Name: Un método para Lineage Tracing de células corneales Uso de Multi-color de los ratones reportero fluorescente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprende trazado de linaje multicolor en células epiteliales corneales usando ratones R26R-Confetti. Este método permite rastrear migración y supervivencia de células madre de forma no invasiva y con alta resolución.

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RSF ha recibido financiación del - Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (FP7/2007-2013]) en virtud del acuerdo de subvención n° 618432 – MC-Epi-Patho-Stem, así como de la Fundación Científica Israelí (218/14).

Declaración de Ética: En este estudio el cuidado animal y el uso se ajusta a la Declaración de ARVO para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research. Todos los experimentos fueron aprobados por el comité de ética local. 1. Elija un cre-recombinasa adecuados Expresando ratón Strain <ol><li> Fuera de la gran variedad de líneas transgénicas Cre disponibles para la compra 26 y dependiendo de el tejido diana a ser investigado, elegir un Cre cepa de ratón transgénico en el que la recombinasa Cre gen está controlada por un promotor que es específico para el tejido de interés. En se necesita control temporal caso, elija una línea Cre inducible. Nota: Elegimos el tamoxifeno inducible transgén K14-Cre ERT para etiquetar específicamente epiteliales células madre / progenitoras del limbo corneal y 24. Tenga en cuenta que puede haber diferencias entre las cepas, como Di Girolamo y compañeros de trabajo informó especificidad del limbo sin expresión de la córnea para su K14-Cre ERT 22. Una ventaja de utilizar los ratones transgénicos Cre inducibles es que permite la inducción de linaje seguimiento en marcos de tiempo versátiles. </li></ol> 2. Elija un Adecuado Strain Br Ratón <ol><li> Elija el casete Br apropiado dependiendo de la pregunta de investigación y disponible línea 16,18,20 Cre. <ol><li> Si se utiliza una cepa de ratón Cre no inducible, elija un cassette Br que no permite DNA Inversions / escisiones continuos y por lo tanto dar lugar a productos sin salida (por ejemplo Br1.0 o BR1.1) 16. </li></ol></li></ol> 3. Cruce las líneas transgénicas de interés <ol><li> Para el protocolo que se muestra aquí, cruzar el homocigotos cepa R26R-Confeti (Br2.1 / Br2.1) con los homocigotos cepa Cre ERT (Cre ERT / Cre ERT) para obtener crías hemizygous (Br2.1 / +; Cre / +) que están listos para su linaje mono-alélica trazado ya que todos ellos contienen un solo alelo Br2.1 ysolo alelo Cre. Nota: Para aumentar la eficiencia del etiquetado, se podría generar ratones que contienen dos alelos Cre (Br2.1 / +; Cre / Cre), mientras que dos alelos Br2.1 (Br2.1 / Br2.1; Cre / +) sería aumentar combinaciones (como se detalla en el 22). </li></ol> Inducción 4. Cre-recombinasa Nota: La administración de tamoxifeno en estos experimentos se llevó a cabo mediante inyección intraperitoneal diaria, durante la duración de 3-4 días, a fin de inducir la translocación de recombinasa Cre ERT en el núcleo de limbal y corneal tallo basal K14-positive / progenitor células epiteliales. El siguiente protocolo se puede utilizar para la inyección de cuatro ratones. Alternativamente, la aplicación tópica de tamoxifeno a la superficie ocular produce una mayor eficiencia. La solución tamoxifeno se puede mantener en la oscuridad a 4 ° C durante un máximo de una semana. Calentar la solución antes de su uso. <ol><li> Pesar 100 mg de Tamoxifeno y disolverlo en 5 ml de aceite de maíz aformar una solución de tamoxifeno 20 mg / ml. </li><li> Inyectar 200 l de solución de tamoxifeno (4 mg) por vía intraperitoneal a ratones de 8 semanas de edad durante 3-4 días consecutivos. Nota: La solución tamoxifeno se puede mantener en la oscuridad a 4 ° C durante un máximo de una semana. Calentar la solución antes de su uso. </li><li> Para la aplicación tópica: se pesan 60 mg de Tamoxifeno y disolverla en 1 ml de aceite de maíz para formar una solución tamoxifeno 60 mg / ml. Vortex y establecer la solución en un baño de agua con agitación mantenido a 65 ° C hasta que se convierte licencia clara en el baño hasta su uso. <ol><li> Aplique cuidadosamente 100 l de la solución de tamoxifeno a cada superficie ocular del ratón. </li></ol></li></ol> 5. Preparación de tejidos para Imaging <ol><li> Animales de sacrificio utilizando isoflurano (2% vaporizado en oxígeno) anestesia (confirmar anestesia adecuada por la falta de reflejos) seguido por inhalación de CO2 en los puntos de tiempo apropiados tras la inyección y col tamoxifenonar la tejido relevante. <ol><li> Para estos experimentos, enuclear ojos en los siguientes puntos de tiempo: 1, 4, 8, 12, y 16 semanas después de la inyección tamoxifeno. Lograr la enucleación utilizando pinzas curvas. Pulse los párpados que causan el globo ocular para que salga de la cuenca del ojo. Coloque la pinza detrás del globo ocular que sostiene el nervio óptico. Tire suavemente el globo ocular y separarlo. Nota: En esta etapa, como se describe a continuación, los tejidos se pueden preparar para el análisis wholemount de células marcadas. Secciones regulares de tejido congelado también se pueden preparar, se fijaron en PFA y la imagen como se describe más adelante (véase la sección 6 y 22). </li></ol></li><li> Coloque cada ojo en una placa de 60 mm lleno de PBS. </li><li> Bajo un estereomicroscopio utilizando fórceps tienen el ojo cerca del nervio óptico con la córnea mirando hacia abajo y el uso de un escalpelo para eliminar el nervio óptico, los músculos y el tejido conectivo y hacer una pequeña incisión en la parte posterior del ojo. </li><li> Con unas tijeras de primavera agrandar cuidadosamente lacortar dejando que la lente se salga y se quite el iris utilizando fórceps. </li><li> Aplanar la córnea haciendo 4-5 incisiones radiales a partir desde el centro hacia la periferia usando un bisturí. </li><li> Utilice un bisturí para cortar el tejido periférico exceso más allá del limbo. </li><li> Fijar córneas en PFA 4% durante 10 min, luego lavar brevemente con PBS. </li><li> Incubar las muestras con DAPI durante 10 min y se lava brevemente con PBS. </li><li> Mount córneas en portaobjetos de vidrio con el lado epitelial hacia arriba. Coloque una gota de medio de montaje en la parte superior de la córnea y la tapa con una cubierta de vidrio. Deje secar diapositivas O / N en RT. Mantenga diapositivas a 4 ° C. </li></ol> 6. Microscopía Confocal y Análisis de Imágenes <ol><li> Utilice un sistema confocal espectral que permite la separación de las emisiones de YFP / GFP / PPC. Set de excitación de fluorescencia y longitudes de onda de emisión en función de las proteínas fluorescentes de la casete Br. Elija la longitud de onda de excitación más adecuado para cada proteína con el objetivo de minimizar la cruzexcitación. Elija rangos de emisión estrechas con el fin de minimizar la filtración de señales de las diferentes proteínas. <ol><li> Para el cassette Br2.1, utilice la siguiente configuración de excitación de fluorescencia (ex) y emisión (em) como punto de partida: DAPI - ex 405 nm / em cuatrocientos veinte hasta cuatrocientos ochenta nm, CFP - ex 458 nm / em 470-500 nm, GFP - ex 488 nm / em desde 497 hasta 508 nm, YFP - ex 514 nm / em 529 a 540 nm, y RFP - ex 561 nm / em 575 a 615 nm. </li></ol></li><li> Con el fin de visualizar grandes áreas de tejido con alta resolución, adquirir imágenes azulejo. Por los resultados mostrados en la Figura 2A-B, imagen toda la córnea mediante la obtención de una matriz de 12 x 12 imágenes, es decir, adquirir 144 campos (512 x 512) con 4 canales fluorescentes en cada campo. En total recolectar 576 imágenes y luego fusionar. </li><li> Para explorar la localización de las células etiquetadas en diferentes profundidades y las estructuras de los tejidos, adquirir imágenes Z-pila de diferentes regiones de interés. Para to la imagen de la profundidad completa de la córnea, adquirir 8 secciones ópticas a 3 micras intervalos. Vistas ortogonales de las secciones recogidos, así como las proyecciones de imagen basándose en intensidades máximas pueden construirse usando softwares de imagen convencionales 24. </li></ol> 7. Lesiones de córnea combinado con tamoxifeno Inducción <ol><li> Anestesiar a los ratones con isoflurano (2% vaporizado en oxígeno) y administrar analgésicos (10 mg / kg, Carpofen inyectaron por vía subcutánea). Confirme anestesia adecuada por falta de respuesta a los pies de pellizcar. </li><li> Pesar 1 g de polvo de Tamoxifeno y disolverlo en 5 ml de DMSO estéril para producir 200 solución de concentración mg / ml. </li><li> Calentar la solución tamoxifeno a 65 ° C en un baño de agua hasta que la solución se vuelve transparente. Mantenga la solución en el baño hasta su uso. </li><li> Aplicar pomada ocular en el ojo contralateral sin tratar para prevenir la deshidratación durante la anestesia. No deje a un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el suficiente aireconciencia de mantener decúbito esternal. No devuelva los ratones que habían sido sometidos a ojo hiriendo a la compañía de los otros ratones hasta que se recupere totalmente. Los ratones se debe supervisar de cerca después de la lesión. En caso de que pierdan más del 10% de su peso corporal, sufren de erosión corneal, o incomodidad, el experimento debe ser detenido. Administración de analgésicos Repetir cada 24 horas durante todo el experimento. </li><li> Con una jeringa estéril, sin aguja que se le atribuye; aplicar solución 200 l tamoxifeno por vía tópica sobre toda la superficie de la córnea de un ojo de cada ratón. Nota: La solución líquida se solidifica rápidamente en la superficie del ojo a TA. El efecto de la lesión en la córnea depende de la gravedad de la herida. Después de una aplicación de la solución de tamoxifeno / DMSO no hay efectos adversos se observan en los ratones. En caso de aplicaciones repetidas se puede observar opacidad de la córnea. </li><li> Continúe con la preparación del tejido y de imagen (véase la seccióniones 5 y 6) en puntos de tiempo relevantes. Para los resultados que se muestran aquí, sacrifican los ratones (como se detalla en la etapa 5.1) de la herida de una semana (Figura 2 y 24). </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Lineage experimentos de rastreo han llevado a cabo durante muchos años. Los últimos avances tecnológicos y la aparición de las cepas de ratón confeti abrieron nuevas vías para la investigación. Hoy en día, los investigadores pueden beneficiarse de un gran número de disponibles comercialmente específicos de tejido Cre líneas, los ratones knockout y los ratones transgénicos. Esto proporciona una oportunidad para el diseño de sistemas versátiles experimentales para abordar cuestiones científicas con experiencia básica, evitando la práctica laboriosa, mientras que proporciona datos sólidos y fiables. Ratones R26R-confeti son una herramienta elegante para el seguimiento eficiente y el estudio de la naturaleza y el comportamiento de las células en un organismo vivo. El sistema es fácil de establecer y permite el rastreo de linaje no invasiva de células individuales durante la embriogénesis, la regeneración de células madre bajo homeostasis, o bajo diferentes circunstancias tales como lesión, inflamación y cáncer. Los datos obtenible proporciona un descripta robustaion de la supervivencia de las células diana, la expansión clonal de células y la migración celular, de una manera cuantificable. Un paso crítico sería elegir la cepa de ratón genético apropiado que puede permitir con fiabilidad el etiquetado específico de tejido eficiente en una etapa de desarrollo precisa. Una limitación de este sistema es que para el seguimiento de un organismo vivo, el tejido debe ser accesible y transparente. Del mismo modo, el seguimiento de un tejido grueso en un animal vivo puede ser sólo facilitado por dos fotones o microscopía multi-fotón. Sin embargo, el seguimiento de celda disponible en secciones de tejido postmortem y quizás el tejido intacto puede estudiarse después de que ha sido transformado para convertirse en transparente por el método CLARITY 32,33. Otra limitación a tener en cuenta es que, aunque las células adyacentes que expresan el mismo fluoróforo probable que pertenecen al mismo linaje clonal, también es posible que se pueden derivar de origen celular independiente que expresa al azar el mismo gen fluorescente. Este possibilidad se hace muy poco probable cuando se utilizan múltiples alelos Br para permitir numerosas combinaciones. En el futuro, combinando el sistema de confeti con herramientas genéticas disponibles (es decir, nocaut, modelos knockin y ratones transgénicos) que permitirá el estudio de los genes y sus mutaciones en la salud y la patología. Del mismo modo, el linaje de rastreo bajo diferentes perturbaciones del sistema (es decir, detener la destrucción nicho de células, mediada por láser de ablación celular, tratamiento farmacológico) aportará nuevos conocimientos sobre la participación de las vías de señalización en las decisiones del destino celular. En última instancia, el uso combinatorio de etiquetado fluorescente y bioluminiscencia, periodistas genéticos de las vías de señalización y corte microscopía borde será proporcionar a los investigadores un sistema robusto para aprender cómo las células solo responde a su entorno en su ambiente nativo.

Durante el desarrollo embrionario, el tejido y la morfogénesis de órganos se realizan a través de un programa preciso que puede ser descrito en términos de proliferación celular, la migración celular y la especificación de linaje 1-4. Estos procesos biológicos también están involucrados en mantener la homeostasis de los tejidos adultos, que requiere la regeneración de células madre. Rastreo de linaje, la identificación y el seguimiento de la progenie de un tipo específico de población celular, proporciona una herramienta importante para el estudio de la embriogénesis y frenar la homeostasis celular. De hecho, cada vez se utiliza en muchos campos de la investigación. Particularmente, el trazado de linaje se convirtió en una herramienta esencial para identificar el origen y el destino de las células madre en la homeostasis y el cáncer de desarrollo. Esto es porque puede proporcionar información esencial acerca de cómo la célula se comporta en el contexto del tejido intacto o organismo, con mínima intervención experimental, en contraste con el aislamiento de células y en cultivo o in vitro transplantatien que puede resultar en sesgo no deseado. Tradicionalmente, colorantes tales como carbocianina soluble en lípidos, que incorporan en la membrana plasmática de las células, se utilizaron para el rastreo linaje. Aunque estos tipos de experimentos se han llevado con éxito a importantes descubrimientos y conceptos seminales de forma en la biología del desarrollo 5,6, tienen algunas limitaciones, incluyendo la dificultad para controlar la especificidad de las células diana, el impacto no deseado del colorante sobre el comportamiento celular y la dilución de la etiqueta con el tiempo. Nucleótidos enfoques de etiquetado analógica han permitido documentar la existencia de &quot;células de la etiqueta de retención&quot; que presumiblemente corresponden a quiescent células madre 7,8 lento ciclismo. Sin embargo, mientras que esta técnica podría demostrar la presencia de células en ciclo lento basado en la cinética de proliferación durante un periodo de tiempo limitado que no podía proporcionar conocimientos sustanciales con respecto a la funcionalidad de las células madre. Un metanfetamina linaje trazado óptimometo- debe minimizar el efecto del etiquetado sobre las propiedades de la celda marcada, su progenie, o sus vecinos. Además, sería beneficioso tener un control sobre la inducción de etiquetado, es decir, para tener la posibilidad de etiquetar la población celular de interés en una etapa y de manera dependiente del tiempo, así como de una manera única célula (clonal). Un método de marcaje estable e irreversible que se transmite a toda la progenie de la célula fundador es importante para que la etiqueta se mantendría en el tiempo, y no se transfiere a las células vecinas. Más recientemente, se han desarrollado enfoques genéticos de etiquetado celular. En estos sistemas, los promotores específicos de células pueden utilizarse para desencadenar Cre expresión de la recombinasa con el fin de eliminar un control de carretera loxP-flanqueado y permitir la expresión de genes indicadores tales como la proteína fluorescente verde o Β-galactosidasa genes informadores 9-13. Este enfoque permite no sólo el seguimiento de las células y su progenie, pero también permite que la célula esolation y caracterización molecular. Seguimiento de la célula en el nivel de células individuales se hizo posible por la inducción de la expresión de un solo gen reportero fluorescente. Una limitación importante de este sistema es el hecho de que sólo cuando porcentaje muy bajo de células se etiqueta es posible separar y rastrear los clones individuales. Para superar esta limitación reporteros multicolor pueden ser utilizados. Cuando se utiliza el etiquetado multicolor, el seguimiento del destino diferenciado de las células vecinas en el mismo nicho se puede lograr de manera eficiente 14-17. Recientemente, una variedad de Brainbow (Br) alelos se han desarrollado para los experimentos de rastreo de linaje, lo que permite una expresión estocástica de múltiples genes reporteros fluorescentes que utilizan el sistema Cre / lox. El sistema Cre / lox se compone de la enzima recombinasa Cre, que reconoce y se une a secuencias específicas de ADN tales como sitios loxP. Después de la unión de la recombinasa Cre, sitio de recombinación específica se produce, lo que provoca la eliminación de secuencias loxP flanqueado resulting en la expresión aleatoria de diferentes proteínas fluorescentes (el mecanismo se describe a continuación). Una variedad de líneas Br están disponibles para su uso (ver comentarios 16,18,19). Las principales diferencias entre las cepas Br incluyen (i) las diferencias en el número de genes fluorescentes incluidas en el casete, que van desde 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) a 4 (BR1.1, Br2.1) genes fluorescentes , (ii) la presencia de sitios lox recíprocamente orientadas para permitir la inversión de gen (Br2.0-2.1), (iii) el tipo de sitios lox utilizados, y (iv) la expresión o silencio de la expresión del gen fluorescente antes de la activación Cre. El Br3 recientemente establecida ofrece un método mejorado para la imagen multicolor de las neuronas. Una de las principales características de esta transcripción es que contiene un nuevo conjunto de proteínas fotoestables farnesylated fluorescentes, que permiten una tinción incluso de los mejores neuronal procesa 20. Es importante destacar que las diferentes versiones de cassettes Br pueden contener el específica neuronal Thy1 promoter o la doquier expresó CAG (CMV). Por último, mientras que algunos de los ratones transgénicos Br puede contener un único transgén Br, otros pueden consistir en múltiples copias del transgén, lo que permite la producción de un inmenso número de posibilidades de combinaciones que se expresa en cada célula (por ejemplo, véase 16). En nuestro estudio, hemos utilizado el ratón R26R-Confeti que contiene el Br 2,1 casete 21. Br2.1 está especialmente diseñado para permitir que las inversiones de ADN mediada por Cre y no sólo escisiones Debido a la orientación recíproca de los sitios loxP (Figura 1). Por lo tanto, estos acontecimientos inversión / escisión que conducen al cambio de color pueden continuar mientras Cre está presente 16. Por esa razón, un sistema de expresión inducible Cre temporal es esencial para el seguimiento fiable de células usando Br2.1. Como se muestra en la figura. 1, la Br2.1 contiene un promotor CAG ubicua seguido por loxP-flanqueado Neo R -cassette, que actúa como un control de carretera de la transcripción, que es seguido por 4 genes fluorescentes reportero, codificación de verde (GFP), amarillo (YFP), rojo (RFP) y cian (PPC) proteínas fluorescentes, colocados en dos tándems. No fluorescencia se expresa antes de la activación Cre. La inducción de la recombinasa Cre provoca la eliminación de la casete Neo-R que permite la expresión aleatoria de una de las 4 proteínas fluorescentes en una célula dada. El primer segmento contiene GFP-loxP flanqueado y una YFP invertido, mientras que el segundo segmento contiene RFP-loxP flanqueado y una PPC invertido. Estos segmentos de ADN pueden ser invertidos de forma continua (utilizando loxP que está en orientación inversa), o extirpados, siempre y cuando la recombinasa Cre está presente. Por lo tanto, se debe utilizar un transgen Cre transitoria y controlada. El casete Br2.1 proporciona un excelente sistema para distinguir entre las emisiones de solapamiento de la ubicación de la señal: la expresión de YFP y RFP es citoplasmática, la GFP es nuclear y la PPC se une a la membrana celular. GFPy las emisiones de RFP se separan fácilmente por microscopía de fluorescencia convencional. Con el fin de separar las emisiones de YFP / GFP / CFP, se necesita un sistema de imagen confocal espectral. En total, el casete Br2.1 permite la expresión específica al azar, inducible, y el tejido de uno de cada cuatro genes fluorescentes distintos en cada célula diana. De hecho, cuando se necesita un mayor número de combinaciones de colores, se puede generar ratones homocigotos que contiene 2 alelos de Br2.1, lo que resulta en la expresión de 2 etiquetas de color para cada célula y en el aumento del número de posibles combinaciones de colores para 10 22. Algunas de las cepas de ratón Br permiten la expresión de un número mucho mayor de posibles combinaciones desde múltiples copias del casete se integraron en su genoma 16. Sin embargo, en la mayoría de los casos, las cuatro combinaciones de color proporcionadas por un único alelo Br2.1 son suficientes. Siguiendo el protocolo aquí proporcionada, se puede establecer este método utilizando una relativamente sencilla configuración de SPECTRal microscopía con poca o ninguna necesidad de calibración. Aquí proporcionamos un protocolo adaptable para el uso de los ratones R26R-confeti que contienen un único alelo Br2.1, para el rastreo de linaje experimentos del epitelio corneal. Esta cepa de ratón transgénico ha sido utilizado para estudiar el origen y el destino de cáncer de colon 21,23 y células madre epiteliales de la córnea 22,24, la presencia de actividad de células madre en el cáncer intestinal 25, y para la caracterización de podocitos renal en glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GSF) 17.

<table><tbody><tr><td>R26R-Confeti ratones transgénicos homocigotos para el casete Brainbow 2.1</td><td>Cepa Jackson</td><td>#013731</td><td></td></tr><tr><td>ratones K14-CreERT</td><td></td><td>Cepa Jackson #005107</td><td></td></tr><tr><td>tamoxifeno</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano USP Terrell</td><td>Piramal Cuidados</td><td></td><td></td>Críticos</tr><tr><td>Carprieve 30</td><td>b.wt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>utilizado en concentración de 4&#160; y micro; g/ml</td></tr><tr><td>Immu Mount</td><td>Thermo Scientific 9990402</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 Meta sistema confocal de escaneo láser conectado a un microscopio motorizado invertido (Axiovert 200M) equipado con una platina motorizada</td><td>Zeiss</td> La superposición espectral entre GFP, YFP y CFG requiere el uso de imágenes espectrales que permiten la separación de los espectros <td></td><td>de emisión de las proteínas fluorescentes. Aquí utilizamos el microscopio confocal espectral Zeiss LSM 510 Meta. El detector Meta incluido en este sistema tiene 32 elementos detectores, cada uno de los cuales recoge la emisión de una banda de onda de 10 nanómetros. Esta técnica, denominada "huella digital espectral", permite al usuario establecer los límites más adecuados para el filtrado de banda de onda. Hay una variedad de sistemas confocales espectrales que se pueden utilizar, incluidos Leica SP5 (ref # 21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref # 22).</td></tr><tr><td>Zen 2009 Software de imagen</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duratears-ungüento para los ojos Alcon</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un método para lineage tracing de células corneales uso de multi-color de los ratones reportero fluorescente

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Los experimentos de rastreo de linaje definen el origen, el destino y el comportamiento de las células en un tejido u organismo específico. Esta técnica se ha aplicado con éxito durante muchas décadas, revelando hallazgos seminales en la biología del desarrollo. Más recientemente, fue adoptado por los biólogos de células madre para identificar y rastrear diferentes poblaciones de células madre con una intervención experimental mínima. Los recientes avances en la genética de ratones, la disponibilidad de un gran número de cepas de ratones y los avances en microscopía fluorescente permiten el diseño sencillo de potentes sistemas de rastreo de linajes para varios tejidos con conocimientos básicos, utilizando herramientas disponibles en el mercado. Recientemente hemos aprovechado esta potente metodología para explorar el origen y el destino de las células madre en la superficie ocular utilizando ratón R26R-Confetti. Este modelo ofrece un sistema genético multicolor, para la expresión de 4 genes fluorescentes de forma aleatoria. Aquí describimos los principios de esta metodología y proporcionamos un protocolo adaptable para diseñar experimentos de rastreo de linaje; específicamente para el epitelio corneal, así como para otros tejidos.

Recientemente, hemos destinado a identificar el origen, la supervivencia y la migración de las células madre y células progenitoras del epitelio corneal 24. La acumulación de evidencia apoya el dogma de que el epitelio corneal se regenera las células madre localizadas exclusivamente en el nicho del limbo, una zona en forma de anillo en la periferia de la córnea. Esta teoría es apoyada por in vitro e in vivo de datos, y por la evidencia clínica que sirvió de base para la terapia de células madre del limbo exitosa pionera 27-29. Sin embargo, este tema quedó muy debatido en los últimos años debido a un estudio basado en experimentos de injerto del limbo que sugerían que el limbo del ratón no participa en la renovación de la córnea 30. Para probar esta hipótesis interesante, del linaje de rastreo experimentos con ratones se realizaron R26R-confeti, para seguir el destino de las células epiteliales madre / progenitoras del limbo corneal y en condiciones de estado estacionario para un máximo de 120 días 24.Los ojos fueron enucleados y de montaje en piso córneas fueron analizados por confocal espectral de fluorescencia de barrido láser microscopía de 10 y 120 días después de la inyección tamoxifeno. Como se esperaba, se observaron pequeños grupos esporádicos de células fluorescentes a lo largo de la superficie ocular 10 días después de la inyección, mientras que 1-4 meses después (Figura 2B y 24), estrías alargadas que se extienden desde el limbo hacia el centro de la córnea desarrollan lentamente. Este resultado sugiere que la córnea se regenera por las células que migran desde el limbo hacia el centro de la córnea. A continuación, se examinó la regeneración de la córnea bajo condiciones herida. Con el fin de probar el destino de las células de la córnea / limbares K14-positivos bajo condiciones hiriendo mientras que la inducción de seguimiento celular eficiente, que disolvió el tamoxifeno en sulfóxido de dimetilo (DMSO), que causa lesión de la córnea después de la aplicación tópica. De esta manera se logró inducir heridas leves si se aplicó una sola aplicación tópica (Figura 2C), mo<html> desclasificar hiriendo si se aplicó tratamiento solo adicional DMSO en el día antes de la inducción tamoxifeno o una herida grave cuando DMSO solo se aplica tópicamente en 2 días consecutivos antes de la inducción de tamoxifeno. En contraste con las rayas del limbo delgadas que poco a poco desarrollados y llegaron al centro de la córnea dentro de 4 meses en condiciones de estado estacionario, la migración celular después de la lesión fue rápida. Sorprendentemente, largas y gruesas rayas limbo ya se desarrollaron en estas condiciones el plazo de 7 días. Curiosamente, la diversidad de color a veces era mínima (Figura 2D). En nuestras manos, de vez en cuando, se identificaron principalmente glóbulos rojos en toda la córnea, lo que indica que la diversidad color puede ser sesgada hacia fluoróforos específicos. Este sesgo no deseado puede ser calibrado por medio de pruebas de dosis-respuesta como se informó anteriormente en Br1.0L 31 y en Br2.1 21. les / ftp_upload / 53370 / 53370fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Ilustración esquemática del constructo R26R-confeti. (A) La construcción R26R-confeti contiene un promotor CAG para los altos niveles de expresión, un loxP (triángulo negro) -flanked Neo R -roadblock y el casete Brainbow2.1 en el locus Rosa26 16,21. El casete Brainbow2.1 incluye dos de cabeza a cola dímeros loxP-flanqueado. Un dímero formado por la proteína nuclear localizada verde fluorescente (GFP) y un citoplasmática proteína fluorescente amarilla orientada inversa (YFP, la orientación invertida se designa - OPU). La segunda dímero contiene RFP citoplasmática y una proteína fluorescente cian-membrana anclada orientada inversa (PPC, la orientación invertida se designa - PFC) 16. (B - E) Tras la activación Cre-recombinasa, se pueden producir diferentes eventos de escisión y de inversión; posibles resultados son ilustración coned en B - E. La actividad Cre induce reordenamiento estocástico del casete que conduce a el traslado de genes y / o inversiones y por lo tanto resulta en la expresión aleatoria de una de las cuatro proteínas fluorescentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53370/53370fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53370/53370fig2.jpg" /> La Figura 2. Linaje Corneal rastreo en el marco homeostasis y lesiones. R26R-confetti / ratones K14-Cre fueron inyectados con 4 mg de tamoxifeno como se detalla en el protocolo. En el tiempo indicado puntos después de la inducción aplanado córneas fueron imágenes (A - B). Herida corneal junto con Cre inducción se logra mediante la aplicación tópica de tamoxifeno se disolvió en DMSO (C - D). Imágenes Mosaico obtienenpor multicanal embaldosado microscopía confocal espectral se muestran (A - D). En la homeostasis, rayas radiales del limbo de células que migran lentamente extendieron entre el limbo y el centro de la córnea. Estas rayas desarrollan lentamente, alcanzando el centro de la córnea dentro de 4-5 meses (B). Los racimos de células de la córnea fueron evidentes, así (flechas blancas, B). En contraste, grandes rayas limbares aparecieron dentro de una sola semana en condiciones hiriendo (C). Un ejemplo de sesgo de la diversidad de colores hacia las células rojas (D). La frontera del limbo corneal es anotado por una línea discontinua. La barra de escala es de 500 micras. Abreviaturas: PPC, proteína fluorescente cian; GFP, la proteína verde fluorescente; RFP, proteína fluorescente de color rojo; YFP, proteína fluorescente amarilla. Esta cifra se ha modificado desde el 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53370/53370fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de</a>esta figura.

En este artículo describimos los principios para diseñar y realizar un experimento de trazado de linaje multicolor utilizando ratones R26R-Confetti. Proporcionamos un protocolo específico para el seguimiento de las células epiteliales de la córnea que puede ser modificado para otros tejidos de interés.

Un método para Lineage Tracing de células corneales Uso de Multi-color de los ratones reportero fluorescente

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

El objetivo general de este método consiste en localizar y rastrear la migración, expansión y supervivencia de células madre y células progenitoras en el epitelio corneal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular del epitelio corneal relacionadas con la homeostasis, la reparación tisular, el envejecimiento y la patología. La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de establecer y permite el rastreo no invasivo de linajes celulares de manera clonal.Para comenzar, seleccione primero una cepa de ratón transgénico Cree con un promotor específico de tejido inducible para marcar las células progenitoras y las células madre del epitelio limbal y corneal. Se utiliza la línea K14 Cree ERT inducible por tamoxifeno. A continuación, elija el casete brainbow apropiado según la pregunta de investigación y la línea Cree disponible.En este caso, se utiliza la línea Brainbow 2.1. Cruce la cepa R 26 R confetti homocigota con la cepa K 14 Cree ERT homocigota para generar ratones con cuatro colores en células positivas para K 14. Para inducir la recombinación en los ratones transgénicos, primero pese 80 miligramos de tamoxifeno y disuélvalos en un mililitro de aceite de maíz mediante vortex.Coloque la solución en un baño de agua con agitación, mantenido a 65 grados Celsius hasta que se disuelva completamente, y déjela en el baño hasta su uso. A continuación, anestesie un ratón heterocigoto Brainbow 2.1 Cree ERT de ocho semanas de edad, y verifique cuidadosamente la profundidad de la anestesia mediante el pellizco del dedo del pie. Aplique cuidadosamente 100 microlitros de la solución de Tamoxifeno sobre cada superficie ocular del ratón. La aplicación directa de Tamoxifeno produce una alta eficiencia de inducción de Cree. Almacene cualquier solución residual de Tamoxifeno protegida de la luz a cuatro grados Celsius durante un máximo de una semana.Caliente la solución antes de su aplicación, que se repite durante tres días consecutivos para cada ratón. Primero disuelva un gramo de polvo de tamoxifeno en cinco mililitros de dimetilsulfóxido estéril. Para obtener una solución de 200 miligramos por mililitro, coloque la solución en un baño de agua con agitación, manteniéndola a 65 grados Celsius hasta que se vuelva transparente, y déjela en el baño hasta su uso.A continuación, anestesie al ratón y verifique la profundidad de la anestesia mediante una compresión del dedo del pie, aplique una pomada oftálmica en el ojo no tratado del ratón para protegerlo de la deshidratación durante el procedimiento y administre analgésicos adecuados. A continuación, aspire 200 microlitros de la solución de tamoxifeno en una jeringa sin aguja, y aplíquela tópicamente sobre toda la córnea del ojo. El líquido se solidifica sobre el tejido a temperatura ambiente.Atienda al ratón hasta que mantenga una posición esternal recostada y devuélvalo con los demás solo cuando esté completamente consciente. Después de sacrificar los ratones en los puntos de tiempo adecuados posteriores a la inducción, realice una lesión ocular como se describe en el protocolo del texto. Nuclee el ojo presionando primero el párpado para hacer salir el globo ocular de la cuenca.Deslice las pinzas curvas detrás del globo ocular para sujetar el nervio óptico y tire del globo ocular hacia arriba para separarlo. Coloque cada globo ocular en una placa de 60 milímetros que contenga PBS. Coloque la placa con el ojo bajo un microscopio estereoscópico quirúrgico.Asegúrese de reconocer la estructura básica del ojo, la córnea, el limbo y el nervio óptico. Retire el nervio óptico, los músculos y el tejido conectivo alrededor del ojo. Sujete el ojo por la parte posterior con la córnea hacia abajo y realice una incisión en la esclerótica en la parte posterior del globo ocular utilizando tijeras de resorte.Aumente el corte para permitir que la lente salga y retire el iris con pinzas. A continuación, realice cuatro o cinco incisiones radiales cortando desde el centro hacia la periferia para aplanar la córnea y luego elimine las partes restantes del iris con una espátula delgada y plana. Finalmente, corte el tejido periférico excesivo que rodea el limbo para fijar la córnea.Transfiera el tejido disecado a una placa de 12 pocillos e incúbelo en paraformaldehído al 4% durante 10 minutos. Luego, lave brevemente el tejido en PBS para teñir los núcleos celulares. Incube la córnea en una solución de DPI de dos microgramos por mililitro durante 10 minutos, seguido de un breve lavado en PBS.A continuación, coloque la córnea sobre un portaobjetos con el lado epitelial hacia arriba. Luego, coloque una gota de medio de montaje encima de la córnea y cúbrala con un cubreobjetos. Deje secar los portaobjetos durante la noche a temperatura ambiente y almacénelos a cuatro grados Celsius.Para la imagen del cristalino, utilice un sistema confocal espectral que permita la separación de las emisiones de R-F-P-Y-F-P-G-F-P y CFP. Primero ajuste las longitudes de onda de fluorescencia, excitación y emisión según las proteínas fluorescentes del cerebro. Cassette Bo, teniendo cuidado de evitar la excitación cruzada o la superposición de las señales de emisión.A continuación, adquiera imágenes en mosaico para visualizar toda la córnea con alta resolución. En este paso, obtenga un conjunto de 12 por 12 imágenes en los cuatro canales fluorescentes. Finalmente, combine las imágenes para crear una línea compuesta.Se realizaron experimentos de trazado utilizando ratones R 26 R confetti para seguir el destino de las células progenitoras epiteliales limbales y corneales. En condiciones de estado estable, se observaron pequeños grupos de células fluorescentes 10 días después de la inducción, tal como se esperaba. Después de cuatro meses, se desarrollaron estelas desde el limbo hasta el centro de la córnea, lo que sugiere que las células migran desde el limbo para regenerar la córnea tras una lesión corneal.La migración desde el limbo ocurrió rápidamente, con el desarrollo de franjas limbales largas y gruesas en siete días. Este modelo es valioso para rastrear y estudiar las células madre y progenitoras corneales en diferentes circunstancias. Permitirá la investigación de la expansión clonal de células, su supervivencia y migración en estado estable y bajo condiciones de estrés, como lesiones, quemaduras químicas, mutaciones y otras más en el futuro.Este modelo también puede utilizarse para analizar los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración corneal normal y patológica. Esta técnica puede contribuir a nuestra comprensión de diferentes condiciones patológicas, como las distrofias corneales, quemaduras y traumatismos corneales, y además a la evaluación del impacto de diferentes tratamientos sobre la regeneración corneal, la expansión celular y la migración.

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Biología del Desarrollo

Aquí desarrollamos las herramientas necesarias...

Ex vivo de imágenes en vivo de las divisiones sola celda en ratón neuroepitelio

Fuente: Laboissonniere, et. al. Secuenciación de ARN unicelular de subconjuntos definidos de células ganglionares de la retina. J. Vis. Exp. (2017).  Este video muestra una técnica de trazado fluorescente para identificar subtipos de células ganglionares de la retina (RGC) en la retina de un ratón transgénico. El proceso consiste en asegurar la retina aislada en una cámara de registro, mantener la viabilidad celular con perfusión oxigenada y dirigirse a las RGC marcadas con fluorescencia...

Identificación de subtipos de células ganglionares de la retina de ratón mediante trazado fluorescente

Organización celular de los huesos craneofaciales mucho tiempo se ha planteado la hipótesis pero nunca visualizada directamente. Etiquetado de células multi-espectral y en vivo vivo   imágenes permite visualizar el comportamiento celular dinámico en el maxilar inferior del pez cebra. Aquí, detallamos el protocolo que manipulamos Zebrabow peces transgénicos y observamos directamente intercalación celular y los cambios morfológicos de los condrocitos en el cartílago de Meckel.

Visualización de condrocitos Intercalación y direccional proliferación a través de análisis celular clonal Zebrabow en el cartílago de la embrionaria Meckel

Describimos aquí un modelo de ratón reportero transgénico para visualizar las células productoras de IL-22 dentro de diferentes tejidos de ratón. Este método se puede utilizar para rastrear la ubicación de otras citocinas o proteínas secretaria en el ratón.

La visualización de IL-22 que expresan linfocitos utilizando ratones Reporter

Aquí, se presenta un protocolo para una técnica de etiquetado mosaico que permite la visualización de las neuronas derivadas de una célula progenitora común en dos colores distintos. Esto facilita el análisis de linaje neural con la capacidad de las neuronas individuales de nacimiento actualización y el estudio de la función de genes en las mismas neuronas de diferentes individuos.

Los análisis de linaje celular y el gen de Estudios de la función Uso MARCM Twin-situ

Este método describe el uso del modelo de ratón R26R-Confetti (Confeti) para estudiar tejidos mineralizados, cubriendo todos los pasos desde la estrategia de cría hasta las adquisiciones de imágenes. Se incluye un protocolo general que se puede aplicar a todos los tejidos blandos y un protocolo modificado que se puede aplicar a los tejidos mineralizados.

Rastreo Genético Clonal usando el ratón de confeti para estudiar tejidos mineralizados

Aquí se presenta una plataforma microscópica multifoto para imágenes de superficie ocular de ratón en vivo. El ratón fluorescente transgénico permite la visualización de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nerviosas y capilares dentro de la superficie ocular. Las señales no lineales de segunda generación armónica derivadas de estructuras de collagenounous proporcionan imágenes sin etiquetas para arquitecturas estromales.

Una plataforma de microscopía multifoto personalizada para imágenes en vivo de cornea de ratón y conjuntiva

Se presenta un protocolo para realizar el rastreo de linajes y el análisis genético funcional de genes candidatos a un solo nivel de células utilizando el análisis de mosaico con marcadores dobles (MADM). El análisis clonal de MADM proporciona un marco cuantitativo para medir el comportamiento proliferativo, la producción celular y la relación de linaje de los progenitores individuales y sus células hijas.

Seguimiento de linaje y análisis clonal en el desarrollo de la corteza cerebral mediante el análisis de mosaico con marcadores dobles (MADM)

La capacidad de marcar permanentemente las células madre y su progenie con un fluoróforo utilizando una línea de ratón de rastreo de linaje transgénico inducible permite el análisis espacial y temporal de la activación, proliferación, migración y / o diferenciación in vivo. El rastreo de linaje puede revelar información novedosa sobre el compromiso del linaje, la respuesta a las intervenciones y la multipotencia.

Rastreo de linaje de células madre inducibles marcadas fluorescentemente en el cerebro de ratón adulto

Aquí, proponemos tres métodos diferentes para dañar las fibras sensoriales que inervan la córnea. Estos métodos facilitan el estudio de la regeneración axonal en ratones. Estos tres métodos, adaptables a otros modelos animales, son ideales para el estudio de la fisiología de la inervación corneal y la regeneración.

Tres estrategias para inducir queratitis neurotrófica y regeneración nerviosa en la córnea murina

Aprende trazado de linaje multicolor en células epiteliales corneales usando ratones R26R-Confetti. Este método permite rastrear migración y supervivencia de células madre de forma no invasiva y con alta resolución.

Un método para Lineage Tracing de células corneales Uso de Multi-color de los ratones reportero fluorescente

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