Un método simple para la síntesis controlada de tamaño estables Clusters oligómeros de nanopartículas de oro bajo condiciones ambientales

El objetivo general de este procedimiento es producir agrupaciones oligoméricas de nanopartículas de oro, que sean: altamente estables, fáciles de derivatizar y tengan diámetros bien controlados mediante la reducción del ácido cloroáurico con tiocianato de sodio. Las partículas que hemos estado analizando hoy son partículas interesantes porque sus tamaños están muy bien controlados, y como resultado de ello, pueden utilizarse para estudiar la permeabilidad de membranas frente a partículas de diferentes tamaños. Dado que son muy estables en soluciones biológicas, esta es una propiedad muy potente de la partícula.

La principal ventaja de este método es que permite la síntesis bien controlada de oligoagregados de oro de alta calidad bajo condiciones de banco de laboratorio, y se puede realizar fácilmente con equipo de laboratorio estándar y un número limitado de reactivos. Después de preparar todas las soluciones necesarias según se indica en el protocolo escrito, inicie la síntesis con tiempo de retardo de oligoagregados de oro añadiendo 7 mililitros de la solución de borax a un frasco de vidrio limpio de 125 mililitros que contiene 59,5 mililitros de agua bajo agitación. A continuación, agregue 2,8 mililitros de la solución de cloruro de oro al frasco, lo cual inicia el tiempo de retardo que determina el tamaño de los oligoagregados.

Agregue 700 microlitros de la solución de tiocianato de sodio al frasco al final del período de retardo. Continúe agitando durante la noche para completar la síntesis de los oligoagregados. Al realizar este procedimiento, es importante agregar rápidamente cloruro de oro y solución de tiocianato de sodio a todos los reactivos en volúmenes más grandes de esta solución, utilizando dispensadores de boca ancha.

Para el crecimiento adicional, combine 10 mililitros de los oligoagregados de oro con 60 mililitros de la solución de cloruro de oro hidroxilado. A continuación, agregue 900 microlitros de la solución de tiocianato de sodio con agitación vigorosa. Deje agitando la mezcla durante la noche, hasta que la reacción se complete.

Antes de la derivatización, agregue 70 mililitros de los oligoclústeres crudos a un filtro centrífugo con un límite de corte de 30 kilodaltons y centrifugue durante 15 minutos a 3.000 × g. Recupere la muestra invirtiendo el filtro y centrifugando durante 3 minutos a 500 × g. Luego, mida el volumen recuperado con una micropipeta.

A continuación, agregue un volumen de GSH igual a un noveno del volumen recuperado de los oligoclústeres. Deje la reacción a temperatura ambiente durante no más de 10 minutos. Diluya los oligoclústeres derivatizados en 50 mililitros de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco para detener la reacción.

Luego, aplique los oligoagregados derivatizados a un filtro centrífugo con un punto de corte de 30 kilodalton y centrifugue durante 15 minutos a 3.000 × g. Finalmente, recupere la cinta retenida invirtiendo el filtro y centrifugando durante tres minutos a 500 × g. Almacene los oligoagregados derivatizados con glutatión a cuatro grados Celsius.

Para analizar los oligoagregados crudos mediante electroforesis en gel, mézclelos en una proporción de dos a uno con tampón de carga. Luego, cargue 30 microlitros de los oligoagregados en un gel precolado de gradiente de poliacrilamida. Corra el gel con tampón tris-glicina durante 26 minutos a 200 voltios.

Para la electroforesis en gel de oligoagregados derivatizados, primero dilúyalos en una proporción de uno a tres con agua. A continuación, diluya aún más los agregados en una proporción de dos a uno con tampón de carga. Cargue 10 microlitros de la mezcla de oligoagregados en un gel precolado de gradiente de poliacrilamida y luego corra el gel con tampón tris-glicina durante 26 minutos a 200 voltios.

Para analizar mediante microscopía electrónica de transmisión, lave 20 microlitros de oligoclústeres concentrados con 0,5 mililitros de agua y colóquelos en un filtro centrífugo de 0,5 mililitros con un límite de corte de 30 kilodalton. Centrifugue a 14.000 ×g durante 10 minutos. A continuación, retire el filtrado del tubo y resuspenda el retenido en 0,5 mililitros de agua.

Repita el lavado otras dos veces y luego diluya los oligoclústeres 500 veces con agua. Después de aplicar la descarga luminiscente a su rejilla recubierta de carbono, deposite 0,6 microlitros de los oligoclústeres sobre la rejilla y deje secar al aire durante 10 minutos. Finalmente, visualice los oligoclústeres utilizando una magnificación de 100.000 veces a 80 kilovoltios en el microscopio electrónico de transmisión.

El tamaño de los oligoagregados de oro, sintetizados utilizando los procedimientos de tiempo de retardo y adición, se analizó mediante electroforesis en gel. Las calles dos a cuatro del gel mostraron que el tamaño del agregado aumenta a medida que el tiempo de retardo se vuelve más largo. Las calles cinco a ocho confirman que el tamaño de los agregados también aumenta con la cantidad de oro hidroxilado utilizada durante el procedimiento de adición.

Se utilizó microscopía electrónica de transmisión para determinar los diámetros de las partículas de oligoclústeres. Los diámetros se calcularon tomando mediciones de imágenes de áreas de rejilla de 50 nanómetros por 50 nanómetros que contenían las partículas. Se graficó la relación entre el tiempo de retardo según el tamaño de las partículas y las cantidades añadidas de oro hidroxilado.

Estos datos se convirtieron luego en ecuaciones predictivas para los diámetros de las partículas en cada procedimiento. El método para obtener los agregados de oro, seguro que han comentado, depende de la hidroxilación del cloruro de oro en solución alcalina. Por lo tanto, cuanto mayor sea la hidroxilación, menos probable será la formación de un agregado de oro.

Mi nuevo libro aquí es el primero que me resulta interesante, porque es la primera vez que me doy cuenta de que el elemento tiempo de exposición a un medio alcalino podría utilizarse para controlar el tamaño de los agregados. Cuando se realiza correctamente, es posible sintetizar agregados de oro de tamaños entre tres y 70 nanómetros en menos de un día. Las nanopartículas resultantes son estables en tampones fisiológicos y en plasma, lo que las hace adecuadas para experimentos in vitro.

Los oligoagregados de oro descritos aquí tienen la ventaja adicional de poder concentrarse sin derivatización previa, lo que permite utilizar los agentes de radicación en volúmenes más pequeños.