Laser-captura microdisección de Human Prostática epitelio de Análisis de ARN

El objetivo general de este protocolo de microdisección de captura láser es aislar el ARN total de poblaciones puras de tipos de células epiteliales prostáticas a partir de tejidos prostáticos congelados heterogéneos para análisis posteriores de expresión génica. Este método puede ayudar a analizar muestras de pacientes y responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer de próstata, como cómo difiere la expresión de ARN en muestras de tejido protésico epitelial benigno y de enfermedad, o en muestras de ensayos clínicos. La principal ventaja de esta técnica es que la microdisección por captura láser permite el aislamiento de ARN de poblaciones homogéneas de células epiteliales o str a partir de tejido prostático congelado.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para adquirir ARN de alta calidad porque no saben qué pasos son críticos para mantener los ARN. Condiciones gratuitas Comience por reunir todos los reactivos y herramientas necesarios para el procedimiento. Después de permitir que el tejido prostático congelado se equilibre dentro del criostato durante 30 minutos, rocíe el medio de montaje en la parte inferior del casete y monte rápidamente el tejido con pinzas frías.

Coloque el casete en el enfriador del criostato durante cinco minutos para ajustar el medio de montaje. Una vez colocado, rocíe el medio de montaje congelado en el mandril y presione con cuidado el tejido montado en él. De abajo hacia arriba.

Deje que la preparación se asiente durante cinco minutos. Antes de colocar el mandril en el soporte, bloquee el mango en su posición e inserte una nueva cuchilla en el criostato. Después de desbloquear el mango, avance con cuidado la muestra hasta alcanzar la exposición de tejido deseada.

Cuando esté listo, ajuste el criostato a cinco micras y corte una o dos secciones. Coloque estas secciones en un portaobjetos de vidrio cargado para la tinción de hematina y eoína. Coloque inmediatamente el portaobjetos en etanol frío al 100% durante dos minutos.

Pasado este tiempo, retira el portaobjetos y déjalo secar a temperatura ambiente. El portaobjetos teñido con h y d proporciona una mejor visualización de las texturas nucleares y debe ser utilizado por el patólogo para marcar las áreas de interés. A continuación, coloque un marco de bolígrafo a temperatura ambiente.

Deslícelo en un soporte de marco, ajuste el criostato a 10 micras y cree secciones. Se pueden colocar de una a cuatro secciones en cada portaobjetos, dependiendo del tamaño del tejido. Sumerja inmediatamente la corredera en etanol 100% frío.

Retire el portaobjetos después de dos minutos y guárdelo en el congelador para su posterior análisis. El mismo día de la microdisección por captura láser, recupere los portaobjetos del marco del bolígrafo del congelador que trabaja en un área libre de ARN. Hidrate los portaobjetos sumergiéndolos suavemente en etanol al 90% durante dos minutos, luego en etanol al 75% durante dos minutos.

Una vez hidratado, tiñe el tejido de la próstata sumergiendo suavemente los portaobjetos en azul toine al 0,5% durante entre cinco y 30 segundos. Detenga el tejido lavando los portaobjetos dos veces en agua profunda durante 15 segundos, seguido de etanol al 75% durante 30 segundos a tres minutos. Por último, transfiera las correderas del marco del bolígrafo a un recipiente seco libre de ARN con hielo.

Antes de comenzar el procedimiento, coloque un portaobjetos para que se seque en un calentador de portaobjetos durante 15 minutos. Seque solo el portaobjetos que se procesará y guarde el resto en hielo hasta que lo necesite. Encienda los componentes de LCM en el siguiente orden.

La potencia del microscopio, la llave láser, el interruptor láser y, a continuación, el ordenador. A continuación, inicie el software de microdisección láser utilizando el software. Pida al microscopio que cargue los portaobjetos y los tubos de recolección.

Haga clic en descargar portamuestras y cargue el portaobjetos en el portaobjetos con el pañuelo hacia abajo. Inserte el portaobjetos en la ranura correspondiente del microscopio y haga clic en continuar. A continuación, haga clic en descargar tubos de recolección.

Etiquete y cargue los tubos en el soporte del tubo e insértelos en la ranura adecuada. Asegure las tapas y agregue 35 microlitros de tampón de lisis. Teniendo cuidado de evitar burbujas.

Una vez que se carguen los límites de colección, haga clic en Aceptar. Utilice el software para seleccionar la posición del portaobjetos en el soporte y, a continuación, seleccione la tapa de recolección para recoger la muestra. Visualice y enfoque la diapositiva a través de la computadora con un aumento de 10x.

Utilice el software para calibrar el láser seleccionando láser. Luego calibre, ajuste la apertura de potencia y la velocidad del láser seleccionando láser y luego controle. Continúe haciendo ajustes hasta que el láser corte completamente el tejido.

Es crucial delinear las áreas de interés que normalmente realiza un patólogo certificado por la junta para diseccionar con precisión las áreas deseadas del tejido sometido a LCM utilizando el marcado del patólogo de ocho por 11 h y e como guía visual. Utilice la herramienta de dibujo de forma en el software para circunscribir las áreas deseadas de epitelio en la vista y evitar acumular estroma. Haga clic en cortar para iniciar el láser.

Si un área no está completamente cortada, use la herramienta mover y cortar para repasarla manualmente. Continúe moviendo el objetivo a nuevas vistas y repita el corte láser hasta que el portaobjetos esté completamente diseccionado o se haya recolectado la cantidad deseada de tejido. Una vez finalizado, retire con cuidado los tubos del soporte de recolección y cierre las tapas teniendo en cuenta la lisis, el tampón y el tejido de las tapas.

Brevemente, centrifuga durante 30 segundos para recoger el líquido y el tejido en el fondo del tubo. Incubar las muestras a 42 grados centígrados durante 30 minutos y almacenarlas a menos 80 grados centígrados hasta que estén listas para el aislamiento del ARN. Estos ejemplos muestran secciones representativas de próstata teñidas con azul de toluidina en un portaobjetos de marco de pluma antes y después de la captura láser de controles específicos de tipo de células de epitelio benigno.

Confirmar la especificidad del área del tejido capturada por el láser. Epitelio y estroma benignos. No expresan el gen específico del cáncer de próstata, A-M-A-C-R.

El estroma no expresó el gen epitelial específico y KX 3.1 Al intentar este procedimiento. Es importante recordar que hay que trabajar en un entorno libre de ARN para evitar la degradación del ARN. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar ARN de poblaciones homogéneas de células epiteliales o de tormenta de tejido congelado para numerosas técnicas de análisis posteriores.

No olvide que trabajar con un criostato puede ser extremadamente peligroso en cuanto a las precauciones, como un buen entrenamiento y una muy buena atención a la cuchilla mientras se realiza este procedimiento.