Lateral sistema inducible Raíz en Arabidopsis Y maíz

El objetivo general del sistema inducible de raíces laterales es inducir sincrónicamente el inicio de raíces laterales en plantas mediante tratamientos hormonales. Las raíces de las plantas son las ocultas y se sabe que son extremadamente difíciles de estudiar. Hemos desarrollado un sistema in vitro que permite estudiar el proceso de iniciación de la raíz lateral a nivel citológico, histológico y molecular.

En general, los científicos nuevos en este método pueden tener dificultades porque las plantas no han crecido en contacto adecuado con el medio, lo que impide una inducción homogénea de las raíces laterales. La demostración visual de este método ayuda a mostrar los pasos críticos que se deben tener en cuenta para garantizar una inducción homogénea. Aunque este sistema se desarrolló originalmente en una pequeña planta Arabidopsis, también se puede aplicar a otros sistemas como el maíz, el arroz o la cebada.

Para comenzar, aplique una malla de nailon de 20 micras al medio de crecimiento suplementado con NPA con un par de pinzas estériles. Empuje suavemente la malla sobre el medio de crecimiento con un drigalski para asegurarse de que esté en buen contacto con el medio. A continuación, pellizca un palillo estéril en el agar para crear una superficie pegajosa en el palillo.

Use el palillo de dientes para distribuir uniformemente un lote de semillas esterilizadas con gas en los platos preparados. Selle las placas con cinta adhesiva transpirable y guárdelas a cuatro grados centígrados en la oscuridad durante al menos dos días y un máximo de una semana. Esto es necesario para la estratificación y garantiza una germinación sincronizada y eficiente.

Al tercer día, mueva las placas a la sala de crecimiento durante dos días de germinación seguidos de tres días de crecimiento en un ángulo de 80 a 90 grados. En el octavo día, identifique las raíces que han crecido completamente en contacto con la malla y, por el contrario, las raíces que no están en contacto con la malla. Retire todas las plántulas cuyas raíces no estén en contacto con la malla.

Transfiera las mallas que contienen plántulas a placas suplementadas con NAA de 10 micromolares. Una vez en la placa, frote la malla sobre la superficie del medio si es necesario para asegurarse de que esté en buen contacto con el medio de crecimiento. Para asegurar una inducción homogénea en todas las plántulas, es importante descartar las plántulas que no hayan entrado en contacto con la malla en un medio suplementado con NPA y desnatar adecuadamente la malla si es necesario en un medio suplementado con NAA.

Selle las nuevas placas con cinta adhesiva transpirable y colóquelas en la sala de crecimiento en posición vertical durante el tiempo deseado después de la inducción. Cuando esté listo para recolectar las muestras, use un bisturí para cortar los segmentos de raíz de una sola vez directamente en la malla y tome muestras raspando suavemente la superficie de la malla. Ahora mostraremos algunos pasos del sistema inducible de raíz lateral en el maíz.

Comience por esterilizar los granos de maíz colocando primero el número necesario de granos en un vaso de vidrio estéril. A continuación, añada 100 mililitros de hipoclorito de sodio al 6% en agua al vaso de precipitados y añada una barra agitadora magnética. Coloque el vaso de precipitados en un agitador magnético y remueva a baja velocidad durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Retira suavemente la solución de lejía. Reemplácelo con 100 mililitros de agua fresca estéril y enjuague los granos durante cinco minutos. Repita este paso cinco veces.

Ponte un par de guantes y arranca dos tramos de toallas de papel de mano, colocándolas una encima de la otra sobre una superficie limpia. Luego, dobla las hojas dos veces a lo largo. Use pinzas para distribuir 10 granos aproximadamente a dos centímetros de la parte superior, en toda la longitud del papel, manteniendo una distancia entre espacios de ocho centímetros entre cada grano y ocho centímetros libres en ambos extremos.

Asegúrate de que el radical del grano esté hacia abajo y hacia el papel. Enrolle suavemente el papel a lo largo mientras mantiene las semillas en su lugar. Rociar el papel con agua estéril puede facilitar este paso si es necesario.

Coloque los rollos en tubos de vidrio esterilizados y combine los tubos adicionales en la rejilla. Vierta 125 mililitros de una solución de NPA de 50 micromolares sobre el rollo de papel en el tubo. El rollo de papel absorberá la solución y se empapará por completo.

Coloque el sistema de rollos de papel en un armario de crecimiento durante tres días. Asegúrese de que los rollos de papel permanezcan empapados durante la incubación agregando solución adicional de NPA según sea necesario. Para asegurar una inducción homogénea de la iniciación lateral de la raíz, es importante comprobar que los rollos de papel permanezcan hidratados en solución de NPA, pero que las raíces no estén sumergidas en el propio líquido.

Después de tres días en NPA, la plántula de maíz tiene un brote pequeño y una raíz de aproximadamente dos a tres centímetros. Al cuarto día, exprima suavemente la mayor parte de la solución de NPA restante de los rollos de papel y coloque los rollos en agua estéril hasta que se saturen. Después de unos cinco minutos, exprima suavemente la mayor parte del agua de los rollos de papel.

Repita el paso de lavado tres veces. Después del enjuague final, exprima la mayor parte del agua y vuelva a colocarla en el tubo. Vierta una solución de 50 micromolares de NAA sobre los rollos de papel en los tubos hasta que estén completamente empapados.

A continuación, coloque el sistema de rollos de papel en el armario de crecimiento durante el tiempo deseado después de la inducción. En comparación con las plántulas de la línea marcador de respuesta de bueyes pDR5-GUS que no han crecido en NAA o han crecido durante una hora en NAA, las plántulas cultivadas durante dos horas en NAA muestran una respuesta de bueyes que es uno de los primeros eventos que desencadenan la iniciación de raíces laterales. Estas divisiones comienzan a ascender desde la punta a partir de aproximadamente dos horas y aumentan con la exposición prolongada al NAA.

Usando la línea marcador de ciclo celular pCYCB1; 1-Gus, las primeras divisiones celulares que conducen a la formación de raíces laterales se pueden ver a partir de aproximadamente seis horas después del inicio del tratamiento con NAA. Los microarrays y la rt-PCR cuantitativa se pueden utilizar para evaluar la expresión de varios genes en las diferentes regiones de las raíces de Arabidopsis y maíz durante la inducción lateral de la raíz. Tanto en la arabiosis como en el maíz, cuando las plantas crecen durante más tiempo, las divisiones inducidas darán lugar al desarrollo y crecimiento de raíces laterales.

Como prueba de concepto para el sistema de maíz, aquí se presentan plántulas cultivadas en diferentes condiciones para comparar. Las plántulas cultivadas durante 10 días en agua tienen raíces laterales que no se iniciaron sincrónicamente y están muy espaciadas a lo largo del eje. Las plántulas cultivadas durante 10 días en NPA no contienen raíces laterales en absoluto.

Las plántulas cultivadas durante tres días en NPA, seguidas de un tratamiento con NAA, muestran una inducción masiva y sincronizada de las raíces laterales. En este vídeo te hemos mostrado cómo montar un sistema de inducción de raíces laterales que ha resultado ser muy esencial en el descubrimiento de nuevos conocimientos fundamentales sobre el proceso de ramificación de raíces. Le hemos mostrado cómo funciona para Arabidopsis y maíz, pero se puede adaptar fácilmente a otras especies de plantas de elección.

Buena suerte.