Name: Laser-captura microdisección de Human Prostática epitelio de Análisis de ARN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprenda microdisección por captura láser para aislar ARN de poblaciones puras de células epiteliales prostáticas en tejidos congelados. Este método permite análisis de expresión génica en investigación del cáncer de próstata.

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Agradecemos a la Dra. Vicky Macias, Angeline Giangreco y Avani Vaishnav por su ayuda en la optimización de esta metodología a lo largo de los años y a Yang Zhang y al Dr. Jian Ma de la Universidad de Illinois en Urbana-Champaign por el análisis de secuenciación de ARN. Este trabajo fue financiado por NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) y una subvención de la Prevent Cancer Foundation (Zhou).

Todos los tejidos humanos utilizados para estos experimentos fueron adquiridas a través de un protocolo aprobado la Junta de Revisión Institucional y / o exención de la Universidad de Illinois en Chicago. 1. Sección fresco congelado de próstata en PEN-diapositiva y en Charged portaobjetos de vidrio <ol><li> El día anterior o unas horas antes de seccionar la muestra, limpie las herramientas (es decir, cepillo, fórceps, coplins, cuchillas, diapositivas enmarcadas-PEN (si no está ya RNasa libre), un marcador de ETOH seguro y un lápiz) y el interior de un criostato RT con una solución de RNasa descontaminar utilizando una botella de spray y de laboratorio-toallitas. <ol><li> Deje que la solución de RNasa descontaminar reposar por 5 minutos antes de limpiar de distancia, enjuague con DEPCH 2 0 para eliminar sobrantes solución y un enjuague final con EtOH al 70% (preparado con DEPCH 2 0) RNasa descontaminación. Nota: Es esencial para mantener un espacio de trabajo libre de RNasa. Todos coplins, herramientas, medios de montaje congelado, cuchillas y diapositivas utilizadas deben ser utilizados sólo para RNasa trabajo librey nunca se utiliza en un ambiente libre de norma no RNasa. Todos los instrumentos deben ser tratados con una solución de descontaminación RNasa antes de cada experimento. </li></ol></li><li> Enfriar criostato a -24 ° C. </li><li> Coloque los siguientes instrumentos gratuitas RNasa limpiadas dentro criostato para enfriar al menos 30 minutos antes de seccionar: Diapositiva Coplin llena con etanol al 100%, las herramientas, las pequeñas cintas de tejido congelado y el mandril de montaje. </li><li> Recuperar el tejido prostático congelado de almacenamiento criogénico y el lugar en un cubo de espuma lleno de hielo seco para el transporte. Coloque tejido en criostato equilibrar a criostato temperatura durante al menos 30 min. Nota: Los tejidos de la próstata humanos para láser captura micro-disección pueden ser fresco congelado o fijado en formol e incluido en parafina (FFPE). Las limitaciones de tiempo y la preparación de diapositivas son ligeramente diferentes entre las fuentes de tejido. Aquí se describen los pasos para secciones congeladas. </li><li> Trabajar con un tejido a la vez, y vierta medio de montaje congelado en el Bottom de la casete y rápidamente montar el tejido de la próstata congelado en el medio de montaje congelado usando las pinzas refrigeradas. </li><li> Coloque el casete con el tejido en enfriadores en criostato durante 5 min para establecer medio de montaje congelado. </li><li> Aplique una pequeña cantidad de medio de montaje congelado en el plato y presione con cuidado el lado inferior del tejido montada arriba en el medio de montaje congelado. Deje reposar en el criostato durante 5 min para permitir que el medio de montaje congelado se solidifique por completo. </li><li> Coloque tirada en el soporte y apriete. </li><li> Bloquear el mango en la posición de bloqueo y coloque una nueva cuchilla en el criostato. Para los puntos finales moleculares aguas abajo que incluyen una etapa de amplificación (es decir, qPCR), es aconsejable utilizar una cuchilla nueva para cada paciente para evitar la contaminación (o mover la hoja de más de utilizar el área de la cuchilla para la siguiente muestra). </li><li> Desbloquear el mango y avanzar cuidadosamente el tejido a mano o con un pedal de pie para igualar y exponer el tejido con 50 μm secciones hasta que la exposición de tejido deseado es alcanzado. </li><li> Ajuste criostato a 5 micras, cortar una o dos secciones y colocarlos en portaobjetos de vidrio cobrado por hematoxilina y eosina (H &amp; E) tinción (ver paso 2). </li><li> Coloque inmediatamente la diapositiva en el etanol frío al 100% durante 2 min. </li><li> Retire la lámina de vidrio cargada de etanol y dejar secar a temperatura ambiente antes de proceder a la tinción de H &amp; E (Paso 2). </li><li> Coloque RT diapositivas PEN-marco en un partidario marco. </li><li> Ajuste criostato a 10 secciones micras y lugar en las diapositivas de marco RT PEN. Uno a cuatro secciones pueden ser lugar en cada diapositiva dependiendo del tamaño del tejido. </li><li> Sumergirse inmediatamente la diapositiva en el etanol frío al 100% durante 2 min. </li><li> Retire las diapositivas PEN-frame a partir de etanol y almacenar el portaobjetos en una caja de portaobjetos en una caja en un desecador de -80 ° C congelador hasta el momento de LCM. Tres días es el tiempo máximo de almacenamiento para una recuperación óptima de ARN. </li><li> Continúe con el Paso 2 por sólo el vidrio cargada deslizómi. Continúe con el Paso 3 para diapositivas PEN-marco. </li></ol> 2. hematoxilina y eosina-Y (H &amp; E) de la mancha para histológico Mark-up Nota: Esto si por el tejido en el portaobjetos de vidrio cargada y no la diapositiva PEN-marco para LCM. <ol><li> Hidratar las secciones sobre el portaobjetos de vidrio cargada de inmersión la corredera a través de etanol clasificado como sigue: sumergir el portaobjetos dos veces en etanol al 100% durante 3 min, dos veces en etanol al 95% durante 3 min, una vez en etanol al 70% durante 3 min y dos veces en H2O destilada durante 3 min. <ol><li> Preparar la solución de alcohol de ácido: 99 ml 70% de etanol + 1 ml 1% de HCl y una solución de bicarbonato de sodio 0,1%: 0,1 g de bicarbonato sódico en 100 ml H 2 O destilada </li></ol></li><li> Sumerja el portaobjetos en hematoxilina Gill II (0,4%) durante 5 minutos. </li><li> Lavar el exceso de manchas en constante grifo abierto H 2 O durante 3 min. </li><li> Sumerja la diapositiva 10 veces en ácido alcohol </li><li> Lave la diapositiva en el funcionamiento del grifo H2O durante 3 min. </li><li> Sumerja el portaobjetosen una solución de bicarbonato de sodio al 0,1% durante 30 a 60 segundos para encender el color morado a azul. </li><li> Lave la diapositiva en el funcionamiento del grifo H2O durante 3 min. </li><li> Enjuague el portaobjetos en etanol al 95%, con 10 inmersiones. </li><li> Sumerja el portaobjetos en tiempos Eosina-Y 2-3 durante 15 segundos totales. </li><li> Deshidratar el portaobjetos a través de etanol clasificado como sigue: sumergir el portaobjetos dos veces en etanol al 95%, dos veces en etanol al 100%, y dos veces en xileno (asegúrese de que el tejido parece claro que indica la deshidratación a fondo). </li><li> Montar la diapositiva con no acuoso dura medio de montaje y la cubierta antideslizante permanente. </li><li> Deje que el portaobjetos seco durante 30 minutos. </li><li> Diapositiva Scan con cualquier escáner de diapositivas entera e imprimir una imagen de gran tamaño, de alta resolución en 8 &quot;x 11&quot; de papel. </li><li> Áreas Esquema de interés (generalmente realizadas por un patólogo certificado por el consejo) con un marcador. Este marcado es la guía para el procedimiento de LCM. </li></ol> 3. toluidina azul tinción de diapositivas PEN-frame Nota: Jes que se hace el mismo día de la LCM. Utilice DEPCH 2 O el agua para todas las soluciones. Completar todos los pasos en la zona libre de RNasa. Todos los coplins deben ser limpiados con una solución de RNasa descontaminar. <ol><li> El día de LCM eliminar las diapositivas PEN-marco de -80 ° C congelador y de hidratos de diapositivas que sumergen suavemente en el 90% de EtOH durante 2 minutos y luego 75% EtOH durante 2 min. <ol><li> Preparar 0,5% de azul de toluidina por disolución en agua de calidad para biología molecular luego filtrar esterilizar a través de un filtro de 0,2 micras y almacenar a TA. Esta solución puede ser reutilizado para hasta 6 meses. Nota: Es muy recomendable para preparar la solución antes de que la filtración puede tomar unos pocos horas. </li></ol></li><li> Manchar el tejido de la próstata mediante inmersión suavemente diapositivas en 0,5% de azul de toluidina para 5 a 30 seg. Destain el tejido se desliza por lavado 2 veces en DEPCH 2 O durante 15 segundos seguido de 75% de EtOH durante 30 segundos a 3 min. Nota: las manchas y destain veces se pueden ajustar para asegurar una buena tinción. Próstata tiende a más de mancha. </li><li&gt; Transferencia de diapositivas PEN-marco para recipiente seco ARNasa libre de hielo. </li></ol> 4. láser captura micro-disección (LCM) <ol><li> Inmediatamente antes de la LCM, tobogán seco en un calentador de portaobjetos a 42 ° C durante 15 min. Seco sólo la diapositiva que se procesa y almacena el resto en hielo hasta que esté listo para ellos. </li><li> Encienda el LCM y el ordenador en este orden, el poder del microscopio, la clave de láser, el interruptor láser y luego la computadora. Inicie el software Láser microdisección. </li><li> Utilice el software para controlar el microscopio para cargar los toboganes y tubos de recolección. Haga clic en &quot;soporte de muestra de descarga&quot;, cargue la diapositiva con las secciones en el soporte de portaobjetos de microscopio con el tejido hacia abajo e inserte el soporte de diapositivas en la ranura correspondiente en el microscopio, a continuación, haga clic en &quot;Continuar&quot;. <ol><li> Haga clic en &quot;tubos de recogida de descarga&quot;, etiqueta y cargar 0,5 ml tubos en soporte de tubo y la inserta en la ranura correspondiente en el instrumento. Una veztapas están asegurados, añadir 35 l de tampón de lisis a las tapas de recolección y tratar de evitar burbujas. Luego haga clic en &quot;Aceptar&quot;. Nota: Si la evaporación es un problema, diluir el tampón de la siguiente manera: tampón de lisis 25 l con 10 l depcH2O. </li></ol></li><li> En el software, seleccione la posición en la diapositiva se ha colocado en el soporte de diapositivas. Seleccione la tapa de recogida para recoger la muestra de LCM. </li><li> Visualice y enfocar la diapositiva a través del ordenador a 10X. Utilice el software para calibrar el láser mediante la selección de &quot;láser&quot; y luego &quot;calibrar&quot;. Ajustar la potencia, apertura y la velocidad del láser, la selección de &quot;láser&quot; y luego &quot;control&quot; para permitir que el rayo láser para cortar la zona seleccionada por completo y de manera eficiente. Repita los ajustes hasta que el láser corta completamente a través del tejido. </li><li> Utilizando el margen de ganancia patólogo 8 &quot;x 11&quot; como guía, utilice la herramienta de &quot;llamar la forma de&quot; circunscribir las áreas deseadas de epitheLium en la vista y evitar recoger cualquier estroma. Nota: Las zonas Se pueden seleccionar varios dentro de un punto de vista, pero no se mueven a otra vista sin antes cortar haciendo clic en la herramienta &quot;cortar la forma&quot;. <ol><li> Si un área no quede completamente aislada por el láser utilizar la función &quot;mover y cortar&quot; para repasar de forma manual. Continuar mover el objetivo a nuevos puntos de vista y repetir el corte por láser hasta corredera está completamente disecado o la cantidad deseada de tejido que se ha recogido (típicamente 100 glándulas benignas producen de 150-500 ng de ARN). (véase el ejemplo en la figura 1A). </li></ol></li><li> Retire con cuidado los tubos de la titular de la recolección y cerrar las tapas, siendo consciente del tampón de lisis y tejidos en las tapas. Centrifugar brevemente durante 30 segundos para recoger el líquido y el tejido en la parte inferior del tubo. Incubar las muestras a 42 ° C durante 30 minutos y se almacena a -80 ° C hasta que esté listo para el aislamiento de ARN. </li></ol> 5. Aislamiento de ARN total con un FilKit basado en ter y Análisis de la Calidad <ol><li> Descongelar los tubos en hielo y llevar el volumen de la solución a 100 l. </li><li> Pre-humedecer el filtro de micro de un kit de aislamiento de ARN mediante la aplicación de 30 l Solución ofLysis al centro del filtro y déjelo en remojo whileperforming los dos pasos siguientes (al menos 5 min). </li><li> Añadir 3 l de solución de LCM Aditivo (proporcionado en el kit) al lisado y mezclar mediante agitación durante 5 s. Centrifugar durante 30 segundos para recoger el fluido en la parte inferior del tubo. </li><li> Centrifugar el filtro pre-humedecida por unos 30 segundos a máxima velocidad para eliminar el líquido. </li><li> Añadir 1,25 volúmenes (en este caso 129 l) de etanol al 100% a la mezcla de lisado, suavemente vórtice o una pipeta de arriba abajo. ** Este método se recuperará ambas especies de ARN grandes y pequeñas. </li><li> Cargar la muestra sobre el filtro micro-pre mojada, y se centrifuga a 10.000 xg durante 1 min para unir el ARN al filtro. A continuación, lavar micro filtro con 180 l de &quot;solución de lavado 1, R21; centrifugar a 10.000 xg durante 1 min. Nota: A partir de ahora todas las centrifugaciones se debe hacer a 13.000 xg, o la velocidad máxima. </li><li> Filtro de lavado dos veces con 180 l de &quot;soluciones de lavado 2 y 3&quot;, respectivamente según las indicaciones del protocolo del kit. Centrifugar durante 30 segundos, a continuación, se descarta el flujo a través, y girar el filtro durante 1 min para eliminar el líquido residual y para secar el filtro. </li><li> Transferencia del filtro a un nuevo tubo de recogida. </li><li> Caliente la solución de elución a -95 ° C (suministrado con el kit). </li><li> Aplicar 10 l de solución de elución precalentado al centro del filtro, cerrar la tapa y almacenar durante 5 min a RT. Centrifugar a continuación durante 1 min para eluir el ARN, y repetir este paso una vez para dar ~ 20 l de ARN. </li><li> Realizar el tratamiento DNasa I durante 15 minutos a 37 ° C. </li><li> Cuantificar el ARN mediante el espectrofotómetro con la absorbancia a 260 nm. La relación de la densidad óptica a longitudes de onda de 260 nm y 280 nm se utiliza para evaluar la pureza deel ARN (ver Tabla 1) 15. </li></ol> Análisis de Expresión Génica 6. Nota: La expresión de genes de especies de ARN largos (como los ARNm y lncRNAs) se muestra en el paso 6.1 y especies de ARN cortas (como microRNAs) se muestra en el paso 6.2. Diferentes kits están disponibles para RT-qPCR y la cantidad de ARN requerido varía según el kit (tan poco como 10 ng). Análisis de secuenciación de ARN se describe en 6.3. <ol><li> Transcribir inversa (RT) del RNA a cDNA mezclando 5 l de 20 ng / l de muestra de ARN con 5 l de la mezcla maestra RT (tampón RT, dNTPs, cebadores aleatorios, enzima RT, inhibidor de RNasa). Se incuba la reacción durante 25 min a 25 ° C, a continuación, 120 min a 37 ° C y 5 min a 85 ° C. </li><li> Se diluye la reacción RT 1:10 con RNasa libre de agua y el uso de 2,5 l por 10 l de reacción qPCR con cebadores o conjuntos de cebadores / sondas para los genes de interés. Nota: Para facilitar el análisis de ARN parcialmente degradado Es aconsejable el uso de cebadores for amplicones más cortos (menos de 100 bp) 16. (Tabla 2B) <ol><li> Para el análisis de la expresión de microARN ejecutar la reacción de RT mezclando 5 l de 2-10 ng / l muestra de ARN con 5 l de la mezcla maestra RT. Nota: cada tecnología de detección de microRNA disponible comercialmente basado en la PCR requiere el uso de cebadores de RT de propiedad y específicas. </li></ol></li><li> Alternativamente o además de RT-PCR, utilizar la secuenciación de próxima generación (RNA-Seq o pequeño-RNA-Seq) para cuantificar las diferentes especies de ARN. Típicamente, utilice 500 ng de ARN para este procedimiento (Tabla 3) y llevar a cabo el método como se indica por el instrumento fabricante y detección. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Perfiles de expresión génica de muestras humanas puede ser un reto, no sólo por la calidad o cantidad de tejido disponible, sino también por las diversas entidades histológicas presentes en una muestra de tejido dado. Esto es particularmente difícil en la próstata en el que los tejidos benignos son en gran parte los tejidos del estroma y áreas de cáncer están desprovistos de estroma. LCM facilita la separación física de estroma prostático y ARN epitelio para una firma más precisa de los dos tipos diferentes de células <...

La glándula prostática es un tejido heterogéneo compuesto de epitelio secretor dispuestos en los acinos glandulares rodeado por estroma fibromuscular compuesto principalmente de músculo liso 1. El compartimiento epitelial está formado por cinco tipos de células diferentes, pero organizados: células basales, células secretoras, células neuroendocrinas, células de amplificación de tránsito y las células madre 2. En el cáncer de próstata (CaP), que surge de las células epiteliales luminales, el crecimiento de la adenocarcinoma provoca una disminución progresiva evidente del compartimiento del estroma 3. Por estas razones, las muestras de tejido tendrán claras diferencias en la proporción de estroma y el tipo de células epiteliales basado en la medida del CaP. Estas diferencias pueden conducir a suposiciones sesgadas de los datos de expresión de genes adquiridos de tejidos enteros sin tener en cuenta microdisección del tipo celular deseado. Por lo tanto, para eliminar este sesgo es esencial para separar los tipos de células antes de la extracción de RNA yanálisis de expresión génica. Macrodissection o microdisección se pueden utilizar para separar físicamente las zonas epiteliales bien caracterizados desde el estroma circundante 4 -6. Macrodissection se realiza típicamente con una hoja de afeitar bajo un microscopio de disección y funciona bien para la separación de gran CaP nódulos de estroma, pero no es capaz de eliminar el epitelio benigno del estroma circundante (véase el ejemplo de la histología benigna de la próstata en la Figura 1). Microdisección con láser (LCM) es significativamente más mano de obra que macrodissection, pero puede diseccionar de forma muy precisa el epitelio benigno 4. Publicaciones recientes de nuestro laboratorio han demostrado que el ARN se puede extraer con éxito por LCM ya sea de (FFPE) biopsias incluidas en parafina fijado en formol o tejido congelado 4,7-9. Los principales desafíos en la extracción de RNA son LCM-1) para diseccionar con precisión las áreas deseadas del tejido, y 2) para preservar RIntegridad NA durante el proceso de 4,10 LCM y el aislamiento. ARN aislado de poblaciones de células puras puede ser utilizado para el análisis de la expresión génica mediante varios métodos que incluyen transcripción inversa-PCR cuantitativa (RT-qPCR) 7,8, microarray 11, y profundo -sequencing 12-14. El objetivo de este protocolo es aislar ARN total de epitelio prostático LCM de tejido congelado para análisis de aguas abajo de la expresión génica.

<table><tbody><tr><td>RNasa-AWAY&nbsp;</td><td>MBP</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>PEN-membrana 4,0 mm correderas&nbsp;</td><td>Portaobjetos Leica</td><td>11600289</td><td></td></tr><tr><td>Glass, Superfrost Plus</td><td>FisherBrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>Decon labs.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>DEPC (pirocarbonato de dietilo)</td><td>Sigma</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Coplins (Frasco de tinción)</td><td>IHCWORLD</td><td>M900-12</td><td></td></tr><tr><td>Coplins (Gradilla de tinción)</td><td>IHCWORLD</td><td>M905-12</td><td></td></tr><tr><td>Aperio ScanScope</td><td>Aperio(Leica)</td><td>ScanScope&reg; </td><td></td>CS</tr><tr><td>Toluidina Azul</td><td>Fluka</td><td>89640-5G</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Microdisección Láser</td><td>Leica</td><td>LMD7000</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Tubos de pared delgada para LCM</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0350</td><td></td></tr><tr><td>ARNacuoso&reg;-Micro Kit de aislamiento de ARN total</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Marca NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorímetro</td><td>Life Technologies</td><td>Q32866</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Brand Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>Kit universal de síntesis de ADNc II, 8-64 rxns</td><td>Exiqon</td><td>203301</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan microRNA RT kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366597</td><td>Tinción de hematoxilina de la marca Thermo Fisher</td></tr><tr><td>Scientific&nbsp;</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3536-16</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Y</td><td>Richard Allan Scientific&nbsp;</td><td>7111</td><td></td></tr></tbody></table>

laser-captura microdisección de human prostática epitelio de análisis de arn

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

La glándula prostática contiene un entorno heterogéneo de tipos de células estromales, epiteliales, neuroendocrinas e inmunitarias. La próstata sana está compuesta por un estroma fibromuscular que rodea lúmenes secretores discretos con revestimiento epitelial y una población muy pequeña de células inmunitarias y neuroendocrinas. Por el contrario, las áreas de cáncer de próstata tienen un aumento del epitelio luminal displásico con una población estromal muy reducida o ausente. Dada la profunda diferencia entre los tipos de células estromales y epiteliales, es imperativo separar los tipos de células para cualquier tipo de análisis molecular posterior. A pesar de este conocimiento, la mayor parte de los estudios de expresión génica comparan la próstata benigna con el cáncer sin microdisección, lo que lleva a un sesgo estromal en las muestras benignas. La microdisección por captura láser (LCM) es un método eficaz para separar físicamente diferentes tipos de células de una sección de muestra. El objetivo de este protocolo es demostrar que el ARN puede aislarse con éxito del epitelio prostático humano recogido por LCM y utilizarse para estudios posteriores de expresión génica como RT-qPCR y RNAseq.

En un estudio previo se demostró el uso de LCM para recoger tejidos epiteliales y del estroma de comparar los perfiles de expresión por RT-qPCR de mRNA y microRNA de los tejidos de la próstata congelados y FFPE del mismo paciente 4. LCM es mucho tiempo, sobre todo si gran cantidad de ARN se percibirá para el análisis de secuenciación de próxima generación. Por lo tanto, es crucial para mantener el espacio de trabajo y las herramientas de RNasa libre. Se recomienda examinar los controles de calidad y célula-es...

El objetivo de este protocolo es utilizar la microdisección de captura láser como un método eficaz para aislar poblaciones puras de tipos celulares de tejidos prostáticos heterogéneos para el análisis de ARN posterior.

Laser-captura microdisección de Human Prostática epitelio de Análisis de ARN

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

El objetivo general de este protocolo de microdisección por captura láser es aislar ARN total de poblaciones puras de tipos celulares epiteliales prostáticos a partir de tejidos prostáticos congelados heterogéneos para análisis posteriores de expresión génica. Este método puede ayudar a analizar muestras de pacientes y responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer de próstata, como cómo difiere la expresión de ARN en muestras de tejido epitelial protésico benigno y patológico, o en muestras de ensayos clínicos. La principal ventaja de esta técnica es que la microdisección por captura láser permite el aislamiento de ARN de poblaciones homogéneas de células epiteliales o estromáticas a partir de tejido prostático congelado.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para obtener ARN de alta calidad porque no saben qué pasos son cruciales para mantener los ARN. Condiciones libres Comience reuniendo todos los reactivos y herramientas necesarios para el procedimiento. Después de permitir que el tejido prostático congelado se equilibre dentro del criostato durante 30 minutos, aplique medio de montaje en la base del casete y monte rápidamente el tejido utilizando pinzas frías.Coloque el casete en el enfriador del criostato durante cinco minutos para solidificar el medio de montaje. Una vez solidificado, aplique una gota del medio de montaje congelado sobre el portamuestras y presione cuidadosamente el tejido montado sobre él. Con el lado inferior hacia arriba.Deje reposar la preparación durante cinco minutos. Antes de colocar el portamuestras en el soporte, bloquee la manija en posición e inserte una cuchilla nueva en el criostato. Después de desbloquear la manija, avance cuidadosamente la muestra hasta alcanzar la exposición tisular deseada.Cuando esté listo, ajuste el criostato a cinco micrones y corte una o dos secciones. Coloque estas secciones sobre un portaobjetos de vidrio cargado para la tinción con hematina y eosina. Coloque inmediatamente el portaobjetos en etanol frío al 100 % durante dos minutos.Después de este tiempo, retire el portaobjetos y déjelo secar a temperatura ambiente. El portaobjetos teñido con hematoxilina y eosina proporciona una mejor visualización de las texturas nucleares y debe ser utilizado por el patólogo para marcar las áreas de interés. A continuación, coloque un marco de lápiz a temperatura ambiente.Coloque el portaobjetos en un soporte para portaobjetos, ajuste el criostato a 10 micrones y realice cortes. Se puede colocar de uno a cuatro cortes en cada portaobjetos, dependiendo del tamaño del tejido. Sumerja inmediatamente el portaobjetos en etanol frío al 100 %.Retire la portaobjetos después de dos minutos y guárdela en el congelador para su análisis posterior. En el mismo día de la microdisección con láser, retire las portaobjetos con marco de plumilla del congelador trabajando en un área libre de ARN. Hidrate las portaobjetos sumergiéndolas suavemente en etanol al 90 % durante dos minutos, luego en etanol al 75 % durante dos minutos.Una vez hidratado, tiña el tejido prostático sumergiendo suavemente las laminillas en azul de toína al 0,5 % durante entre cinco y 30 segundos. Detenga la tinción lavando las laminillas dos veces con agua destilada durante 15 segundos, seguido de etanol al 75 % durante 30 segundos a tres minutos. Por último, transfiera las laminillas con marco de pluma a un recipiente seco libre de ARN sobre hielo.Antes de comenzar el procedimiento, coloque un portaobjetos a secar sobre un calentador de portaobjetos durante 15 minutos. Sólo seque el portaobjetos que será procesado y guarde el resto en hielo hasta que sean necesarios. Encienda los componentes del LCM en el siguiente orden.Potencia del microscopio, la llave del láser, el interruptor del láser y luego la computadora. A continuación, inicie el software de microdisección láser utilizando el software. Indique al microscopio que cargue las portaobjetos y los tubos de recolección.Haga clic en descargar el soporte de muestras y coloque la portaobjetos en el soporte con el tejido mirando hacia abajo. Inserte el soporte de portaobjetos en la ranura correspondiente del microscopio y haga clic en continuar. A continuación, haga clic en descargar los tubos de recolección.Etiquete y cargue los tubos en el soporte de tubos e insértelos en la ranura correspondiente. Asegure las tapas y agregue 35 microlitros de tampón de lisis. Tenga cuidado de evitar burbujas.Una vez cargados los casquetes de recolección, haga clic en aceptar. Utilice el software para seleccionar la posición del portaobjetos en el porta, y luego seleccione el casquete de recolección para recoger la muestra. Visualice y enfoque el portaobjetos mediante la computadora con un aumento de 10 x.Utilice el software para calibrar el láser seleccionando láser. Luego calibre, ajuste la apertura de potencia y la velocidad del láser seleccionando láser y, a continuación, control. Continúe realizando ajustes hasta que el láser corte completamente el tejido.Es fundamental delinear las áreas de interés, tarea que normalmente realiza un patólogo certificado, para disecar con precisión las regiones deseadas del tejido sometido a microdisección láser (LCM), utilizando como guía visual la imagen histológica tinción hematoxilina y eosina (H y E) en formato 8 por 11 pulgadas. Utilice la herramienta de dibujo de formas en el software para delimitar las áreas deseadas del epitelio en la vista, evitando la recolección de cualquier estroma. Haga clic en cortar para iniciar el láser.Si un área no se ha cortado completamente, utilice la herramienta de movimiento y corte para repasarla manualmente. Continúe moviendo el objetivo hacia nuevas vistas y repita el corte con láser hasta que el portaobjetos esté completamente diseccionado o se haya recolectado la cantidad deseada de tejido. Una vez finalizado, retire cuidadosamente los tubos del soporte de recolección y cierre las tapas teniendo en cuenta la lisis, el tampón y el tejido presente en las mismas.En resumen, centrifugue durante 30 segundos para recoger el líquido y el tejido en el fondo del tubo. Incube las muestras a 42 grados Celsius durante 30 minutos y almacénelas a menos 80 grados Celsius hasta que estén listas para el aislamiento de ARN. Estos ejemplos muestran secciones representativas de próstata teñidas con azul de toluidina sobre un portaobjetos con marco de pluma antes y después de la captura láser de controles específicos del tipo celular epitelial benigno.Confirme la especificidad del área del tejido capturada con láser. Epitelio y estroma benignos. No expresan el gen específico del cáncer de próstata, A-M-A-C-R.El estroma no expresó el gen específico epitelial ni KX 3.1 durante el intento de este procedimiento. Es importante recordar trabajar en un ambiente libre de RNAsa para prevenir la degradación del ARN. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo aislar ARN a partir de poblaciones homogéneas de células epiteliales o del estroma a partir de tejido congelado para diversas técnicas de análisis posteriores.No olvide que trabajar con un criostato puede ser extremadamente peligroso; siempre se deben tomar precauciones, como una buena capacitación y una atención extrema a la cuchilla, mientras se realiza este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Cuantitativa de la polimerasa en tiempo real de reacción en cadena (PCR cuantitativa) es un método rápido y sensible para investigar los niveles de expresión de microARN (miRNA varias) moléculas en las muestras tumorales. El uso de este método de expresión de cientos de moléculas de diferentes miARN puede ser amplificada, cuantificado y analizado desde la misma plantilla de cDNA.

Detección de microARN en tumores de próstata por el cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR)

Retrovirus endógenos humanos (HERV), que ocupan 8% del genoma humano, conservan la capacidad de codificación de los escasos pero cien mil repeticiones terminales largas (LTRs). A Affymetrix microarray costumbre fue diseñado para identificar la expresión locus HERV individual y se utilizó en los tejidos de cáncer de próstata como una prueba de concepto para futuros estudios clínicos.

La identificación basada en microarrays de expresión individual HERV Loci: Aplicación al descubrimiento de biomarcadores en el cáncer de próstata

La expresión de genes de un subconjunto de células en un tejido específico representa un reto importante. En este artículo se describe cómo aislar el ARN total de alta calidad a partir de una población de células específicas mediante la combinación de un método immunolabeling rápida con láser captura microdissection.

Aislamiento de ARN a partir de células subpoblaciones específicas utilizando láser captura Microdissection Combinado con Rapid Immunolabeling

Aquí describimos un protocolo simplificado para análisis de expresión de microARN (miARN) en tejidos clínicos archivados de cáncer de próstata (PCa) fijados en formol, incluidos en parafina (FFPE) o congelados frescos que emplean PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR) e hibridación in situ (ISH).

Los análisis de expresión de miRNA en tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata

Aquí, describimos un protocolo para un microdissection de la captura del laser reproducible (LCM) para aislar la red trabecular (TM) para posteriores análisis de ARN. La capacidad de analizar los cambios en la expresión génica en el TM ayudarán en la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes de enfermedades oculares relacionadas con la TM.

Microdissection de la captura del laser de la malla Trabecular muy pura de ojos de ratón para análisis de expresión génica

El objetivo de este protocolo es obtener muestras de RNA de alta integridad de ganglios entéricos aislados del tejido intestinal humano no fijado, recién resecado usando el microdissection de la captura de láser (LCM). Este protocolo implica preparación de flash-congeladas muestras de tejido intestinal humano, cryosectioning, coloración etanólico y deshidratación, LCM y la extracción de RNA.

Optimización del Microdissection de la captura de láser para el aislamiento de los ganglios entéricos de tejido humano fresco congelado

Se desarrolló un protocolo de microdisección de captura láser (LCM) para obtener una cantidad suficiente de ARN de alta calidad para el análisis de la expresión génica en células óseas. El estudio actual se centra en las secciones del fémur del ratón. Sin embargo, el protocolo LCM reportado aquí se puede utilizar para estudiar la expresión génica en células de cualquier tejido duro.

Un protocolo de microdisección de captura láser que produce ARN de alta calidad a partir de huesos de ratón congelados

Este protocolo describe la microdisección de captura láser para el aislamiento del cartílago y el hueso de las secciones congeladas frescas del embrión del ratón. El cartílago y el hueso se pueden visualizar rápidamente mediante la tinción violeta de cresíl y se recogen con precisión para producir ARN de alta calidad para el análisis transcriptómico.

Microdisección de captura láser de cartílago embrionario de ratón y hueso para análisis de expresión génica

La resistencia a la terapia a menudo se desarrolla en pacientes con cáncer de próstata avanzado, y en algunos casos, el cáncer progresa a un subtipo letal llamado cáncer de próstata neuroendocrino. Evaluar los pequeños cambios moleculares no codificantes mediados por ARN que facilitan esta transición permitiría una mejor estratificación de enfermedades e identificación de mecanismos causales que conducen al desarrollo de cáncer de próstata neuroendocrino.

Secuenciación de ARN pequeño no codificante de tejidos fijos de formalina y exosomas derivados del suero de pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración

Describimos un protocolo para la microdisección láser de subsegmentos del riñón humano, incluyendo el glomérulo, tubérculo proximal, extremidad ascendente gruesa, conducto coleccionista e intersticio. A continuación, el ARN se aísla de los compartimentos obtenidos y se lleva a cabo la secuenciación de ARN para determinar los cambios en la firma transcriptómica dentro de cada subsegmento.

Aplicación de microdisección láser para descubrir transcriptómica regional en tejido renal humano

Este protocolo describe un método para aislar ARN de regiones histológicas definidas de tejido hepático de ratón incrustado en compuesto de paraformaldehído y compuesto de Temperatura Óptima de Corte mediante microdissección por captura láser, permitiendo un análisis dirigido de expresión génica posterior.

Microdisección por captura láser de tejido hepático de ratón fijado con paraformaldehído para análisis de ARN

Aprenda microdisección por captura láser para aislar ARN de poblaciones puras de células epiteliales prostáticas en tejidos congelados. Este método permite análisis de expresión génica en investigación del cáncer de próstata.

Laser-captura microdisección de Human Prostática epitelio de Análisis de ARN

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