos en el tejido infectado. Durante más de tres décadas, la bacteria hemibiotrophic Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) se ha aplicado ampliamente como el modelo de patógenos para investigar los mecanismos moleculares que subyacen a la respuesta inmune de Arabidopsis. Para entregar agentes patógenos en el tejido de la hoja, múltiples métodos de inoculación se han establecido, por ejemplo, infiltración de la jeringa, la inoculación por inmersión, pulverización, infiltración al vacío, y la inoculación de inundación. El siguiente protocolo describe un método de infiltración jeringa optimizado para ofrecer virulenta PSM ES4326 en hojas de adultossuelo cultivado plantas de Arabidopsis y la pantalla con precisión para una mayor susceptibilidad a la enfermedad (EDS) en dirección a este patógeno. Además, este protocolo se puede complementar con múltiples tratamientos previos para diseccionar más defectos inmunes específicas dentro de las diferentes capas de defensa de la planta, incluyendo el ácido salicílico (SA) Inmunidad -Accionados (ITS) e Inmunidad-Triggered MAMP (MTI).

El protocolo que describimos aquí representa un P. optimizado syringae ensayo de infiltración de jeringa para evaluar cuantitativamente la respuesta inmune en plantas de Arabidopsis. Como se ilustra en la Figura 1, la infiltración jeringa de PSM ES4326 es seguido por la extracción y cuantificación de patógenos a través de diluciones seriadas y colonias enumeración. Como se describe en el Paso 3 en el texto del protocolo, E...

La cuantificación del crecimiento de patógenos es una poderosa herramienta para caracterizar diversas respuestas inmunitarias de Arabidopsis thaliana (en adelante: Arabidopsis). El método descrito aquí presenta un ensayo optimizado de infiltración de jeringas para cuantificar la Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 crecimiento en hojas adultas de Arabidopsis.

Ensayo de infiltración bacteriana de la hoja por Fine Caracterización de las respuestas de defensa de la planta utilizando el<em&gt; Thaliana-Pseudomonas syringae Arabidopsis</em&gt; Patosistema

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar cuantitativamente la respuesta inmune de Arabidopsis diliana mediante un ensayo optimizado de infiltración con jeringa. Esto se logra primero utilizando la infiltración con jeringa para entregar manualmente bacterias en la hoja a través de las aberturas naturales llamadas sada. El segundo paso consiste en obtener discos de tejido foliar infectado tras el desarrollo de los síntomas de la enfermedad.A continuación, las bacterias se extraen de los discos foliares mediante homogenización de alto rendimiento. El paso final consiste en la dilución en serie y la siembra en placas de recuento bacteriano para enumerar las colonias. En última instancia, el crecimiento bacteriano dentro de cada disco foliar puede correlacionarse con la intensidad relativa de la respuesta inmune de la planta.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunidad vegetal, como la identificación de genes que contribuyen a las respuestas de defensa contra el estrés biótico. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que permite la cuantificación precisa del crecimiento del patógeno en el tejido vegetal infectado y ayuda a evitar errores experimentales causados por el muestreo de hojas con estados de desarrollo variables. Este método puede proporcionar información sobre la respuesta inmune de la planta a una infección con un patógeno bacteriano virulento, y también puede aplicarse a otros sistemas, como las respuestas inmunes inducidas por ácido salicílico o patrones moleculares asociados a microbios.Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para introducir las bacterias en la hoja sin causar daño al tejido. El procedimiento siguiente será demostrado por el investigador postdoctoral Hindu y las estudiantes de posgrado Shalu y Yali. Pronto, desde mi laboratorio, se demostrará en este video el ensayo para la susceptibilidad mejorada a enfermedades.Antes del experimento, prepare placas de medio King's B o KB; prepare un litro de medio sólido KB según se describe en el texto del protocolo y déjelo enfriar en una placa agitadora magnética. Cuando el medio se haya enfriado al tacto, añada glicerol al 80 %, sulfato de magnesio uno molar y estreptomicina al medio, y vierta dos tamaños diferentes de placas de medio KB. La placa de Petri más pequeña sirve como placa primaria de cultivo bacteriano y la placa de Petri más grande sirve como placa para el conteo bacteriano.Almacene las placas a cuatro grados Celsius durante dos días antes de la siembra para el ensayo. PSM ES 43 26. Bacterias de un stock glicerol a menos 80 grados Celsius en una placa de cultivo bacteriano KB con estreptomicina, e incube a 28 grados Celsius durante 24 a 48 horas al día siguiente.Inicie el cultivo líquido en un tubo de ensayo estéril con cuatro mililitros de medio líquido KB que contenga 50 microgramos por mililitro de estreptomicina. Agite a 250 RPM a 28 grados Celsius durante la noche. Las plantas de Arabidopsis para el experimento se cultivan bajo las condiciones detalladas en el texto del protocolo, el mismo día en que se inicia el cultivo bacteriano líquido.Marque los pétalos de las hojas número cinco y seis con un marcador opaco e impermeable para facilitar la identificación del tejido infectado durante el muestreo. Para mejorar la apertura de STA y facilitar la entrada de la solución del patógeno en el agua de la hoja. Humedezca bien las plantas sumergiendo la bandeja desde la parte inferior durante 20 minutos.Después de 20 minutos, retire el exceso de agua. Se lleva a cabo la infección de las plantas de arabidopsis al día siguiente del inicio del cultivo líquido.Transfiera el cultivo bacteriano a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y centrifugue a 9 600 G durante dos minutos. A temperatura ambiente, deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet bacteriano con un mililitro de cloruro de magnesio estéril al 10 milimolar. Diluya la suspensión bacteriana con nueve mililitros de cloruro de magnesio al 10 milimolar en un tubo centrífugo de 50 mililitros. Después de medir la densidad óptica de las bacterias, diluya la suspensión bacteriana con cloruro de magnesio al 10 milimolar hasta una DO600 final de 0,0002.Para el ensayo de infección por EDS. Se utiliza una jeringa de extremo romo de un mililitro sin aguja, comúnmente conocida como jeringa de insulina, para la infiltración. Llene la jeringa con 0.5 a 0.6 mililitros de la solución bacteriana diluida para un mejor control durante el proceso de infiltración; no llene la jeringa hasta su capacidad máxima.Exponga la superficie inferior de la hoja sobre la parte superior del dedo índice y, luego, con la ayuda del pulgar, ajuste suavemente la posición de la hoja. Coloque la jeringa verticalmente contra la superficie de la hoja para garantizar una distribución uniforme de la presión y reducir así el daño foliar. Trate de evitar el área del nervio central durante la infiltración.Empuje lentamente el émbolo para infiltrar la solución bacteriana. La entrada del líquido en el mesófilo de la hoja se visualizará por el oscurecimiento del color de la hoja; infiltre toda la superficie de la hoja incluso si se requieren varios intentos. Una vez completada la infiltración, seque suavemente la hoja con un papel absorbente para eliminar la solución excedente del patógeno.Inspeccione visualmente el tejido foliar infectado en busca de daños. Deje que las plantas infiltradas se sequen durante una o dos horas y luego devuélvalas a sus condiciones originales de crecimiento. Rocíe con agua una cúpula transparente y cúbrala sobre las plantas infectadas durante dos horas.Luego, rompa el domo para generar una abertura de dos a tres pulgadas y déjelo puesto durante el resto del experimento de infección, que generalmente dura tres días. Un día antes de cuantificar el crecimiento del patógeno, seque previamente las placas de medio KB de 150 milímetros por 15 milímetros.Seque las placas manteniéndolas a temperatura ambiente durante aproximadamente 24 horas. Procese el tejido infectado después de la aparición de esclerosis indicada por el amarilleo del tejido infectado en los genotipos susceptibles, pero antes del desarrollo de lesiones necróticas. Para cada genotipo, prepare seis tubos de molienda.Coloque una bola de molienda de acero inoxidable y agregue 500 microlitros de cloruro de magnesio estéril, 10 milimolar, en cada tubo. A continuación, desprenda la hoja infectada de la planta y use una perforadora de papel con un orificio para extraer un disco foliar al azar con pinzas; coloque dos discos foliares provenientes de dos plantas diferentes en cada tubo de molienda. Cierre herméticamente los tubos y homogenice el tejido con un homogenizador de alto rendimiento a velocidad máxima durante 10 minutos.Repita este proceso según sea necesario hasta que el tejido esté bien homogeneizado y las soluciones se vuelvan verdes debido a la liberación de clorofila proveniente de las hojas infectadas durante la espera. Para la homogeneización, agregue 180 microlitros de cloruro de magnesio 10 milimolar en cada pocillo de las primeras seis filas de una placa de cultivo de 96 pocillos. Transfiera 20 microlitros de la suspensión de tejido molido a cada pocillo de la primera fila de la placa de 96 pocillos y mezcle pipetando repetidamente el líquido hacia arriba y hacia abajo.Si fragmentos pequeños de tejido obstruyen la punta, córtela de dos a tres milímetros para facilitar la adquisición del volumen correcto de la solución y así proporcionar suficiente espacio para la gota en la parte superior de la placa; coloque el tejido de diferentes genotipos en filas alternas. Para preparar una dilución seriada diez veces, transfiera 20 microlitros de la suspensión de tejido a la segunda fila y repita este procedimiento hasta la sexta dilución. Utilizando puntas de pipeta divididas, transfiera 20 microlitros de la solución desde la placa de 96 pocillos a la placa KB de 150 milímetros por 15 milímetros.Trabaje desde la suspensión más diluida hasta la más concentrada para que no sea necesario cambiar las puntas de pipeta entre las diluciones. Seque la placa a temperatura ambiente con la tapa entreabierta. Una vez que ya no se observe líquido en la superficie de la placa, cierre la tapa, inviértala e incube la placa a temperatura ambiente.Incube las placas durante 40 a 60 horas hasta que las colonias sean visibles. Confirme que las bacterias en las placas reflejen la reducción predecible en un factor de diez de las unidades formadoras de colonias.Contar las bacterias antes de que crezcan en exceso y las colonias se fusionen. Determinar el número de bacterias en la dilución más baja que no presenta colonias superpuestas. Por lo general, la dilución preferida para contar contendrá entre 10 y 50 colonias, y puede variar entre réplicas técnicas.Para calcular los niveles de proliferación bacteriana, determine el número de unidades formadoras de colonias por disco foliar utilizando esta fórmula, donde R es el número de la fila y T es el número de bacterias en cada réplica técnica. Luego, los datos se utilizan para generar una gráfica. Cada punto de datos se representa como la media de seis réplicas técnicas en una escala logarítmica.Las barras representan el intervalo de confianza del 95 % de la media de la enfermedad potenciada. La susceptibilidad frente a P-S-M-E-S 43 26 se evaluó mediante infección con una inócula que tenía una DO 600 de 0,0002. Los resultados muestran que los mutantes NPR uno guion uno altamente susceptibles presentan aproximadamente 2,5 log, o 300 veces más crecimiento del patógeno, en comparación con las plantas silvestres Columbia cero.El ensayo de infiltración con jeringa puede modificarse para evaluar diferentes capas de la respuesta inmune. Para evaluar la inmunidad inducida por el ácido salicílico, se utiliza la aplicación externa de salicilato sódico para activar la respuesta inmune, la cual se cuantifica mediante el crecimiento del patógeno. La pérdida de NPR1, que actúa como receptor del ácido salicílico y como cofactor transcripcional principal en la regulación de genes diana dependientes del ácido salicílico, conduce a insensibilidad frente a la aplicación exógena del derivado del ácido salicílico.Para caracterizar la inmunidad inducida por patrones moleculares asociados a microorganismos, las plantas se trataron previamente con dos inductores conocidos. Las plantas silvestres Columbia cero tratadas con FLAG 22 mostraron una reducción de un logaritmo, o diez veces, en la población bacteriana, mientras que las plantas mutantes FLS dos no lograron activar el efecto de restricción del crecimiento bacteriano. De manera similar, las plantas mutantes EFR resultaron insensibles al tratamiento previo con L 18.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la respuesta inmune de Arabidopsis mediante el ensayo de infiltración con jeringa. Al realizar este procedimiento, es importante recordar monitorear el desarrollo de la enfermedad y tomar muestras del tejido tras la aparición de lesiones. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 es un patógeno hemibiotrófico.Por lo tanto, el muestreo debe realizarse antes de la transición a la etapa neurotrófica. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como PCR cuantitativa en tiempo real y análisis sanguíneo por Western blot para responder preguntas adicionales, como qué vía específica de señalización inmune está alterada. No olvide que está trabajando con bacterias vivas.Aunque Pseudomona Senge no es patógeno para los seres humanos, recuerde desechar adecuadamente los materiales desechables contaminados y las plantas infectadas mientras realiza este procedimiento.

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