Laser-captura microdisección de Human Prostática epitelio de Análisis de ARN
26 de noviembre de 2015
El objetivo de este protocolo es utilizar la microdisección de captura láser como un método eficaz para aislar poblaciones puras de tipos celulares de tejidos prostáticos heterogéneos para el análisis de ARN posterior.
El objetivo general de este protocolo de microdisección de captura láser es aislar el ARN total de poblaciones puras de tipos de células epiteliales prostáticas a partir de tejidos prostáticos congelados heterogéneos para análisis posteriores de expresión génica. Este método puede ayudar a analizar muestras de pacientes y responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer de próstata, como cómo difiere la expresión de ARN en muestras de tejido protésico epitelial benigno y de enfermedad, o en muestras de ensayos clínicos. La principal ventaja de esta técnica es que la microdisección por captura láser permite el aislamiento de ARN de poblaciones homogéneas de células epiteliales o str a partir de tejido prostático congelado.
Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para adquirir ARN de alta calidad porque no saben qué pasos son críticos para mantener los ARN. Condiciones gratuitas Comience por reunir todos los reactivos y herramientas necesarios para el procedimiento. Después de permitir que el tejido prostático congelado se equilibre dentro del criostato durante 30 minutos, rocíe el medio de montaje en la parte inferior del casete y monte rápidamente el tejido con pinzas frías.
Coloque el casete en el enfriador del criostato durante cinco minutos para ajustar el medio de montaje. Una vez colocado, rocíe el medio de montaje congelado en el mandril y presione con cuidado el tejido montado en él. De abajo hacia arriba.
Deje que la preparación se asiente durante cinco minutos. Antes de colocar el mandril en el soporte, bloquee el mango en su posición e inserte una nueva cuchilla en el criostato. Después de desbloquear el mango, avance con cuidado la muestra hasta alcanzar la exposición de tejido deseada.
Cuando esté listo, ajuste el criostato a cinco micras y corte una o dos secciones. Coloque estas secciones en un portaobjetos de vidrio cargado para la tinción de hematina y eoína. Coloque inmediatamente el portaobjetos en etanol frío al 100% durante dos minutos.
Pasado este tiempo, retira el portaobjetos y déjalo secar a temperatura ambiente. El portaobjetos teñido con h y d proporciona una mejor visualización de las texturas nucleares y debe ser utilizado por el patólogo para marcar las áreas de interés. A continuación, coloque un marco de bolígrafo a temperatura ambiente.
Deslícelo en un soporte de marco, ajuste el criostato a 10 micras y cree secciones. Se pueden colocar de una a cuatro secciones en cada portaobjetos, dependiendo del tamaño del tejido. Sumerja inmediatamente la corredera en etanol 100% frío.
Retire el portaobjetos después de dos minutos y guárdelo en el congelador para su posterior análisis. El mismo día de la microdisección por captura láser, recupere los portaobjetos del marco del bolígrafo del congelador que trabaja en un área libre de ARN. Hidrate los portaobjetos sumergiéndolos suavemente en etanol al 90% durante dos minutos, luego en etanol al 75% durante dos minutos.
Una vez hidratado, tiñe el tejido de la próstata sumergiendo suavemente los portaobjetos en azul toine al 0,5% durante entre cinco y 30 segundos. Detenga el tejido lavando los portaobjetos dos veces en agua profunda durante 15 segundos, seguido de etanol al 75% durante 30 segundos a tres minutos. Por último, transfiera las correderas del marco del bolígrafo a un recipiente seco libre de ARN con hielo.
Antes de comenzar el procedimiento, coloque un portaobjetos para que se seque en un calentador de portaobjetos durante 15 minutos. Seque solo el portaobjetos que se procesará y guarde el resto en hielo hasta que lo necesite. Encienda los componentes de LCM en el siguiente orden.
La potencia del microscopio, la llave láser, el interruptor láser y, a continuación, el ordenador. A continuación, inicie el software de microdisección láser utilizando el software. Pida al microscopio que cargue los portaobjetos y los tubos de recolección.
Haga clic en descargar portamuestras y cargue el portaobjetos en el portaobjetos con el pañuelo hacia abajo. Inserte el portaobjetos en la ranura correspondiente del microscopio y haga clic en continuar. A continuación, haga clic en descargar tubos de recolección.
Etiquete y cargue los tubos en el soporte del tubo e insértelos en la ranura adecuada. Asegure las tapas y agregue 35 microlitros de tampón de lisis. Teniendo cuidado de evitar burbujas.
Una vez que se carguen los límites de colección, haga clic en Aceptar. Utilice el software para seleccionar la posición del portaobjetos en el soporte y, a continuación, seleccione la tapa de recolección para recoger la muestra. Visualice y enfoque la diapositiva a través de la computadora con un aumento de 10x.
Utilice el software para calibrar el láser seleccionando láser. Luego calibre, ajuste la apertura de potencia y la velocidad del láser seleccionando láser y luego controle. Continúe haciendo ajustes hasta que el láser corte completamente el tejido.
Es crucial delinear las áreas de interés que normalmente realiza un patólogo certificado por la junta para diseccionar con precisión las áreas deseadas del tejido sometido a LCM utilizando el marcado del patólogo de ocho por 11 h y e como guía visual. Utilice la herramienta de dibujo de forma en el software para circunscribir las áreas deseadas de epitelio en la vista y evitar acumular estroma. Haga clic en cortar para iniciar el láser.
Si un área no está completamente cortada, use la herramienta mover y cortar para repasarla manualmente. Continúe moviendo el objetivo a nuevas vistas y repita el corte láser hasta que el portaobjetos esté completamente diseccionado o se haya recolectado la cantidad deseada de tejido. Una vez finalizado, retire con cuidado los tubos del soporte de recolección y cierre las tapas teniendo en cuenta la lisis, el tampón y el tejido de las tapas.
Brevemente, centrifuga durante 30 segundos para recoger el líquido y el tejido en el fondo del tubo. Incubar las muestras a 42 grados centígrados durante 30 minutos y almacenarlas a menos 80 grados centígrados hasta que estén listas para el aislamiento del ARN. Estos ejemplos muestran secciones representativas de próstata teñidas con azul de toluidina en un portaobjetos de marco de pluma antes y después de la captura láser de controles específicos de tipo de células de epitelio benigno.
Confirmar la especificidad del área del tejido capturada por el láser. Epitelio y estroma benignos. No expresan el gen específico del cáncer de próstata, A-M-A-C-R.
El estroma no expresó el gen epitelial específico y KX 3.1 Al intentar este procedimiento. Es importante recordar que hay que trabajar en un entorno libre de ARN para evitar la degradación del ARN. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar ARN de poblaciones homogéneas de células epiteliales o de tormenta de tejido congelado para numerosas técnicas de análisis posteriores.
No olvide que trabajar con un criostato puede ser extremadamente peligroso en cuanto a las precauciones, como un buen entrenamiento y una muy buena atención a la cuchilla mientras se realiza este procedimiento.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este protocolo describe el uso de la microdisección por captura láser para aislar poblaciones puras de tipos celulares epiteliales prostáticos a partir de tejidos prostáticos congelados heterogéneos. Este método facilita el análisis de ARN posterior, lo que contribuye a la investigación sobre el cáncer de próstata.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Oncología
Antecedentes
- La investigación sobre el cáncer de próstata requiere un análisis preciso de ARN a partir de tipos celulares específicos.
- Los tejidos heterogéneos complican el aislamiento de poblaciones celulares puras.
- La microdisección con láser ofrece una solución para la extracción de ARN de alta calidad.
- Comprender las diferencias en la expresión de ARN puede orientar las prácticas clínicas.
Objetivo del estudio
- Aislar ARN total de poblaciones puras de células epiteliales prostáticas.
- Analizar la expresión de ARN en tejidos benignos frente a tejidos enfermos.
- Mejorar la comprensión del cáncer de próstata mediante análisis de expresión génica.
Métodos Utilizados
- Técnica de microdisección por captura con láser.
- Aislamiento de ARN a partir de muestras de tejido prostático congelado.
- Pasos críticos para mantener la calidad del ARN durante el procedimiento.
- Uso de pinzas enfriadas y medio de montaje refrigerado para el manejo del tejido.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de ARN de alta calidad a partir de poblaciones celulares específicas.
- Capacidad para diferenciar los perfiles de expresión de ARN en diversas muestras de tejido.
- Demostración de la eficacia de la microdisección láser por captura en la investigación.
- Potencial para mejorar el análisis de especímenes de pacientes en ensayos clínicos.
Conclusiones
- La microdisección por captura con láser es una herramienta valiosa para la investigación del cáncer de próstata.
- El ARN aislado puede proporcionar información sobre los mecanismos de la enfermedad.
- Este método mejora la capacidad de estudiar eficazmente tejidos heterogéneos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microdisección por captura láser (LCM) permite el aislamiento preciso de poblaciones puras de células epiteliales prostáticas a partir de tejido heterogéneo, abordando directamente el sesgo estromal en los estudios de expresión génica. Esta capacidad mejora la confianza predictiva en la validación de dianas y apoya el descubrimiento robusto de biomarcadores para la investigación del cáncer de próstata. La integración del análisis de ARN derivado de LCM en las etapas iniciales de descubrimiento y traslación mejora la toma de decisiones en carteras al reducir la ambigüedad biológica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar la expresión génica específica de cada tipo celular en tejido prostático benigno frente a tejido enfermo.
- Apoya la validación funcional de objetivos mediante el aislamiento de poblaciones homogéneas de células epiteliales o estromales.
- Reduce las señales estromales confusas, aumentando la confianza predictiva en los hallazgos moleculares.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos al aclarar las contribuciones de cada tipo celular a los fenotipos de la enfermedad.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona muestras de ARN validadas para flujos de trabajo posteriores de RT-qPCR y RNAseq.
- Mejora la reproducibilidad del ensayo asegurando la homogeneidad de las muestras y reduciendo la variabilidad.
- Permite la estandarización de ensayos de expresión génica en especímenes clínicos y preclínicos.
- Apoya la evaluación confiable de compuestos mediante la vinculación de lecturas moleculares con poblaciones celulares definidas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Asocia perfiles de expresión génica con compartimentos epiteliales relevantes para la enfermedad, con fines de desarrollo de biomarcadores.
- Garantiza la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el mantenimiento de la especificidad por tipo celular.
- Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en datos moleculares sólidos y específicos por célula.
- Apoya la investigación traslacional al proporcionar ARN de alta calidad para el análisis de muestras en ensayos clínicos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El aislamiento de ARN basado en LCM se sitúa en la intersección entre el descubrimiento inicial, la validación de dianas y la investigación traslacional, permitiendo una progresión fluida desde la verificación de hipótesis hasta la evaluación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de la hipótesis nula mediante el aislamiento de poblaciones puras de epitelio o estroma para el análisis de expresión génica diferencial.
- Selección: Proporciona muestras cuantitativas y reproducibles de ARN para el desarrollo y validación de ensayos.
- Análisis: Ofrece lecturas moleculares de alta calidad para comparar condiciones de tejido benignas y patológicas.
- Investigación Traducional: Mantiene la relevancia patológica al alinear los resultados moleculares con compartimentos tisulares específicos.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo estandarizado para el análisis de ARN específico por tipo celular en múltiples estudios y programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, reproducibilidad y escalabilidad de los ensayos basados en ARN.
- Valor estratégico: Apoya decisiones informadas de avance o interrupción y una gestión eficiente del portafolio en términos de capital.
- Impacto en el portafolio: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de programas de descubrimiento y traslación.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de tejidos, operación de criostato y técnicas de preservación de ARN.
- Exige acceso a instrumentación de microdisección láser (LCM) e infraestructura para análisis de ARN.
- Necesita estandarización entre equipos para la preparación de muestras e interpretación de datos.
- Puede requerirse adaptación para diferentes tipos de tejidos o modelos de enfermedad.
- La integridad del ARN es altamente sensible al manejo y a las condiciones ambientales.
