Un método para Lineage Tracing de células corneales Uso de Multi-color de los ratones reportero fluorescente

El objetivo general de este método es localizar y rastrear la migración, expansión y supervivencia de las células madre y las células progenitoras en el epitelio corneal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de las células epiteliales de la córnea relacionadas con la homeostasis, la reparación de tejidos, el envejecimiento y la patología. La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de establecer y permite el rastreo no invasivo del linaje de las células de forma clonal.

Para comenzar, primero seleccione una cepa de ratón transgénico Cree con un promotor específico de tejido inducible para marcar las células progenitoras epiteliales limbales y corneales y las células madre. Se utiliza la línea de Tamoxifeno Inducible K 14 Cree ERT. A continuación, elija el casete brainbow adecuado en función de la pregunta de investigación y de la línea Cree disponible.

En este caso, se utiliza la línea Brainbow 2.1. Cruce la cepa homocigota de confeti R 26 R con la cepa homocigota K 14 Cree ERT para generar ratones con cuatro células K 14 positivas de color para inducir la recombinación en los ratones transgénicos. Primero pesa 80 miligramos de Tamoxifeno y disuélvelo en un mililitro de aceite de maíz por Vortexing.

Coloque la solución en un baño de agua agitada, mantenido a 65 grados centígrados hasta que se disuelva por completo, y déjelo en el baño hasta la próxima anestesia. Un ratón heterocigoto Brainbow 2.1 Cree ERT de ocho semanas de edad, y comprobar la profundidad de la anestesia con el pellizco del dedo del pie, aplicar cuidadosamente 100 microlitros de la solución de tamoxifeno en cada superficie ocular del ratón. La aplicación directa de tamoxifeno produce una alta eficiencia de inducción de Cree. Almacene cualquier solución residual de tamoxifeno protegida de la luz a cuatro grados centígrados durante un máximo de una semana.

Calentar la solución antes de la aplicación, que se repite en tres días consecutivos por cada ratón. Primero disuelva un gramo de polvo de tamoxifeno en cinco mililitros de dimetilsulfóxido estéril. Para producir una solución de 200 miligramos por mililitro, coloque la solución en un baño de agua agitada, mantenga sus 65 grados centígrados hasta que se aclare y déjela en el baño hasta su uso.

A continuación, anestesiar al ratón y comprobar la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie, aplicar ungüento ocular en el ojo no tratado del ratón para protegerlo de la deshidratación durante el procedimiento y administrar los analgésicos adecuados. A continuación, extraiga 200 microlitros de la solución de tamoxifeno en una jeringa sin ninguna aguja adherida y aplíquela tópicamente sobre toda la córnea del ojo. El líquido se solidifica en el tejido a temperatura ambiente.

Cuida al ratón hasta que se mantenga recostado esternal y devuélvelo a la compañía de otros solo cuando esté completamente consciente. Después de sacrificar ratones en los puntos de tiempo apropiados después de la inducción, se produce una herida ocular como se describe en el protocolo de texto. Nuclea el ojo presionando primero el párpado para sacar el globo ocular de la cuenca.

Deslice las pinzas curvas detrás del globo ocular para sujetar el nervio óptico y tire del globo ocular hacia arriba para separarlo. Coloque cada globo ocular en un plato de 60 milímetros que contenga PBS. Coloque la placa contenedora del ojo debajo de un microscopio estereoscópico quirúrgico.

Asegúrese de reconocer la estructura básica del ojo, la córnea, el limbo y el nervio óptico. Extirpar el nervio óptico, el músculo y el tejido conectivo alrededor del ojo. Sostenga el ojo en la parte posterior con la córnea hacia abajo y haga una incisión en la esclerótica en la parte posterior del globo ocular con unas tijeras de resorte.

Amplíe el corte para permitir que la lente salga y retire el iris con pinzas. A continuación, haga cuatro o cinco incisiones radiales cortando desde el centro hacia la periferia para aplanar la córnea y luego retire las partes restantes del iris con una espátula delgada y plana. Por último, corta el exceso de tejido periférico que rodea el limbo para fijar la córnea.

Transfiera el tejido diseccionado a un plato de 12 pocillos e incube en 4% de formaldehído durante 10 minutos. A continuación, lave brevemente el tejido en PBS para teñir los núcleos celulares. Incubar la córnea en dos microgramos por mililitro de solución de DPI durante 10 minutos, seguido de un breve lavado en PBS.

A continuación, coloque la córnea en un portaobjetos de vidrio con el lado epitelial hacia arriba. A continuación, coloque una gota de medio de montaje sobre la córnea y cúbrala con un cubreobjetos. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche a temperatura ambiente y guárdelos a cuatro grados centígrados.

Para la obtención de imágenes de la córnea, utilice un sistema confocal espectral que permita la separación de las emisiones R-F-P-Y-F-P-G-F-P y CFP. En primer lugar, establezca las longitudes de onda de fluorescencia, excitación y emisión en función de las proteínas fluorescentes del cerebro. Bo cassette, teniendo cuidado de evitar la excitación cruzada o la superposición de las señales de emisión.

A continuación, adquiera imágenes en mosaico para visualizar toda la córnea en alta resolución. Aquí, obtenga una matriz de imágenes de 12 por 12 en los cuatro canales fluorescentes. Por último, fusiona las imágenes para crear un linaje compuesto.

Se realizaron experimentos de rastreo con ratones confeti R 26 R para seguir el destino de las células progenitoras epiteliales limbales y corneales. En condiciones de estado estacionario, se observaron pequeños grupos de células fluorescentes 10 días después de la inducción, como se esperaba. Después de cuatro meses, se desarrollaron rayas desde el limbo hasta el centro de la córnea, lo que sugiere que las células migran desde el limbo para regenerar la córnea después de una lesión corneal.

La migración del limbo se produjo rápidamente, con franjas limbales largas y gruesas que se desarrollaron en siete días. Este modelo es valioso para el seguimiento y estudio de las células madre y progenitoras de la córnea en diferentes circunstancias. Permitirá la investigación de la expansión, supervivencia y migración de células clonales en estado estacionario y en condiciones de estrés como heridas, mutaciones por quemaduras químicas y más en el futuro.

Este modelo también se puede utilizar para diseccionar los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración corneal normal y patológica. Esta técnica puede contribuir a la comprensión de diferentes condiciones patológicas como distrofias corneales, quemaduras y traumatismos corneales, además de la evaluación del impacto de diferentes tratamientos en la regeneración corneal, la expansión celular y la migración.