Murino fibroblastos dérmicos aislamiento por FACS

El objetivo general de este procedimiento es aislar los fibroblastos mediante FACS, renunciando así al cultivo in vitro, que se ha demostrado que causa un cambio fenotípico en estas células. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología del desarrollo y la cicatrización de heridas, como cómo identificar los subtipos de fibroblastos involucrados en la cicatrización y la fibrosis. La principal ventaja de esta técnica es que se evitan los experimentos in vitro como adherencia al plástico, masculino al fenotipo del fibroblasto.

Este método no solo puede proporcionar información sobre los fibroblastos dérmicos, sino que también se puede aplicar a otros sistemas, como los fibroblastos peritoneales y las adherencias abdominales. Comienza afeitando y depilando la piel dorsal del ratón de interés. A continuación, sumerja el ratón desnudado en etanol al 70% y coloque el animal sobre una superficie limpia y estéril para que se seque.

A continuación, empezando por la base de la cola, utiliza unas pinzas para cubrir la piel y haz un corte transversal con unas tijeras de disección. Luego, disecciona a lo largo del plano suprafascial para recolectar el tejido dorsal. Cuando se haya extraído un trozo de piel de 60 por 100 milímetros, use el borde romo de un bisturí para eliminar con cuidado la grasa subcutánea.

Luego, enjuague la piel cosechada en betadine, seguido de cinco lavados de PBS con hielo. Con hojas de afeitar y tijeras de disección, pique los trozos de dermis en un plato estéril hasta que las muestras tengan un tamaño uniforme de aproximadamente dos a tres milímetros. A continuación, transfiera fragmentos de tejido de hasta cinco ratones al número adecuado de tubos cónicos individuales de 50 mililitros que contengan 20 mililitros de colagenasa 4 en dmem.

Agite las muestras vigorosamente a 37 grados centígrados. Después de una hora, transfiera los tubos a una capucha estéril y pase las ráfagas de tejido a través de una jeringa innecesaria de 10 mililitros de tres a cinco veces. Regrese las muestras al agitador durante otros 30 minutos, seguido de otras tres a cinco pipetas con una jeringa de 10 mililitros.

Luego, filtre las muestras a través de un colador de 100 micras en un nuevo tubo de 50 mililitros y lave la malla con 20 mililitros de dmem, suplementado con FBS para llevar el volumen total hasta 40 mililitros. A continuación, gire las células hacia abajo y utilice una pipeta de vidrio estéril para aspirar la capa superior de grasa. Una vez eliminados los sitios adiposos contaminantes, utilice una pipeta de vidrio nueva para eliminar el resto del sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos en 20 mililitros de dmem más FBS.

Ahora, filtre las células a través de un colador de 75 micras y enjuague la malla con 10 mililitros de dmem más FBS. A continuación, vuelve a girar las células y retira la grasa y el sobrenadante como se acaba de demostrar. Vuelva a suspender el pellet en 20 mililitros de tampón FACS, reservando una alícuota de cinco mililitros para el control sin manchas.

Luego, centrifuga la muestra restante, desecha el sobrenadante y coloca la bolita en hielo. Para aislar los fibroblastos por FACS, vuelva a suspender los gránulos en 500 microlitros de mezcla de incubación de anticuerpos de linaje en hielo. Después de 20 minutos, mezcle suavemente cinco mililitros de tampón FACS, suplementado con DNasa con las células y gírelas.

Lave el pellet en un segundo cinco mililitros de DNasa. A continuación, resuspender las células en 500 microlitros de tampón FACS y DNasa, reservando una alícuota de 50 microlitros de células para el control del colorante de viabilidad. Finalmente, agregue tinte de viabilidad a la muestra restante y clasifique las celdas de acuerdo con el diagrama.

El uso de un enfoque de agotamiento negativo del linaje en lugar de un enfoque de selección positiva evita la preselección para subpoblaciones particulares. El análisis de microarrays de transcriptoma pull revela que los fibroblastos cultivados aislados por las metodologías de cosecha viva y explante de tejido tienen un alto grado de similitud a nivel de todo el transcriptoma con un coeficiente de correlación producto-momento de Pearson de 0,92. En comparación, los fibroblastos cultivados difirieron significativamente de un fibroblasto vivo recolectado sin cultivar, lo que establece la importancia de analizar los fibroblastos vivos recolectados sobre los fibroblastos cultivados.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del desarrollo y la cicatrización de heridas confirmaran la heterogeneidad de los fibroblastos e identificaran las subpoblaciones responsables de las cicatrices y otras formas de fibrosis.