Un Cancer Cell esferoide Ensayo para evaluar la invasión en un entorno 3D
20 de noviembre de 2015
Este método evalúa la invasión de células cancerosas desde esferoides a una matriz 3D circundante. Los esferoides se generan mediante el método de cultivo de gota colgante y luego se incrustan en una matriz compuesta por materiales de membrana basal y colágeno tipo I. Posteriormente, se monitorea la invasión de los esferoides.
El objetivo general de este ensayo de invasión de esteroides en células cancerosas es permitir el seguimiento de la invasión de células cancerosas desde un bolo celular hasta una matriz tridimensional circundante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología del cáncer, como la identificación de afecciones que promueven o inhiben la invasión celular. La principal ventaja de esta técnica es que los diversos matices de cómo invaden las células se pueden evaluar in vitro en un entorno fisiológicamente más relevante.
Para comenzar, retire de la incubadora una placa cultivada que contenga células cancerosas adheridas. Lavar las celdas una vez con PBS y añadir 1,5 mililitros de 0,05% de EDTA. A continuación, incubar las células durante tres minutos a 37 grados centígrados.
Una vez que las células se han desprendido, pase las células tripas inizadas a través de una pipeta de cinco mililitros para generar una suspensión de una sola célula y, a continuación, añada 8,5 mililitros de medios de cultivo celular al matraz. Cuente la suspensión de células usando un contador de celdas. Diluya la suspensión celular a 500 a 1000 celdas por 20 microlitros.
En medio de cultivo, use una pipeta multicanal para formar gotas de 20 microlitros en la superficie interna de una tapa de plato de 10 centímetros En toda la pipeta, cinco filas de ocho gotas para un total de 40 gotas. A continuación, pipetee cinco mililitros de PBS estéril en el fondo del plato de 10 centímetros. Invierta con cuidado la tapa y colóquela en el plato de 10 centímetros.
A continuación, incubar los cultivos de gotas colgantes a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante un máximo de 72 horas para formar esteroides. Para generar la matriz 3D, se descongeló una alícuota de factor de crecimiento, solución de membrana basal reducida a cuatro grados centígrados durante la noche. Luego recoja los esteroides inclinando la tapa del plato de 10 centímetros para acumular las gotas.
Transfiera el medio a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros y deje el tubo durante 10 minutos para permitir que los OID se asienten en el fondo. A continuación, mezcle 100 microlitros de la solución de membrana basal descongelada con 100 microlitros de 2,3 miligramos por mililitro frío. Tipo una solución de colágeno en un tubo de centrífuga preenfriado de 1,5 mililitros.
Incubar la matriz extracelular o la mezcla de ECM en hielo. Pipetee 40 microlitros de esteroides de células cancerosas desde el fondo del tubo de centrífuga de 1,5 mililitros y combínelo con la mezcla de ECM, ahora pipetee 40 gotas de microlitros de esta mezcla viscosa en el centro de pocillos individuales en una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Manteniendo la placa nivelada, colóquela en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados y déjela sin tocar durante 30 minutos.
Una vez que los cultivos 3D se hayan polimerizado, pipetee lentamente un mililitro de medio de cultivo celular tibio en cada pocillo para sumergir el cultivo. A continuación, devuelva los cultivos 3D a la incubadora utilizando una imagen de microscopio invertido, las células cancerosas invasoras. Usando el objetivo 20 x en puntos de tiempo predeterminados.
Incuba el plato a 37 grados centígrados. Entre los puntos de tiempo de obtención de imágenes para el análisis de datos, cuantifique la capacidad invasiva de las células utilizando un software de análisis de imágenes como Image J para determinar la distancia de la célula desde el borde del esferoide. Utilice la herramienta de dibujo recto para marcar el radio.
A continuación, haga clic en analizar en el menú superior, seguido de medir para mostrar la medida de longitud. Para determinar el área invasiva del esferoide, utilice la herramienta de dibujo a mano alzada para trazar el borde del esferoide y, a continuación, el área de las células invasoras. De nuevo, haga clic en analizar en el menú superior, seguido de medir para mostrar la medida del área.
Al probar un panel de líneas celulares cancerosas, se observó que la mayoría formaba esteroides utilizando el método de cultivo de gotas colgantes. Sin embargo, varias líneas celulares no pudieron formar esteroides cuando se utilizó este método de cultivo. Además, hubo variabilidad dentro del grupo de líneas celulares de cáncer formadoras de esferas con respecto a su capacidad para invadir la MEC circundante.
Estos datos se confirmaron visualmente con una invasión celular pronunciada a las 24 horas para varias de las líneas celulares probadas Una vez dominada, esta técnica se puede realizar con solo unas pocas horas de trabajo que ocurre en el transcurso de cinco días. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe trabajar rápidamente y evitar atrapar burbujas de aire en la mezcla que compondrá el cultivo 3D. Esta técnica se puede modificar para examinar el impacto de los fármacos, el cocultivo celular o los diferentes componentes de la MEC en la invasión de células cancerosas.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar y cuantificar la invasión de células cancerosas en un entorno 3D.
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Visión general
Este método evalúa la invasión de células cancerosas desde esferoides hacia una matriz 3D circundante. Los esferoides se generan mediante el método de cultivo de gota colgante y luego se incorporan en una matriz compuesta de materiales de membrana basal y colágeno tipo I. Posteriormente, se monitorea la invasión fuera de los esferoides.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología del cáncer
- Invasión celular
- Cultivo celular 3D
Antecedentes
- Este método permite monitorear la invasión de células cancerosas desde un bolo celular.
- Ayuda a identificar condiciones que promueven o inhiben la invasión celular.
- La técnica evalúa la invasión celular en entornos fisiológicamente relevantes in vitro.
- Utiliza una matriz 3D para un modelado realista del comportamiento de las células cancerosas.
Propósito del estudio
- Evaluar la dinámica de invasión de células cancerosas.
- Explorar factores que influyen en la invasión celular.
- Proporcionar información sobre los mecanismos de la biología del cáncer.
Métodos utilizados
- Retire un plato cultivado con células cancerosas adherentes de la incubadora.
- Lave las células con PBS y agregue 1.5 mililitros de tripsina EDTA al 0.05%.
- Incube las células durante tres minutos a 37 grados Celsius.
- Incorpore los esferoides en una matriz de materiales de membrana basal y colágeno tipo I.
Principales resultados
- Monitoreo exitoso de la invasión de células cancerosas desde esferoides.
- Evaluación de la invasión en condiciones controladas.
- Información sobre los mecanismos del comportamiento de las células cancerosas.
- Identificación de posibles objetivos terapéuticos.
Conclusiones
- El método proporciona una forma confiable de estudiar la invasión de células cancerosas.
- Mejora la comprensión de la biología del cáncer.
- Estudios futuros pueden basarse en esta técnica para el desarrollo terapéutico.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Assessing cancer cell invasion in a physiologically relevant 3D environment improves predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. This assay enables evaluation of invasion dynamics under controlled conditions, supporting early discovery decisions about compounds or genetic modifiers that influence metastatic potential. The method provides a scalable, reproducible platform for prioritizing therapeutic candidates based on functional invasion phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying cancer cell egression from spheroids into a 3D matrix.
- Operational Value: Enables functional validation of targets or pathways implicated in invasion under biologically relevant conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying conditions that promote or inhibit invasion, reducing mechanistic ambiguity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated 3D invasion models for downstream compound or genetic screening campaigns.
- Operational Value: Standardizes spheroid formation and matrix embedding for consistent, quantitative invasion readouts.
- Scalability: Compatible with 24-well plate formats, enabling medium-throughput evaluation of invasion modifiers.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery invasion phenotypes to preclinical models by using disease-relevant ECM components.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of invasion metrics with potential translational biomarkers of metastatic potential.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying invasion changes in response to pathway inhibitors or microenvironmental modulators.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing functional invasion data that complements biochemical and phenotypic screens.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of invasion-promoting or -inhibiting conditions using quantifiable spheroid egression metrics.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs (invasion distance/area) for reliable compound evaluation in 3D contexts.
- Analytics: Enables image-based measurement of invasion radius and area, generating comparable data across conditions and time points.
- Translational Research: Connects invasion phenotypes to preclinical continuity through use of basement membrane and type I collagen matrices that mimic in vivo ECM.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable 3D invasion platform adaptable to multiple cancer types, co-cultures, or ECM modifications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by linking genetic or pharmacological perturbations to functional invasion outcomes.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized hanging drop spheroid formation and controlled matrix polymerization.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of invasion-related targets before significant investment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds or conditions that significantly alter invasion phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture techniques, including hanging drop spheroid generation and ECM handling.
- Depends on access to inverted microscopes and image analysis software (e.g., ImageJ) for quantifying invasion metrics.
- Necessitates standardization of spheroid size and matrix composition across wells for reproducible invasion measurements.
- Requires optimization for different cancer cell lines, as spheroid formation efficiency varies in hanging drop cultures.
- Limited by the need to avoid air bubbles during ECM-spheroid mixing, which can disrupt 3D culture integrity and invasion readouts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:34
Formation of Cell Spheroids by Hanging Drop Culture
2:01
Embedding Spheroids in a Three-dimensional (3D) Matrix
3:38
Analyzing Spheroid Cell Invasion
4:19
Results: Sphere Forming and Invasive Abilities in a Cancer Cell Line Panel
4:51
Conclusion
