Name: Modelo apical Resección ratón para el Estudio de la regeneración del corazón de mamíferos Temprana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Aprende la técnica de resección apical en ratones neonatos para estudiar la regeneración cardíaca temprana en mamíferos. Este método proporciona un enfoque directo para investigar los mecanismos moleculares y celulares de la reparación del corazón.

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Los autores agradecen a los Dres. James Hawkins, Zu-Xi Yu y Xuan Qu del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (NHLBI) por su ayuda con la cirugía del ratón y la preparación y tinción de secciones de parafina. Los autores agradecen a la Junta Editorial del NIH becarios por su asistencia editorial.

Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Programa de Uso y Cuidado de Animales de los Institutos Nacionales de Salud (NIH), con número de protocolo H0083R3. El NHLBI IACUC aprobó el protocolo sin analgésicos. 1. La hipotermia Anestesia en ratones recién nacidos <ol><li> Esterilizar esponjas y equipo quirúrgico en un autoclave antes de la cirugía. Prepare todos los materiales quirúrgicos y cambiar en un esterilizador de cuentas en caliente 15-20 minutos de antelación para llegar a 240 ° C a 270 ° C. </li><li> Transferir todas C57BL / 6 cachorros (edad P1) de su madre que amamanta a una jaula del ratón limpia con ropa de cama fresca y materiales de anidación. Una vez que los cachorros se toman en una sala de cirugía, realizar la cirugía apical rápidamente para reducir al mínimo el tiempo que pasan separados de la madre y para reducir el riesgo de canibalización materna. </li><li> Ponga las esponjas en una cama de hielo y luego se coloca una cría en la esponja para ~ 3 min para lograr la anestesia hipotermia. Confirmar la anestesia mediante la observación de apnea y acinesia y pellizcando un pie trasero. Compruebe el estado de los neonatos con frecuencia porque muy poco tiempo no hará que el akinetic crías y apnea, y una duración excesiva de la anestesia puede disminuir la tasa de supervivencia 12. </li></ol> 2. La toracotomía <ol><li> Traslado al cachorro del lecho de hielo en un área de mesa quirúrgica y utilizar la cinta para inmovilizar su brazos, las piernas y la cola en posición supina. </li><li> Desinfectar el pecho usando betadine y suavemente limpie con una almohadilla con alcohol al 70%. </li><li> Hacer una incisión en la piel transversal a lo largo de la zona sucesivamente intercostal de la cavidad torácica usando un Vannas resorte de tijera, y luego romos diseccionar los músculos intercostales adelante para facilitar el acceso al corazón. NOTA: Las tasas de supervivencia mejoran cuando la pérdida de sangre se reduce al mínimo durante el proceso quirúrgico. </li></ol> 3. La amputación quirúrgica del ventrículo del corazón Apex <ol><li> A mano, aplicar una suave presión sobre el abdomen para exteriorizar elápice del corazón. Absorber la sangre alrededor de la zona quirúrgica con bastoncillos de algodón estériles para la visualización clara. Para los recién nacidos de control con operación simulada, vaya directamente al paso 4 (de sutura y la recuperación de los ratones). </li><li> Bajo una lámpara de aumento y el uso de iridectomía tijeras, realice suavemente resección fragmentaria del ventrículo izquierdo (VI) hasta que la cámara LV está expuesto. Tenga cuidado para minimizar las porciones resecados del LV. Aproximadamente el 15% de la resección es necesaria para lograr una exposición óptima de la cámara LV. </li><li> Asegúrese de que el corazón vuelve a la cavidad del pecho una vez que se expone la cámara de LV. </li></ol> 4. Sutura y Recuperación de ratones <ol><li> Suturar las costillas y músculos juntos para sellar la cavidad torácica mediante suturas Proline 6-0 estériles y cierre con cuidado el lugar de la incisión de la piel con pegamento de la piel. </li><li> Calentar el recién nacido bajo una lámpara de calor para ~ 3 min de recuperación, y luego limpiar la sangre y los restos de pegamento utilizando una almohadilla con alcohol 70% antre reintroducir a sus compañeros de camada. Trata de completar todo el procedimiento quirúrgico dentro de los 10 minutos debido a que minimiza el tiempo separado de la madre mejora la supervivencia de las crías después de la resección apical. </li><li> Después de cada cirugía, colocar las herramientas quirúrgicas en contacto con los talones del esterilizador de cuentas caliente durante aproximadamente 20 segundos para la esterilización completa. Permita que las herramientas quirúrgicas se enfríen a temperatura ambiente antes de cada cirugía. </li><li> Después de completar cirugías para todos los cachorros en una camada, mezclar los cachorros con ropa de cama y de los excrementos de la madre antes de devolverlos al nido de la madre. NOTA: Por lo general, ICR / CD-1 ratones son madres mejor acogida que C57BL / 6, pero incluso entre las madres lactantes de los mismos antecedentes genéticos, los instintos que fomentan varían. Si el cambio de una madre lactante es necesario reducir la mortalidad por canibalización materna, retire los cachorros P0 a una madre lactante y luego realizar la resección apical en P1. Sólo realizar ya sea la operación simulada o la r apicalesection en una camada de cachorros, porque farsa mezcla y cachorros quirúrgicos podrían disminuir las tasas de supervivencia del grupo quirúrgico de las crías 6. </li></ol> Análisis 5. Post-Quirúrgica <ol><li> Un día después de la cirugía, el seguimiento a los cachorros, asegúrese de que no hay diferencia entre la farsa y grupos quirúrgicos, y contar el número de crías para medir la tasa de supervivencia. Si las cirugías se realizan correctamente, las tasas de supervivencia deben ser similares y mayor que 60% tanto en los grupos sham y quirúrgicos. </li><li> Aislamiento del corazón y la fijación. <ol><li> La eutanasia a los cachorros en los días 1 y 2 después de la cirugía a través de la decapitación y el día 21 después de la cirugía por el CO2 con la garantía de fallecimiento por dislocación cervical, luego limpiar el pecho usando una preparación de alcohol al 70%. </li><li> Incisión en la piel en la línea media y el músculo del pecho y luego abrir el pecho. </li><li> Escindir la totalidad de los corazones de la cavidad torácica y fijar todo el corazón de cada muestra en 5 ml de 4% de paraformaldehído O / N a TA. </li></ol></li><li> En el día siguiente, transferir las muestras a 70% de etanol. Las muestras pueden conservarse hasta una semana antes de la inclusión en parafina. </li><li> Slice secciones de parafina de 5 micras de espesor a través de todo el ventrículo y realizar hematoxilina estándar y eosina (H &amp; E) y la tinción de tricrómico de Masson para examinar la respuesta regenerativa 5, 7. En concreto, H &amp; E tinción se utiliza para examinar el reemplazo del músculo y se utiliza tricrómico de Masson para examinar las respuestas fibróticas 5. </li><li> Seleccione el área de interés y establecer al menos tres focos por muestra manualmente utilizando un escáner de diapositivas. Image y analizar las diapositivas de tinción a 40 × magnificación de acuerdo con las instrucciones del fabricante con los parámetros por defecto. </li></ol>

<ol><li>Lin, Z., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+cardiac+regeneration+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Strategies for cardiac regeneration and repair.</a> Sci Transl Med. 6, 231-239 (2014).</li>
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</ol>

Tasas de publicación para este artículo fueron patrocinados por un don de Ciencia Herramientas Bellas Dr. Jian Hou.

La regeneración cardíaca muestra potencial para el tratamiento y la prevención de la insuficiencia cardíaca1, 2. Los modelos animales son indispensables y juegan un papel fundamental en la comprensión de cómo ocurre la regeneración cardíaca3-6. Muchos anfibios y peces regeneran el tejido cardíaco en respuesta a una lesión, lo que proporciona información sobre nuestra comprensión de la enfermedad cardiovascular humana13, 14. En términos de evolución, sin embargo, la fisiopatología debería ...

La prolongación de la vida humana conduce a diversas enfermedades relacionadas con el envejecimiento y el estilo de vida, incluida la insuficiencia cardíaca, una de las principales causas de mortalidad. Sin embargo, sin el reemplazo de las células del músculo cardíaco perdidas o disfuncionales, las terapias actuales solo pueden mejorar transitoriamente la función cardíaca1, 2. Por lo tanto, es necesario descubrir y desarrollar estrategias innovadoras para la regeneración y reparación cardíaca. El corazón de los mamíferos adultos tiene un potencial regenerativo limitado. Los estudios de vertebrados inferiores, como los anfibios urodelos y los peces teleósteos, han proporcionado información sin precedentes sobre los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a la regeneración del corazón3, 4. Recientemente, ha surgido un modelo de ratón neonatal de regeneración cardíaca que podría permitir la identificación y caracterización de eventos fisiopatológicos más conservados evolutivamente necesarios para la regeneración del corazón humano5. 
La resección apical se refiere a la extirpación quirúrgica del ápex ventricular izquierdo. Este procedimiento está restringido a ratones de 1 a 7 días de edad (P1 a P7) debido a su alta letalidad en ratones mayores6. Se espera que el proceso de regeneración cardíaca en ratones neonatos después de la resección apical sea el siguiente: (I) formación rápida y efectiva de un hematoma para sellar el ápex y evitar la exanguinación; (II) regeneración de cardiomiocitos y restauración de la función sistólica5, 7. Trabajos recientes han estimulado el debate sobre la importancia y la eficiencia de este modelo8-11. Por lo tanto, es importante presentar la resección apical de manera clara y detallada. Con este fin, este protocolo describe de manera vívida y específica un video de cómo hice una resección apical basada en un protocolo anterior6. 
La comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración cardíaca es importante para el tratamiento de la enfermedad cardíaca caracterizada por pérdida y/o lesión de cardiomiocitos, como la insuficiencia cardíaca1, 2. Dado el progreso actual y prometedor de la resección apical en la investigación de la regeneración cardíaca, este estudio podría promover el uso de esta técnica y sus usos en la investigación de la regeneración cardíaca.

<table><tbody><tr><td>Portaagujas Olsen-Hegar con tijeras, 1,5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas - 2 mm Cutting Edge Science</td><td>Tools</td><td>15000-03</td><td>Tijeras de iridectomía Esterilizador</td></tr> de <tr><td>perlas calientes Fine</td><td>Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de iris, rectas, dentadas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11064-07</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de iris, curvado, dentado</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11065-07</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de karité - Curvas/romas-romas/12cm</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14105-12</td><td></td></tr><tr><td>pinzas de atado de sutura con mango redondo, rectas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>18025-12</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas con mango redondo Herramientas de</td><td>ciencia fina</td><td>15400-12</td><td></td></tr><tr><td>Hemostático fino</td><td>Herramientas</td> <td>de ciencia fina13007-12</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de aumento</td><td>Luxolamp Corp</td><td>IM120&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara calefactora</td><td>Brandt Equipment llc</td><td>51152/3</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Suturas Prolene</td><td>Ethicon</td><td>8889H</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento para piel-Vetbond Adhesivo para tejidos&nbsp;</td><td>3M&nbsp;</td><td>1469</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores estériles con punta de algodón</td><td>Dynarex</td><td>4305</td><td></td></tr><tr><td>WEBCOL Almohadilla de preparación con alcohol</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td>Medium 2 PLY, 200/BOX, Saturada con 70% de alcohol isopropílico</td></tr><tr><td>Curity All Purpose Sponges</td><td>Covidien</td><td>9024</td><td>No tejida 4 CAPAS, 4"x4" (10.2cm&times; 10,2 cm)</td></tr><tr><td>Hoja protectora de sobremesa</td><td>KIMTECH SCIENCE</td><td>7546</td><td>18" x 19,5" (45,72 cm x 49,53 cm) x 50</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio al 0,9%, 250 ml</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-6138-22</td><td></td></tr><tr><td>Hisopos de solución Betadine Productos</td><td>Purdue L.P.</td><td>NDC 67618-153-03</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>TOMY Digital Biology</td><td>SX-700</td><td>ESTERILIZADOR DE VAPOR DE ALTA PRESIÓN</td></tr><tr><td>Escáner de portaobjetos</td><td>HAMAMATSU</td><td>NanoZoomer 2.0-RS</td><td></td></tr></tbody></table>

modelo apical resección ratón para el estudio de la regeneración del corazón de mamíferos temprana

Apical Resection Mouse Model to Study Early Mammalian Heart Regeneration

La enfermedad cardiovascular afecta a todo el mundo debido a los cambios de estilo de vida intensivos. La regeneración del corazón representa una gran promesa para la reparación y la restauración de los cardiomiocitos perdidos debido a lesiones y enfermedades. En contraste con la regeneración cardiaca robusta de ciertos vertebrados inferiores, corazones de mamíferos adultos típicamente muestran una capacidad mínima para la regeneración del corazón y reparación. Sin embargo, estudios recientes han suscitado considerable interés científico con el hallazgo de que, entre el día postnatal 1 al 7 (P1 a P7), el corazón neonatal de ratón retiene potencial regenerativo significativa después de la resección apical (es decir, la amputación quirúrgica y la exposición del ápice del ventrículo izquierdo). Una gran controversia sobre este hallazgo podría ser debido a los diversos procedimientos relacionados con la cirugía utilizados en los esfuerzos para replicar o ampliar sobre este importante hallazgo. Estas instrucciones presentan dinámicamente los materiales y la metodología para la resección apical en un modelo de ratón. Las medidas más destacadas de este Surviva roedoresl cirugía involucra anestesia hipotermia, toracotomía, la amputación quirúrgica del ápex del ventrículo del corazón, y la sutura y la recuperación de los ratones. El método descrito también podría ampliar la aplicación del modelo de ratón de la resección apical para la investigación cardiovascular.

Crías de ratón fueron sacrificados 1, 2, y 21 días después de la resección apical, y sus corazones se recogieron para H &amp; E y tricrómico de Masson. De color azul en tricrómico de Masson indica la deposición de matriz extracelular epicárdica 5. Con la resección apical éxito, un coágulo de sangre se forma de manera efectiva para sellar el LV One día post-resección apical, como se muestra en la Figura 1A. Se observa una resorción gradual del coágulo de sangre y principios de fibrosis cardiac...

En este estudio se demuestra un protocolo de video paso a paso de la resección apical. La resección apical es un abordaje quirúrgico recientemente destacado en la investigación de la regeneración cardíaca en mamíferos. Este estudio puede promover la aplicación de la resección apical como metodología estándar en la investigación del mecanismo subyacente a la regeneración del corazón.

Modelo apical Resección ratón para el Estudio de la regeneración del corazón de mamíferos Temprana

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la resección apical en ratones neonatos para estudiar la regeneración cardíaca temprana en mamíferos. Este enfoque puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regeneración cardíaca, como cuáles son los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a la regeneración cardíaca temprana en mamíferos. La principal ventaja de esta técnica es que el modelo de resección apical en ratones ofrece un enfoque relativamente sencillo y directo para estudiar la regeneración cardíaca temprana en mamíferos.Antes de comenzar el procedimiento, transfiera todas las crías C57 black six del día postnatal uno desde su madre amamantadora a una jaula limpia para ratones con cama y materiales para nidos frescos. Luego, para cada neonato sucesivamente, transfiera la cría desde una cama de hielo al área quirúrgica e inmovilice los brazos, las piernas y la cola en posición supina. Desinfecte el tórax con betadina seguido de una limpieza suave con una gasa preparada al 70% de alcohol.Ahora, realice una incisión en la piel de transferencia a lo largo de la cuarta área costal interna de la cavidad torácica. Utilice tijeras de resorte para hacer una incisión en el ápice del corazón. Para acceder al corazón, use tijeras de resorte para hacer una incisión en el ápice del corazón seguida de una disección roma de los músculos intercostales internos.Utilice suturas estériles 6-0 para cerrar conjuntamente las costillas y los músculos. Use pegamento para piel para cerrar cuidadosamente la incisión cutánea y permita que el neonato se recupere bajo una lámpara de calor durante aproximadamente tres minutos. Luego, utilice una gasa preparada con alcohol al 70 % para limpiar todas las trazas de sangre y pegamento del cachorro y devuelva el animal a sus compañeros de camada.Después de realizar todas las cirugías, mezcle las crías con la cama y los excrementos de la madre antes de devolver los neonatos al nido de la madre. Un día después de la cirugía, cuente el número de crías falsas y quirúrgicas para determinar la tasa de supervivencia dentro de cada grupo. En el momento adecuado tras la cirugía, para cada animal sucesivamente, limpie el tórax con etanol al 70 % e incise la piel y el músculo en la línea media del tórax.Extraiga el corazón completo de la cavidad torácica y fije el tejido en cinco milímetros de paraformaldehído al cuatro por ciento durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, transfiera las muestras a etanol al 70 % durante hasta una semana antes del incluido en parafina. Después de obtener secciones de parafina de cinco micrómetros de grosor a través de todo el ventrículo, tiña las muestras con hematoxilina y eosina, y tricrómica de Masson para examinar la sustitución muscular y las respuestas fibróticas en los corazones resecados, respectivamente.Utilizando un escáner de portaobjetos, obtenga manualmente al menos tres focos por muestra. Luego analice las imágenes de la muestra con un aumento de 40X según las instrucciones del fabricante, utilizando los parámetros predeterminados del escáner. Tras una resección apical exitosa, dentro de un día de la resección apical, se forma eficazmente un coágulo de sangre para sellar el ventrículo izquierdo.Posteriormente, se observa una reabsorción progresiva del coágulo sanguíneo y una fibrosis cardíaca temprana, que gradualmente es reemplazada por tejido miocárdico hasta la regeneración completa del miocardio a los 21 días posteriores a la resección. De hecho, tres semanas después de la cirugía, no se aprecian diferencias entre los corazones resecados y los corazones sometidos a cirugía simulada mediante análisis morfológico. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener condiciones estériles.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otras mediciones, como la marcación y la medición lineal, para responder preguntas adicionales sobre la proliferación de cardiomiocitos y la resección apical. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la resección apical en ratones neonatos.

apical-resection-mouse-model-to-study-early-mammalian-heart

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Investigación

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En este video, demostramos el procedimiento para extirpar quirúrgicamente el ápice ventricular izquierdo de un corazón de ratón neonatal.

Resección Apical en Modelo de Ratón Neonatal: Un Procedimiento Quirúrgico para Amputar el Ápice Ventricular para Estudiar el Potencial Regenerativo en el Corazón de un Ratón Neonato

La insuficiencia cardíaca es la principal causa de hospitalización y una de las principales causas de mortalidad. Se aplica un modelo de ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda en ratones para investigar el remodelado ventricular y la disfunción cardíaca después del infarto de miocardio. Se presenta la técnica de mediciones hemodinámicas invasivas en ratones.

La ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior en ratones: un modelo de remodelación post infarto de miocardio e insuficiencia cardiaca

Este protocolo describe un modelo altamente reproducible de regeneración cardíaca por inducción quirúrgica de infarto de miocardio en el ventrículo izquierdo de ratones postnatales día 1. El método consiste en la inducción de anestesia hipotérmica y la ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda.

El infarto de miocardio en ratones recién nacidos, un modelo de regeneración cardiaca

La proliferación de cardiomiocitos después de una lesión es un proceso dinámico que requiere una sinfonía de señales extracelulares de poblaciones de células no miocitos. Utilizando el trazado de linaje, la CLARIDAD pasiva y las técnicas tridimensionales de microscopía confocal de montaje completo, podemos analizar la influencia de una variedad de tipos de células en la reparación y regeneración cardíaca.

Captura de la respuesta de la lesión cardíaca de las poblaciones celulares objetivo a través de imágenes tridimensionales del corazón despejado

Este protocolo tiene como objetivo trasplantar un parche bioimpreso 3D en el epicardio de ratones infartos modelando insuficiencia cardíaca. Incluye detalles sobre la anestesia, la abertura quirúrgica del pecho, la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) y la aplicación de un parche bioimpreso en la zona infarta del corazón.

Trasplante de un parche bioimpreso 3D en un modelo murino de infarto de miocardio

Una técnica nueva para la reconstrucción del circuito de sangre en un modelo abdominal heterotopic del trasplante del corazón del ratón se demuestra.

Reconstrucción Del Circuito Sanguíneo En Un Modelo De Trasplante De Corazón De Ratón Abdominal

Proporcionamos un protocolo para la separación y el trasplante de macrófagos cardíacos neonatales en un corazón de ratón adulto, que podría ser una forma prometedora de promover la reparación cardíaca.

Trasplante de macrófagos cardíacos neonatales de ratón en ratones adultos

La administración de células guiadas por ultrasonido alrededor del sitio del infarto de miocardio en ratones es una forma segura, efectiva y conveniente de trasplante de células.

Implantación de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducida por ultrasonido en ratones con infartado de miocardio

Aquí, describimos un protocolo para aislar una cantidad suficiente de miomiocitos únicos no cardiomiocitos con alta viabilidad de un corazón de ratón post-infarto de miocardio (IM). Esto se puede utilizar para la secuenciación posterior de una sola célula, el análisis de citometría de flujo y el cultivo celular primario.

Preparación de una suspensión de células no cardiomiocitos para la secuenciación de ARN unicelular de un corazón de ratón adulto postinfarto de miocardio

Xenopus tropicalis es un modelo ideal para la investigación regenerativa ya que muchos de sus órganos poseen una notable capacidad regenerativa. Aquí, presentamos un método para construir un modelo de lesión cardíaca en X. tropicalis a través de la resección del ápice.

Un modelo de resección apical en el corazón adulto de Xenopus tropicalis

Aprende la técnica de resección apical en ratones neonatos para estudiar la regeneración cardíaca temprana en mamíferos. Este método proporciona un enfoque directo para investigar los mecanismos moleculares y celulares de la reparación del corazón.

Modelo apical Resección ratón para el Estudio de la regeneración del corazón de mamíferos Temprana

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