Un ratón neonatal lesión de médula espinal de compresión Modelo
27 de marzo de 2016
Este artículo describe un método para generar una lesión por compresión de la médula espinal (LME) reproducible en el ratón neonatal. El modelo proporciona una plataforma ventajosa para estudiar los mecanismos de plasticidad adaptativa que subyacen a la recuperación funcional espontánea.
El objetivo general de este procedimiento es realizar una lesión por compresión de la médula espinal reproducible en un ratón neonato. Esto se logra primero anestesiando profundamente al ratón y luego realizando una laminectomía dorsal para exponer la médula espinal.
Y finalmente, realizando la lesión por compresión. Recientemente hemos establecido un modelo de ratón neonatal para la lesión de la médula espinal y hemos demostrado que los ratones recién nacidos exhiben un grado asombroso de plasticidad adaptativa. El estudio de este mecanismo subyacente a la recuperación podría proporcionar información importante, que se podría utilizar en el tratamiento de lesiones de la médula espinal.
En este video, demostraremos cómo realizar una lesión por compresión de la médula espinal en un ratón de un día de edad. Este procedimiento quirúrgico incluye anestesia, laminectomía y dos compresiones epidurales mediante pinzas. Preparación para la cirugía.
La cirugía se realiza bajo un microscopio estereoscópico. Coloque una almohadilla calefactora debajo del microscopio. Es fundamental mantener al cachorro caliente para evitar la muerte súbita durante la cirugía.
Coloque una manta quirúrgica o una hoja grande de papel de laboratorio limpio y suave sobre la almohadilla de calentamiento. Para la analgesia prequirúrgica, prepare una jeringa de insulina de 0,3 mililitros con aguja de calibre 30, cargada con el anestésico local Marcaine, diluido con PBS estéril, hasta una concentración final de 2,5 miligramos por mililitro. Para la incisión cutánea, la eliminación muscular y la laminectomía, utilice un microcuchillo, pinzas finas y tijeras de iridectomía finas.
Tenga en cuenta que aquí también utilizamos pinzas cuyas puntas hemos doblado para formar dientes. Estas funcionan mejor que las pinzas dentadas comercialmente disponibles porque los dientes deben ser muy pequeños. Para la compresión de la médula espinal, utilice un miniclips especial modificado para aneurismas temporales Yasargil, que describiremos más adelante.
También es necesario un pequeño trozo de tubo capilar de plástico para fabricar un tapón que evite el cierre completo del clip, y un aplicador de clips para colocar el clip. Para la sutura, utilice un portagujas y tijeras pequeñas para cortar el hilo. Para el tratamiento del dolor, diluya Temgesic en PBS estéril hasta una concentración de 0,03 miligramos por mililitro.
La lesión de la médula espinal implica una compresión mediante un clip, utilizando un miniclip temporal para aneurisma Yasargil. Antes de su uso, el clip debe modificarse mecánicamente, reduciendo el grosor de las láminas hasta 150 micrómetros mediante una piedra de afilar. Justo antes de la cirugía, corte un pequeño tramo de tubo de plástico y colóquelo sobre una de las láminas del clip.
El tubo actúa como un tapón para evitar el cierre completo del clip. Anestesia y analgesia. Para la anestesia gaseosa, utilizamos un vaporizador de suprane conectado a un tanque de oxígeno.
El isoflurano es el anestésico que se vaporiza en oxígeno puro. Para administrar la mezcla de isoflurano y oxígeno al ratón, es necesario construir una mascarilla nasal adaptada para neonatos. Los ratones neonatos son tan pequeños que la mascarilla puede elaborarse con la punta de una jeringa, que sirve como entrada para el tubo plástico conectado a la salida del vaporizador.
En un costado de la máscara, taladre un pequeño orificio para conectar un tubo de evacuación que termine, bien en una bomba de vacío regulada con una unidad de recolección, bien simplemente en una campana extractora. Elabore una cámara de sobredosis de anestesia utilizando una placa de Petri plástica de 150 por 25 mililitros. En un costado, haga un orificio lo suficientemente grande para la cabeza del ratón.
En el lado opuesto, haga dos orificios más pequeños del diámetro del tubo plástico. Por último, haga un orificio de evacuación, más pequeño que los demás, en la parte superior del recipiente. Corte la punta de una punta de pipeta de 250 microlitros e introdúzcala en este último orificio.
La punta de la pipeta funciona como un conector para el tubo de evacuación, que está conectado a un dispositivo de vacío ajustado a una ligera presión negativa. Con plastilina, fije la máscara justo dentro del orificio para la cabeza del ratón. Con cinta adhesiva o plastilina, asegure el tubo de plástico al techo de la cámara, asegurándose de que los tubos estén bien posicionados en los orificios correspondientes.
Coloque la cámara sobre la manta quirúrgica bajo el microscopio. Todo el sistema está representado en este esquema. Se coloca una llave de paso de tres vías en la salida del vaporizador.
Aquí, la trayectoria hacia la cámara de sueño está libre, mientras que el camino hacia la máscara está bloqueado y el ratón puede colocarse en la cámara de sueño para iniciar la sedación. Girar la llave de paso de tres vías hacia la derecha permite que el gas fluya hacia la máscara y bloquea el paso hacia la cámara de sueño. En esta configuración, el ratón puede transferirse a la máscara.
La fuga de gas se elimina mediante vacío desde la cámara de desbordamiento. Seleccione una cría de ratón que haya estado bebiendo leche recientemente, como lo indica el color blanco visible a través de la piel. Coloque la cría en la cámara de sueño e introduzca Isoflurano vaporizado al 4% para lograr una sedación rápida.
Transfiera la cría a la mascarilla. Coloque cuidadosamente el hocico del ratón profundamente dentro de la mascarilla para asegurar una exposición suficiente al gas anestésico. Gire la llave de paso de tres vías para desviar el gas hacia la mascarilla.
Administre por vía subcutánea 50 microlitros de Marcaine al 2,5 miligramos por mililitro en el sitio deseado para la cirugía. Tenga cuidado de no inyectar demasiado profundo, ya que los vasos sanguíneos pueden ser fácilmente alcanzados y la introducción de Marcaine en un vaso sanguíneo es letal. Retire el exceso de Marcaine con una compresa estéril pequeña.
Laminectomía dorsal. Reduzca la concentración de isoflurano a uno a dos por ciento. Después de unos minutos, perfore la piel con un microcuchillo y realice una abertura de ocho a nueve milímetros de longitud mediante un suave estiramiento de la piel en dirección craneal a caudal.
Una abertura de transferencia es mucho más conveniente y proporciona un mejor acceso lateral para realizar la laminectomía. Retraiga los bordes de la incisión cutánea desde el tejido subyacente insertando trozos de esponjistatina, por vía subcutánea, craneal y caudal a la incisión. Corte los músculos prevertebrales con tijeras finas para exponer la columna vertebral.
Tenga en cuenta que en el recién nacido, el proceso espinoso no está completamente desarrollado. Identifique la línea media y corte la lámina transversalmente con las tijeras finas. Tenga cuidado de no cortar demasiado profundo, ya que esto podría dañar potencialmente la duramadre e incluso la médula espinal.
Coloque cuidadosamente una hoja de una pinza fina entre la lámina y la duramadre. Sujete la lámina cerrando la pinza y levántela con cuidado hasta que se desprenda, dejando la duramadre intacta. Repita el paso dos o tres veces para obtener una laminectomía de uno a dos segmentos.
Controle la hemorragia utilizando pequeños trozos de espongistatina. Utilice la pinza fina como rongeur para eliminar partes de las articulaciones facetarias bilateralmente y obtener suficiente espacio para colocar la miniclamp modificada para aneurisma dentro del canal vertebral. Este paso suele provocar hemorragia que puede controlarse con pequeños trozos de espongistatina.
Para mejorar la visibilidad, a veces es una ventaja enjuagar con PBS estéril tibio a 37 grados centígrados. Generación de la lesión por compresión de la médula espinal. Abra el clip y coloque las cuchillas a ambos lados de la médula espinal en los espacios entre las articulaciones facetarias y la médula.
Asegúrese de que las láminas se inserten lo suficientemente hondo como para abarcar la parte ventral de la médula espinal. Cierre rápidamente el clip, manteniendo el aplicador en su lugar, para evitar que el clip se deslice hacia atrás. Después de 15 segundos, suelte rápidamente el clip.
Limpie la herida utilizando spongistatina. Para lograr una compresión simétrica, invierta las cuchillas y realice una segunda compresión durante 15 segundos en la orientación opuesta. Sutura. Retire los trozos de spongistatina que se colocaron bajo la piel al inicio de la cirugía y cierre la piel con puntos 6.0.
Inyecte 0.05 mililitros de Temgesic al 0.03 miligramos por mililitro, por vía subcutánea con una jeringa de insulina de calibre 30, y coloque la cría en un ambiente con temperatura controlada a 30 grados centígrados durante algunas horas. Para reducir el comportamiento materno agresivo hacia la cría operada durante la primera noche, después de la cirugía, prepare una solución de Diazepam diluida en PBS limpio hasta 0.1 miligramos por mililitro para inyección intraperitoneal a ocho gramos por kilogramo. Resultados.
Como se muestra en este gráfico, seis horas después de la compresión de la médula espinal, a niveles torácicos inferiores, las extremidades traseras de los ratones lesionados están paralizadas, mientras que las extremidades delanteras no lo están. En el caso de los animales control simulados, que solo recibieron una laminectomía, tanto las extremidades traseras como las delanteras son altamente móviles. La sección de la médula espinal muestra sangre residual en el sitio de la lesión.
Además, el tejido es translúcido, lo que sugiere pérdida de tejido, la cual a menudo conduce a la formación de una cavidad varios días después. Conclusión. Tras este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar una lesión por compresión de la médula espinal en un ratón neonato. La ventaja de utilizar ratones neonatos es que podemos emplear métodos específicos para abordar la plasticidad adaptativa, que no pueden usarse en ratones adultos.
Además, el modelo proporciona una plataforma para probar enfoques terapéuticos, como el trasplante de células madre.
Descripción general
Este artículo describe un método para generar una lesión por compresión de la médula espinal (SCI) reproducible en ratones neonatos. Este modelo es ventajoso para estudiar los mecanismos de plasticidad adaptativa que subyacen a la recuperación funcional espontánea.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Neurobiología
- Modelos de lesión
Antecedentes
- Las lesiones de la médula espinal pueden provocar discapacidades funcionales significativas.
- Los ratones recién nacidos muestran una capacidad notable de recuperación.
- Comprender la plasticidad adaptativa es fundamental para desarrollar tratamientos.
- Este modelo permite realizar experimentos controlados sobre lesiones de la médula espinal (SCI).
Objetivo del estudio
- Establecer un modelo reproducible de lesión por compresión de la médula espinal.
- Investigar los mecanismos de recuperación en ratones neonatos.
- Proporcionar información para posibles enfoques terapéuticos.
Métodos Utilizados
- Anestesia profunda de ratones neonatos.
- Laminectomía dorsal para exponer la médula espinal.
- Lesión por compresión utilizando un miniclamp de aneurisma temporal Yasargil modificado.
- Analgesia postoperatoria para el manejo del dolor.
Resultados principales
- El modelo induce con éxito una lesión por compresión de la médula espinal.
- Los ratones neonatos muestran una plasticidad adaptativa significativa tras la lesión.
- Los conocimientos obtenidos podrían orientar futuros tratamientos para lesiones de la médula espinal.
- El protocolo quirúrgico detallado asegura la reproductibilidad del modelo.
Conclusiones
- Este modelo es una herramienta valiosa para estudiar lesiones de la médula espinal.
- Comprender los mecanismos de recuperación puede conducir a terapias mejores.
- La investigación futura puede basarse en este trabajo fundamental.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este modelo de compresión de la médula espinal en ratones neonatos permite la investigación mecanicista de la plasticidad adaptativa en la recuperación tras lesiones en la primera infancia, ofreciendo un sistema relevante para la enfermedad que ayuda a reducir el riesgo de hipótesis terapéuticas. Al capturar la dinámica espontánea de recuperación funcional, el modelo respalda la validación de dianas y el cribado fenotíp游戏副本
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas relacionadas con mecanismos de plasticidad adaptativa en la lesión de la médula espinal.
- Valor operativo: Proporciona un sistema biológicamente relevante para la validación funcional de objetivos terapéuticos mediante lecturas conductuales y electrofisiológicas.
- Valor predictivo: Facilita la reducción del riesgo mecanicista al vincular las vías de plasticidad en las etapas tempranas de la vida con posibles objetivos terapéuticos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayos: Genera un modelo de lesión estandarizado y reproducible adecuado para la selección de compuestos y la evaluación de intervenciones terapéuticas.
- Resultados cuantitativos: Facilita mediciones de variables dependientes, incluyendo la motilidad de las extremidades posteriores, la conectividad sináptica y la actividad electrofisiológica.
- Escalabilidad: Permite grabaciones ópticas de alto rendimiento y análisis fisiológicos ex vivo para el desarrollo de ensayos posteriores.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la lesión de la médula espinal pediátrica con evidencia de deterioro agudo de las extremidades posteriores y recuperación funcional dentro de las dos semanas.
- Continuidad traslacional: Aprovecha los mecanismos compartidos de plasticidad entre la médula espinal neonatal y adulta para generar conocimientos aplicables entre diferentes edades.
- Avance ajustado al riesgo: Permite la evaluación de candidatos terapéuticos utilizando la recuperación funcional y la reconexión sináptica como biomarcadores predictivos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El modelo se integra en el continuo de descubrimiento que va desde la validación del blanco hasta las pruebas de eficacia preclínica, especialmente para enfoques neuroprotectores y neurorestauradores.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la plasticidad adaptativa y los mecanismos de recuperación funcional tras la compresión de la médula espinal.
- Selección: Permite el desarrollo de ensayos para la evaluación de compuestos mediante puntos finales conductuales y fisiológicos cuantificables.
- Análisis: Genera mediciones de variables dependientes, como la señalización electrofisiológica y el registro óptico de la conectividad sináptica.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos sobre plasticidad en etapas tempranas de la vida con lesiones medulares en adultos a través de mecanismos biológicos conservados.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la prueba iterativa de intervenciones terapéuticas en fases de descubrimiento y preclínicas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza en el objetivo al esclarecer los mecanismos de recuperación espontánea y plasticidad adaptativa.
- Valor operativo: Proporciona un modelo quirúrgico reproducible con parámetros de compresión estandarizados y cuidados posoperatorios.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción del desarrollo al ofrecer señales tempranas de eficacia en un modelo de lesión con alta plasticidad.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de neuroterapéuticos basada en biomarcadores de recuperación funcional y reparación sináptica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de ratones neonatos, microcirugía y técnicas de registro electrofisiológico.
- Depende de instrumentación especializada, incluyendo microscopio estereoscópico, aplicador de miniabrazaderas para aneurisma y sistemas de recuperación con control de temperatura.
- Necesita estandarización entre los equipos quirúrgicos para lograr una laminectomía y aplicación de lesión por compresión consistentes.
- Implica consideraciones de adaptación al trasladar los hallazgos desde el contexto de médula espinal neonatal al adulto o humano.
- Las limitaciones prácticas incluyen la especificidad del modelo para etapas posnatales tempranas y la posible variabilidad en la gravedad de la lesión debido a la colocación de la abrazadera.
