Name: Lateral sistema inducible Raíz en Arabidopsis Y maíz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprende el sistema inducible de raíces laterales para estudiar el desarrollo radicular en Arabidopsis thaliana y maíz mediante tratamientos hormonales sincronizados.

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Los autores agradecen a Davy Opdenacker por su asistencia técnica y fotografía. Agradecemos enormemente a la Dra. Annick Bleys por sus útiles sugerencias para mejorar el manuscrito. Este trabajo ha sido financiado por el Programa Interuniversitario de Polos de Atracción IUAP P7/29 'MARS' de la Oficina Federal de Política Científica de Bélgica, por la beca FWO G027313N y por la Agencia para la Innovación por la Ciencia y la Tecnología, IWT (IR).

1. Arabidopsis Protocolo LRIS Nota: El texto se refiere a &quot;pequeños&quot; o &quot;grandes&quot; experimentos a escala. Experimentos a pequeña escala, tales como el análisis de línea de marcador y la tinción histológica 6, 14, requieren sólo unas pocas muestras. Experimentos a gran escala, tales como cuantitativa en tiempo real QRT-PCR, micro-arrays 9-11 o de secuenciación de RNA, requieren una mayor cantidad de muestras. Como tal, una cantidad de ~ 1000 plántulas por muestra fue utilizado por Vanneste et al. 11 para realizar microarray experimento después de la disección segmento de raíz. DÍA 1 <ol><li> Esterilización de semillas de Arabidopsis Nota: Seleccione uno de los siguientes procedimientos para la esterilización de semillas. Cualquiera de ellos es adecuado para los siguientes pasos del protocolo. Esterilización de gas (1.1.2) presenta dos ventajas principales sobre la esterilización de líquidos (1.1.1): se tarda menos tiempo en el manejo de una gran entumecidaer de semillas, ya que ninguna de pipeteo tiene que ocurrir para las muestras individuales; y las semillas esterilizadas se pueden almacenar durante un período más largo. Sin embargo, requiere un desecador y un manejo cuidadoso. <ol><li> La esterilización de líquidos <ol><li> Vierta la cantidad deseada de semillas en tubos de microcentrífuga. Utilice un máximo de 20 mg (~ 800 semillas) en un tubo de 1,5 ml o 40 mg (~ 1600 semillas) en unos 2 ml tubos de microcentrífuga. </li><li> Añadir 1 ml de etanol al 70%. Invertir o agite suavemente durante 2 min. </li><li> Sustituir el 70% de etanol con 1 ml de solución de esterilización para 15 min. (Preparar la solución de esterilización fresca: 3,85 ml de hipoclorito de sodio (NaOCl) stock (12%) (PRECAUCIÓN: El uso de humos campana), 5 l de Tween 20, hasta 10 ml con agua invertir los tubos varias veces para asegurarse de que todas las semillas vienen. en contacto con la solución. </li><li> En una cabina de flujo de aire laminar, sustituir la solución de esterilización con 1 ml de agua destilada estéril y enjuagar las semillas 5 veces durante 5 min por repetidaLy sustituir con 1 ml de agua destilada estéril fresco. </li></ol></li><li> Esterilización Gas <ol><li> Verter el número deseado de semillas en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Utilice tubos individuales cuando se trabaja con varias líneas independientes, y organizar los abrieron en una caja o soporte de plástico tubos de microcentrífuga. Si el número de semillas en un tubo excede 500 (12,5 mg), subdividir las semillas en el número apropiado de tubos para asegurar la esterilización exitosa. Asegúrese de que las tapas de los tubos vecinos no cubren unos a otros. Encajar la tapa de la caja en la parte inferior, ya que tiene que estar en el desecador, así como para la esterilización. </li><li> Coloque la caja en el plato de un desecador, junto con un vaso de vidrio (PRECAUCIÓN: El uso de humos campana). </li><li> Llenar el vaso de precipitados con 100 ml de 12% NaOCl (PRECAUCIÓN: Use campana extractora de gases). Ponga la tapa en el desecador, pero deja una pequeña abertura donde se coloca el vaso de precipitados. </li><li> Añadir 3 ml de ácido clorhídrico al 37% (furioso) (CAUCIÓN: Uso humos campana) al vaso de precipitados a través de la pequeña abertura y cierre rápidamente el desecador. La burbuja voluntad solución para algún tiempo debido a la formación de Cl 2 -gas. Deja el sistema cerrado O / N (o por lo menos 8 horas). </li><li> Retire la tapa del desecador. Saque la caja y cubrirlo con la tapa para evitar la contaminación durante el transporte. </li><li> Ponga la caja en una cabina de flujo laminar de aire, quitar la tapa y dejar las semillas durante aproximadamente 1 hora a RT para permitir la liberación de gas. Nota: Las semillas se pueden almacenar de forma segura en seco en tubos de microcentrífuga cerradas hasta por 2 semanas a 4 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> La inducción de raíz lateral en Arabidopsis <ol><li> Lateral Raíz Inhibición (NPA Personal) <ol><li> Preparar medio de crecimiento para el crecimiento in vitro. El medio contiene medio de Murashige y Skoog de ​​fuerza mezcla de sal 15, 0,1 g / L de mio-inositol, 10 g / L de sacarosa, y se tampona con 0,5g / L 2- (N-morfolino) etanosulfónico (MES). </li><li> Ajustar el pH a 5,7 con 1 M de KOH. Añadir 8 g / L de agar tejido de la planta y el medio en autoclave durante 20 min a 121 ° C. </li><li> Preparar una solución madre 25 mM de NPA en dimetilsulfóxido (DMSO) (PRECAUCIÓN: Use guantes). En una cabina de flujo de aire laminar, enfriar el medio en autoclave hasta aproximadamente 65 ° C (que es la temperatura a la que la botella se hace con la mano), y añadir 25 solución madre mM NPA para obtener una concentración final de 10 mM NPA. </li><li> Homogeneizar la adición agitando suavemente la botella durante 10 segundos. Verter 50 ml de medio por placa de Petri cuadrada (12 cm x 12 cm). Nota: En caso de experimento a gran escala, aplicar una malla de nylon (20 micras) para garantizar la transferencia fácil. Preparar una malla (9 cm x 9 cm) por tratamiento en autoclave (Figura 1A). Cuando autoclave, aplicar la malla al medio de crecimiento con unas pinzas estériles (Figura 1B). Empuje suavemente la malla para el medio de cultivo utilizando un sterilized drigalsky para asegurarse de que está en buen contacto con el medio de crecimiento (Figura 1B) (PRECAUCIÓN: El trabajo en condiciones estériles). </li><li> Siembre las semillas en los NPA placas. Nota: En caso de que se planea un experimento a gran escala, siembran 2 filas densas y bien alineados de 50 semillas para facilitar la toma de muestras (véase 1.2.2.3). <ol><li> En el caso de la esterilización líquido, sembrar las semillas en NPA placas utilizando una pipeta de 200 l. Corte 3 - 4 mm del final de las puntas de pipeteado en condiciones estériles (o antes de la esterilización de las puntas) con el fin de ser capaz de pipetear las semillas. Pipetear hacia arriba y abajo un par de veces para volver a suspender las semillas, a continuación pipetear agua aproximadamente 150 l estéril con 10 - 20 semillas y esperar hasta que el sedimento semillas en la parte inferior de la punta. (PRECAUCIÓN: El trabajo en condiciones estériles) Nota: Al tocar el agar o la malla suavemente con la punta, una gota de agua con una semilla se dará a conocer de ella (Figura 1C). </li> &lt;li&gt; En el caso de la esterilización por gas, sembrar las semillas usando autoclave toothpicks.Pinch el palillo de dientes en el agar antes de tomar las semillas para asegurar una superficie pegajosa. Recoge la semillas una por una con el palillo de dientes y distribuir las semillas en las placas (Figura 1D). Alternativamente, añadir agua estéril para las semillas y sembrar como se describe en 1.2.1.5.1 (PRECAUCIÓN: El trabajo en condiciones estériles). </li></ol></li><li> Sellar las placas con cinta adhesiva transpirable y almacenarlos placas a 4 ° C en la oscuridad durante al menos 2 días y un máximo de una semana. Esto es necesario para la estratificación y garantiza sincronizados y germinación más eficiente. Nota: Como alternativa, las semillas pueden ser estratificados antes de la siembra, se sumergieron en agua destilada en tubos micro-centrífuga, lo que requiere menos espacio en el refrigerador. En este caso, almacenar los tubos durante al menos una semana a 4 ° C, y se mueven las placas al gabinete crecimiento inmediatamente después de la siembra (véase 1.2.1.7). DÍA 3 </li&gt; <li> Mover las placas para el gabinete de crecimiento (luz continua (110 E · m -2 s -1), 21 ° C) durante 5 días (2 días de la germinación y 3 días de crecimiento) en una posición casi vertical (80 a 90 °) para garantizar el crecimiento de raíces en adelante, y no en el medio. DÍA 8 </li></ol></li><li> Lateral Raíz de inducción (NAA Personal) <ol><li> Preparar el mismo medio de crecimiento como se describe en 1.2.1.1 y 1.2.1.2. Preparar una solución de 50 mM balance de NAA en DMSO (PRECAUCIÓN: Use guantes). Enfriar el medio en autoclave a 65 ° C y añadir una solución NAA al medio para obtener una concentración final de 10 mM NAA (PRECAUCIÓN: El trabajo en condiciones estériles). <ol><li> Homogeneizar la adición agitando suavemente la botella durante 10 segundos. Verter 50 ml de medio por placa de Petri cuadrada (12 cm x 12 cm). </li></ol></li><li> La transferencia de los plantones de las placas que contienen medio de cultivo suplementado con 10 mM NPA a los supcomplementado con 10 mM NAA. <ol><li> Enganche los brazos de pinzas curvas debajo de los cotiledones de la plántula y retire suavemente de la placa. Sólo transferir plantas de semillero de la cual las raíces han crecido totalmente en contacto con el medio NPA-crecimiento y, preferiblemente, hacia abajo. </li><li> Rozar la raíz sobre la superficie del medio de crecimiento que contiene NAA-over una pequeña distancia. Asegúrese de que las raíces de las plantas están en buen contacto con el medio de crecimiento. Si es necesario, pulse la raíz suavemente a la superficie de medio de crecimiento con las pinzas. Nota: En caso de un experimento a gran escala, eliminar todas las plántulas que no están en contacto con la malla y la transferencia mediante el levantamiento de la malla en las dos esquinas superiores con unas pinzas. Asegúrese de que la malla está en buen contacto con el medio que contiene NAA-con una lectura rápida de la malla sobre la superficie del agar sobre una pequeña distancia (Figura 1E). </li></ol></li><li> Sellar las nuevas placas con cinta transpirable y colocarlos en el gabinete de crecimiento (conluz continua (110 E · m -2 s -1), 21 ° C) en posición vertical durante el tiempo deseado después de la inducción hasta el muestreo. Nota: En caso de un experimento a gran escala, el uso de un bisturí para cortar los segmentos de raíz todos a la vez directamente sobre la malla y probar ellos raspando suavemente la superficie de la malla. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. LRIS Protocolo Maíz <ol><li> Estratificación de maíz Núcleos <ol><li> Incubar los granos de maíz a 4 ° C en la oscuridad durante al menos 1 semana. Nota: Este protocolo se ha desarrollado utilizando la línea consanguínea B73 maíz. </li></ol></li><li> Esterilización de maíz Núcleos DÍA 1 Nota: Aunque las plántulas de maíz no tienen que ser cultivadas en condiciones estériles, se recomienda para esterilizar los granos de maíz y trabajar con material estéril para evitar el crecimiento de hongos en el rollo de papelsistema. <ol><li> Ponga el número necesario de granos de maíz en un vaso de precipitados de vidrio esterilizado. </li><li> Añadir 100 ml de solución de esterilización (6% NaOCl en agua) (PRECAUCIÓN: El uso campana de humos). </li><li> Añadir una barra de agitación magnética y colocar el vaso de precipitados sobre un agitador magnético a baja velocidad de agitación (aproximadamente 250 rpm) a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Enjuague cinco veces durante 5 min mediante la sustitución de la solución con 100 ml de agua estéril fresco. </li></ol></li><li> Siembra de maíz Núcleos <ol><li> Póngase los guantes para reducir el riesgo de contaminación, y tomar un rollo de toallas de papel. </li><li> Arranque dos tramos de papel de toalla de mano con una longitud total de dos hojas (aproximadamente 92 cm x 24 cm) y colocarlos en la parte superior de uno al otro en una superficie limpia (Figura 2). </li><li> Doblar las hojas dobles en toda la longitud (aproximadamente 92 cm x 12 cm) (Figura 2A). </li><li> Use pinzas para distribuir 10 núcleos en aproximadamente 2 cm de la parte superior sobre tque toda la longitud del papel, mientras se mantiene un espacio intermedio de 8 cm entre cada núcleo y 8 cm libre en ambos extremos (Figura 2B). Asegúrese de que la radícula del kernel esté hacia abajo y hacia el papel (Figura 2B). </li><li> Rodar suavemente el papel en toda la longitud, manteniendo las semillas en su lugar (Figura 2B). Para facilitar la rodadura, es opcional para pulverizar primero el papel con agua estéril. </li><li> Coloque los rollos de papel en tubos de vidrio esterilizados de unos 6 cm de diámetro y 14 cm de altura (por ejemplo, 250 ml tubos de centrífuga) y colocarlos en una rejilla (Figura 2C). </li></ol></li><li> La inducción de raíz lateral de maíz <ol><li> Preparar una solución de 50 mM NPA acciones (disuelto en DMSO) (PRECAUCIÓN: Use guantes). </li><li> Para cada tubo, hacer una solución NPA 50 M mediante la adición de 125 l de la solución madre mM NPA 50 a 125 ml de agua estéril en un vaso de vidrio esterilizado. </li><li> Mezclar bien yverter 125 ml de la solución 50 mM NPA sobre el rollo de papel en el tubo. El rollo de papel absorberá la solución y llegar a ser completamente empapado. Nota: Cuando se utiliza rollos de papel y tubos con otras dimensiones, ajustar el volumen en consecuencia. El líquido debe llegar hasta la mitad del tubo para asegurar una buena absorción. </li><li> Coloque el sistema de rollo de papel en un armario de crecimiento durante tres días (27 ° C, luz continua, humedad relativa del 70%). Asegúrese de que los rollos de papel quedan empapados añadiendo extra de solución 50 mM NPA, ya que la solución se evapora con el tiempo (Figura 2D). DÍA 4 </li><li> Preparar una solución de 50 mM NAA acciones (disuelto en DMSO) (PRECAUCIÓN: Use guantes). </li><li> Para cada tubo, preparar una solución de NAA 50 M mediante la adición de 125 l de las acciones mM NAA 50 a 125 ml de agua estéril en un vaso de vidrio esterilizado. </li><li> Apriete suavemente la mayor parte de la solución NPA restante de los rollos de papel y coloque elm en agua estéril durante 5 min para lavar a cabo (PRECAUCIÓN: Use guantes). Apriete suavemente la mayor parte del agua de los rollos de papel. Repita este paso de lavado tres veces. </li><li> Mezcle bien y vierta la solución NAA 50 M en los rollos de papel en los tubos. Asegúrese de que estén completamente empapados. </li><li> Coloque el sistema de rollo de papel en el gabinete de crecimiento (27 ° C, luz continua, 70% de humedad relativa) durante la duración deseada después de la inducción. </li></ol></li><li> La inducción de raíz lateral de raíces adventicias de la Corona de maíz Nota: El LRIS como se describe anteriormente induce raíces laterales en la raíz primaria. Sin embargo, en maíz y otros monocotiledóneas, la raíz primaria y las raíces seminales embrionarias, junto con sus raíces laterales, son principalmente importante durante el desarrollo de las plántulas. En una etapa posterior en el crecimiento de la planta, las raíces adventicias post-embrionarias surgen en el vástago y también desarrollan raíces laterales para formar un nuevo sistema de raíces 16. El LRIS también puede ser usod para inducir raíces laterales en estas raíces adventicias corona post-embrionarias siguiendo algunos ajustes menores a la LRIS en la raíz primaria embrionaria. <ol><li> Para hacer que los rollos de papel, crear un sándwich de papeles con respectivamente dos capas de papel toalla de mano en el lado exterior, y dos capas de papel dentro de la germinación. Coloca los granos esterilizados (vea los pasos 02.01 a 02.02) en entre las dos hojas de papel de germinación. Papel de germinación, en comparación con el papel toalla de mano, será menos propenso a ser penetrado por los pelos radiculares y raíces laterales, lo que hará la apertura de la rollos de papel más fácil después. Por otro lado, las dos capas externas de papel toalla de mano se facilitar la absorción del líquido. </li><li> Inserte los rodillos en 700 ml tubos de vidrio y verter agua estéril sin NPA sobre ellos. Asegúrese de que estén completamente empapados. </li><li> Germinar los granos esterilizados en el gabinete de crecimiento (véase el paso 2.4.9). </li><li> Crezca las plantas de semillero hasta las raíces adventicias de la coronacomenzar a surgir (6 días para B73). Asegúrese de que los rollos de papel se mantienen húmeda en todo momento mediante la adición de agua estéril cuando sea necesario. </li><li> Transferencia a una solución de 25 mM NPA durante 4 días (consulte los pasos 2.4.1 a 2.4.4), seguido de una inducción similar de la iniciación de la raíz lateral mediante la sustitución de la solución NPA con una solución NAA 50 mM después de una etapa de lavado (véase el paso 2.4 0.5 a 2.4.9). </li></ol></li></ol>

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<li>Martinez-de la Cruz, E., Garcia-Ramirez, E., Vazquez-Ramos, J. M., Reyes de la Cruz, H., Lopez-Bucio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxins+differentially+regulate+root+system+architecture+and+cell+cycle+protein+levels+in+maize+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Auxins differentially regulate root system architecture and cell cycle protein levels in maize seedlings.</a> J Plant Physiol. 176, 147-156 (2015).</li>
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<li>Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microgenomics%3A+genome-scale%2C+cell-specific+monitoring+of+multiple+gene+regulation+tiers%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Microgenomics: genome-scale, cell-specific monitoring of multiple gene regulation tiers.</a> Annu Rev Plant Biol. 64, 293-325 (2013).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En el protocolo de Arabidopsis LRIS, es importante sólo para transferir las plántulas que han crecido totalmente en contacto con el medio de crecimiento que contiene NPA. Esto asegura que la iniciación de la raíz lateral está bloqueado en toda la longitud de la raíz. A fin de evitar herir las plántulas durante la transferencia, los brazos de las pinzas curvas pueden ser conectados en virtud de los cotiledones de la plántula. Tras la transferencia, asegúrese de que las raíces de las plántulas están en suficiente...

El sistema radicular es crucial para el crecimiento de las plantas, ya que asegura el anclaje y la absorción de agua y nutrientes del suelo. Debido a la expansión de un sistema de raíces se basa principalmente en la producción de raíces laterales, su iniciación y la formación se han estudiado ampliamente. Raíces laterales se inician en un subconjunto específico de células pericycle, llamadas células fundadoras 1. En la mayoría de las dicotiledóneas, tales como Arabidopsis thaliana, estas células se encuentran en los polos protoxilema 2, mientras que en las monocotiledóneas, tales como maíz, que se encuentran en los polos del floema 3. Células fundadoras están marcados por un aumento de la respuesta auxina 4, seguido por la expresión de genes específicos del ciclo celular (por ejemplo, ciclina B1; 1 / CYCB1; 1), después de lo cual se someten a una primera ronda de divisiones anticlinales asimétricos 5. Después de una serie de divisiones anticlinales y periclinales coordinadas, se forma un primordio raíces laterales que finalmente emerger como un araíces laterales utonomous. La ubicación y el momento de la iniciación de las raíces laterales, sin embargo no son predecibles, ya que estos eventos no son ni abundantes ni sincronizada. Esto impide el uso de enfoques moleculares tales como la transcriptómica para estudiar este proceso. Para hacer frente a esto, un sistema lateral inducible Root (LRIS) se ha desarrollado 6, 7. En este sistema, las plántulas se tratan primero con N -1-naftilftalámico (NPA), que inhibe el transporte de auxina y la acumulación, en consecuencia, el bloqueo de la iniciación de las raíces laterales 8. Por posteriormente transferir la plántula al medio que contiene la auxina sintética ácido acético 1-naftaleno (NAA), toda la capa periciclo responde a los niveles de auxina elevadas de ese modo masivamente raíz iniciar divisiones celulares laterales inductores 6. Como tal, este sistema conduce a las raíces rápidos, síncronos y extensas iniciaciones laterales, permitiendo una fácil colección de muestras de raíces enriquecidos para una etapa específica en los últimos tiemposdesarrollo de las raíces ral. Posteriormente, estas muestras se pueden utilizar para determinar los perfiles de expresión de todo el genoma durante la formación de raíces laterales. El LRIS ha dado conocimiento ya significativa sobre la iniciación lateral raíces en Arabidopsis y maíz 9-13, pero la necesidad de aplicar este sistema a otras especies de plantas se hace más evidente a medida que más genomas se secuencian y hay un interés creciente para transferir conocimientos a económica importante especies. Aquí, se dan los protocolos detallados de la Arabidopsis y LRISs maíz. A continuación, se proporciona un ejemplo de la utilización del sistema, ilustrando cómo se pueden usar los datos obtenidos de la transcriptómica LRIS maíz para identificar homólogos funcionales que tienen una función conservada durante la iniciación de raíces laterales a través de diferentes especies de plantas. Por último, las directrices para optimizar la LRIS para se proponen otras especies de plantas.

<table><tbody><tr><td>ARABIDOPSIS LRIS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seeds</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis</td><td></td><td></td><td>seeds Col-0 ecotype</td></tr><tr><td>Esterilización por gas de semillas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microtubos de centrífuga 1,5 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 125.215</td><td>Eppendorf microtubos 3810X, PCR clean</td></tr><tr><td>micro-centrífuga tubos 2 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 120.094</td><td>Eppendorf Safe-Lock tubos de microcentrífuga</td></tr><tr><td>ácido clorhídrico</td><td>Merck KGaA</td><td>1.003.171.000</td><td>37% (humeante) para análisis EMSURE ACS,ISO,Reag. Desecador de vidrio Ph Eu</td></tr><tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitado</td><td></td><td></td><td></td>de vidrio</tr> Pyrex tubos <tr><td>de microcentrífuga de plástico caja o soporte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Esterilización con lejía de semillas</etanol fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Chem-Lab nv</td><td>CL00.0505.1000</td><td>Etanol, abs. 100% a.r. diluido al 70%</td></tr><tr><td>hipoclorito de sodio (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P1379</td><td></td></tr> agua <tr><td>estéril</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>medio de crecimiento</fuerte></td>Murashige y mezcla de sal de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skoog</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M0221-0050</td><td></td></tr><tr><td>mio-inositol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>sacarosa</td><td>VWR, Internation LLC</td><td>27483.294</td><td>D(+)-sacarosa Ph. Eur.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>1050211000</td><td>pellets para análisis (máx. 0,002% Na) EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Cultivo de tejidos vegetales Agar</td><td>LabM Limited</td><td>MC029</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Químicos de inducción de raíces laterales</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-naftilftalámico (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>Nº N0926.0250</td><td>10 y micro; M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>Ácido acético 1-naftaleno (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>Nº N0903.0050</td><td>10 y micro; M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>Fabricación de una malla para transferencia</malla ></td>nylon fuerte Prosep byba Malla de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> nylon sintético 20 &micro;<td></td><td> m</td></tr><tr><td>Manipulación de plántulas y </placas ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri cuadradas</td><td>fuertes GOSSELIN</td><td>BP124-05</td><td>12 x 12 cm</td></tr><tr><td>50 ml Tubos DURAN</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>CLS430304</td><td>Corning&nbsp; Tubos de centrífuga de 50 ml</td></tr><tr><td>drigalski</td><td>Carl Roth</td><td>K732.1</td><td></td></tr><tr><td>pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cortada puntas de pipeta</td><td>Daslab</td><td>162001X</td><td>Universal 200, corte 5 mm de punta antes de esterilizar en autoclave</td></tr><tr><td>cinta transpirable&nbsp;</td><td>Pinzas 3M Deutschland GmbH</td><td>n.º de cat. 1530-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Pinzas Dumont tipo a nr 5; Pinzas Dumont tipo e nr 7</td></tr><tr><td>condiciones de crecimiento</sala ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>crecimiento</td><td></td><td></td><td>fuerte 21 &deg; C, luz continua</td></tr><tr><td><fuerte>Materiales</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte</td><td>><fuerte>Catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte></td></tr><tr><td><fuerte>MAÍZ LRIS</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Semillas</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Granos de</td><td></td><td></td> maíz <td>B-73</td></tr><tr><td><fuerte>Esterilización con lejía de granos< / agitador magnético ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>vidrio</td><td></td><td></td><td></td></tr> fuerte<tr><td>&nbsp;</td><td>Fiers nv/sa</td><td>C267.1</td><td></td></tr><tr><td>hipoclorito de sodio (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>agua estéril</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>productos químicos de inducción de raíces laterales</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-naftilftalámico (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>Nº N0926.0250</td><td>50 y micro; M (raíz primaria de maíz), 25 y micro; M (raíz adventicia de maíz)</td></tr><tr><td>Ácido acético 1-naftaleno (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>Nº N0903.0050</td><td>50 y micro; M (maíz)</td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>Manipulación de plántulas y </toallas > mano de papel fuerte Kimberly-Clark</td> Professional*6681 SCOTT Toallas de Mano - Rollo / Blanco; Tamaño de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>la hoja (24 x 46 cm)</td></tr><tr><td>Papel de germinación de semillas</td><td>Anchor Paper Company</td><td></td><td>10 X 15 38# Papel de germinación de semillas</td></tr><tr><td>pinzas</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Pinzas Dumont tipo a nr 5; Pinzas Dumont tipo e nr 7</td></tr><tr><td>tubos de 250 ml (centrífuga)</td><td>SCHOTT DURAN</td><td>2160136</td><td>aprox. 5,6 cm de diámetro y 14,7 cm de altura&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de 700 ml</td><td>DURAN GROUP 213994609</td><td></td><td>cilindros, tubo de pie redondo, D 60&nbsp; x 250</td></tr><tr><td>rack</td><td></td><td></td><td>para tubos de maíz, hecho en casa</td></tr><tr><td>estéril</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td><condiciones > crecimiento fuerte</armario ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>crecimiento</td><td></td><td></td><td>fuerte 27 &deg; C, luz continua, 70% de humedad relativa</td></tr></tbody></table>

lateral sistema inducible raíz en<em&gt; arabidopsis</em&gt; y maíz

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

El desarrollo lateral de las raíces contribuye significativamente al sistema radicular y, por lo tanto, es crucial para el crecimiento de las plantas. Sin embargo, el estudio de la iniciación lateral de la raíz es tedioso, porque ocurre solo en unas pocas células dentro de la raíz y de manera impredecible. Para sortear este problema, se ha desarrollado un Sistema Inducible de Raíz Lateral (LRIS). Al tratar las plántulas consecutivamente con un inhibidor del transporte de auxinas y una auxina sintética, la iniciación lateral de la raíz altamente controlada ocurre sincrónicamente en la raíz primaria, lo que permite un muestreo abundante de una etapa de desarrollo deseada. El LRIS se desarrolló por primera vez para Arabidopsis thaliana, pero también se puede aplicar a otras plantas. En consecuencia, se ha adaptado para su uso en maíz (Zea mays). Se ofrece una descripción detallada de las diferentes etapas del LRIS en ambas plantas. La combinación de este sistema con la transcriptómica comparativa permitió identificar homólogos funcionales de los genes de iniciación de la raíz lateral de Arabidopsis en otras especies, como se ilustra aquí para la CICLINA B1; 1 (CYCB1; 1) Gen del ciclo celular en el maíz. Por último, se discuten los principios que deben tenerse en cuenta cuando se desarrolla un LRIS para otras especies vegetales.

Aplicación del LRIS a Realizar Transcriptómica comparativos del lateral Proceso Raíz Iniciación Una aplicación de la LRIS es la comparación y correlación de los perfiles de expresión génica durante la formación de raíces laterales en diferentes especies. Transcriptómica comparativos acerca a crear la posibilidad de identificar los genes ortólogos involucrados en el proceso de desarrollo de las raíces laterales...

El Sistema Inducible de Raíces Laterales (LRIS) permite la inducción sincrónica de raíces laterales y se presenta para Arabidopsis thaliana y maíz.

Lateral sistema inducible Raíz en<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Y maíz

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

El objetivo general del sistema inductible de raíces laterales es inducir de manera sincrónica la iniciación de raíces laterales en plantas mediante tratamientos hormonales. Las raíces de las plantas son estructuras ocultas y se sabe que son extremadamente difíciles de estudiar. Hemos desarrollado un sistema in vitro que permite estudiar el proceso de iniciación de raíces laterales a nivel citológico, histológico y molecular.Por lo general, los científicos nuevos en este método podrían tener dificultades porque las plantas no han crecido en contacto adecuado con el medio, lo que impide una inducción homogénea de las raíces laterales. La demostración visual de este método ayuda a mostrar los pasos críticos que deben tenerse en cuenta para garantizar una inducción homogénea. Aunque este sistema fue desarrollado originalmente en una pequeña planta, Arabidopsis, también puede aplicarse a otros sistemas como el maíz, el arroz o la cebada.Para comenzar, coloque una malla de nailon de 20 micrones sobre medio de crecimiento suplementado con NPA utilizando un par de pinzas estériles. Empuje suavemente la malla sobre el medio de crecimiento usando un drigalski para asegurarse de que tenga buen contacto con el medio. A continuación, presione una punta de hisopo estéril contra el agar para crear una superficie pegajosa en el hisopo.Utilice el palillo para distribuir uniformemente un lote de semillas esterilizadas con gas sobre las placas preparadas. Selle las placas con cinta adhesiva permeable y almacénelas a cuatro grados Celsius en la oscuridad durante al menos dos días y un máximo de una semana. Esto es necesario para la estratificación y asegura una germinación sincronizada y eficiente.El tercer día, traslade las placas a la sala de crecimiento para dos días de germinación seguidos por tres días de crecimiento a un ángulo de 80 a 90 grados. El día ocho, identifique las raíces que han crecido completamente en contacto con la malla y, por el contrario, las raíces que no están en contacto con la malla. Retire todas las plántulas cuyas raíces no estén en contacto con la malla.Transfiera las mallas que contienen plántulas a placas suplementadas con 10 micromolar de ANA. Una vez en la placa, pase suavemente la malla sobre la superficie del medio, si es necesario, para asegurar que tenga buen contacto con el medio de crecimiento. Para garantizar una inducción homogénea en todas las plántulas, es importante descartar aquellas plántulas que no han crecido en contacto con la malla en medio suplementado con ANP y pasar adecuadamente la malla, si es necesario, en medio suplementado con ANA.Selle las nuevas placas con cinta transpirable y colóquelas en la cámara de crecimiento en posición vertical durante el tiempo deseado después de la inducción. Cuando esté listo para recolectar las muestras, use un escalpelo para cortar los segmentos radiculares de una vez directamente sobre la malla y recójalos raspando suavemente la superficie de la malla. Ahora mostraremos algunos pasos del sistema inducible de raíces laterales en maíz.Comience por esterilizar los granos de maíz colocando primero la cantidad necesaria de granos en un vaso de vidrio estéril. Luego, agregue 100 mililitros de hipoclorito de sodio al 6% en agua al vaso y añada una barra de agitación magnética. Coloque el vaso en un agitador magnético y agite a baja velocidad durante cinco minutos a temperatura ambiente.Retire con cuidado la solución de lejía. Reemplácela con 100 mililitros de agua estéril fresca y enjuague los granos durante cinco minutos. Repita este paso cinco veces.Póngase un par de guantes y despegue dos trozos de toallas de papel para manos, colocándolos uno encima del otro sobre una superficie limpia. Luego, dóblelos por la mitad a lo largo. Utilice pinzas para distribuir 10 granos aproximadamente a dos centímetros desde la parte superior, a lo largo de toda la extensión del papel, manteniendo una distancia intermedia de ocho centímetros entre cada grano y dejando ocho centímetros libres en ambos extremos.Asegúrese de que el radical del grano esté orientado hacia abajo y en dirección al papel. Enrolle suavemente el papel a lo largo de su longitud, manteniendo las semillas en su lugar. Rociar el papel con agua estéril puede facilitar este paso si es necesario.Coloque los rollos en tubos de vidrio esterilizados y combine tubos adicionales en la rejilla. Vierta 125 mililitros de una solución de NPA 50 micromolar sobre el rollo de papel en el tubo. El rollo de papel absorberá la solución y se empapará completamente.Coloque el sistema de rollos de papel en un gabinete de crecimiento durante tres días. Asegúrese de que los rollos de papel permanezcan empapados durante la incubación agregando solución de NPA adicional según sea necesario. Para garantizar una inducción homogénea de la iniciación de raíces laterales, es importante verificar que los rollos de papel permanezcan humedecidos en la solución de NPA, pero que las raíces no queden sumergidas en el líquido mismo.Después de tres días en NPA, la plántula de maíz presenta un pequeño brote y una raíz de aproximadamente dos a tres centímetros. En el día cuatro, exprima suavemente la mayor parte de la solución de NPA restante de los rollos de papel y coloque los rollos en agua estéril hasta que se saturen. Después de aproximadamente cinco minutos, exprima suavemente la mayor parte del agua de los rollos de papel.Repita el paso de lavado tres veces. Después del último enjuague, elimine la mayor parte del agua exprimiendo y coloque nuevamente en el tubo. Vierta una solución de 50 micromolar de AAN sobre los rollos de papel en los tubos hasta que queden completamente empapados.Luego, coloque el sistema de rollo de papel en el gabinete de crecimiento durante el período deseado tras la inducción. En comparación con las plántulas de la línea marcadora de respuesta a oxinas pDR5-GUS que no han crecido en NAA o que han crecido durante una hora en NAA, las plántulas cultivadas durante dos horas en NAA muestran una respuesta a oxinas, que es uno de los primeros eventos que desencadena la iniciación de raíces laterales. Estas divisiones comienzan a desplazarse hacia arriba desde el ápice a partir de aproximadamente dos horas, y aumentan con una exposición prolongada a NAA.Mediante la línea marcadora del ciclo celular pCYCB1;1-Gus, se pueden observar las primeras divisiones celulares que conducen a la formación de raíces laterales a partir de aproximadamente seis horas después del inicio del tratamiento con NAA. Las micromatrices y la rt-PCR cuantitativa pueden utilizarse para evaluar la expresión de diversos genes en las diferentes regiones de las raíces de Arabidopsis y maíz durante la inducción de raíces laterales. Tanto en Arabidopsis como en maíz, cuando las plantas crecen durante un período más prolongado, las divisiones inducidas darán lugar al desarrollo y crecimiento de raíces laterales.Como prueba de concepto del sistema en maíz, aquí se muestran plántulas cultivadas bajo diferentes condiciones para su comparación. Las plántulas cultivadas durante 10 días en agua presentan raíces laterales que no iniciaron de forma sincrónica y están ampliamente espaciadas a lo largo del eje. Las plántulas cultivadas durante 10 días en NPA no contienen raíces laterales en absoluto.Las plántulas cultivadas durante tres días en NPA, seguidas de un tratamiento con AAN, muestran una inducción masiva y sincronizada de raíces laterales. En este video les hemos mostrado cómo configurar un sistema inducible de raíces laterales que ha resultado ser muy esencial en el descubrimiento de nuevos conocimientos fundamentales sobre el proceso de ramificación de raíces. Les hemos mostrado cómo funciona en Arabidopsis y maíz, pero puede adaptarse fácilmente a otras especies vegetales de elección.Buena suerte.

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Investigación

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Biology

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