Un ratón neonatal lesión de médula espinal de compresión Modelo
27 de marzo de 2016
Este artículo describe un método para generar una lesión por compresión de la médula espinal (LME) reproducible en el ratón neonatal. El modelo proporciona una plataforma ventajosa para estudiar los mecanismos de plasticidad adaptativa que subyacen a la recuperación funcional espontánea.
El objetivo general de este procedimiento es realizar una lesión por compresión de la médula espinal reproducible en un ratón neonatal. Esto se logra primero anestesiando profundamente al ratón. A continuación, se realiza una laminectomía dorsal para revelar la médula espinal.
Y finalmente al hacer la lesión por compresión. Recientemente hemos establecido un modelo de ratón neonatal para la lesión de la médula espinal y hemos demostrado que los ratones neonatos exhiben un grado asombroso de plasticidad adaptativa. El estudio de este mecanismo subyacente a la recuperación puede proporcionar información importante, que podría utilizarse en el tratamiento de la lesión de la médula espinal.
En este video, demostraremos cómo realizar una lesión por compresión de la médula espinal en un ratón de un día de edad. Este procedimiento quirúrgico incluye anestesia, laminectomía y dos compresiones epidurales accionadas por clip. Preparación para la cirugía.
La cirugía se realiza bajo un microscopio estereoscópico. Coloque una almohadilla térmica debajo del microscopio. Es crucial mantener al cachorro caliente para evitar la muerte súbita durante la cirugía.
Coloque una manta quirúrgica o una hoja grande de papel de laboratorio limpio y suave sobre la almohadilla térmica. Para la analgesia prequirúrgica, prepare una jeringa de insulina, de 0,3 mililitros calibre 30, llena con el anestésico local, Marcaine, diluida con PBS estéril, hasta una concentración final de 2,5 miligramos por mililitro. Para la incisión en la piel, la extirpación muscular y la laminectomía, utilice un microbisturí, pinzas finas y tijeras de iridectomía finas.
Tenga en cuenta que aquí también usamos pinzas que hemos doblado en las puntas para formar los dientes. Estos funcionan mejor que las pinzas dentadas disponibles en el mercado porque los dientes deben ser muy pequeños. Para la compresión de la médula espinal, utilice un Miniclip de Aneurisma Temporal Yasargil especialmente modificado, que describiremos más adelante.
También es necesario un pequeño trozo de tubo capilar de plástico para hacer un tapón que evite el cierre completo del clip, y un aplicador de clip para colocar el clip. Para suturar, use un portaagujas y unas tijeras pequeñas para cortar el hilo. Para el tratamiento del dolor, diluya Temgesic en PBS estéril, hasta 0,03 miligramos por mililitro.
La lesión de la médula espinal implica una compresión impulsada por un clip, utilizando un miniclip de aneurisma temporal de Yasargil. Antes de su uso, el clip debe modificarse mecánicamente, recortando el grosor de las cuchillas hasta 150 micrómetros con una piedra de afilar. Justo antes de la cirugía, corte un tramo corto de tubo de plástico y colóquelo sobre una de las cuchillas del clip.
El tubo actúa como un tapón para evitar el cierre completo del clip. Anestesia y analgesia. Para la anestesia con gas, utilizamos un vaporizador suprane conectado a un tanque de oxígeno.
El isoflurano es el anestésico que se vaporiza en oxígeno puro. Para distribuir la mezcla de isoflurano y oxígeno al ratón, es necesario construir una máscara nasal adaptada a los neonatos. Los ratones neonatos son tan pequeños que la máscara se puede hacer con la punta de una jeringa, que sirve como entrada para el tubo de plástico conectado a la salida del vaporizador.
En el lateral de la mascarilla, perfore un pequeño orificio para conectar un tubo de evacuación que termina en una bomba de vacío regulada, con una unidad de recolección o simplemente en una campana extractora. Haga una cámara de desbordamiento de anestesia con una placa de Petri de plástico de 150 por 25 mililitros. En un lado, haz un agujero lo suficientemente grande para la cabeza del ratón.
En el lado opuesto, haga dos agujeros más pequeños del diámetro del tubo de plástico. Por último, haz un orificio de evacuación, más pequeño que los demás, en la parte superior del plato. Corta la punta de una pipeta de 250 microlitros e introdúcela en este último agujero.
La punta de la pipeta funciona como un conector para el tubo de evacuación que está conectado a un dispositivo de vacío configurado para una ligera presión negativa. Con plastilina, sujeta la máscara justo dentro del agujero para la cabeza del ratón. Con cinta adhesiva o plastilina, asegure el tubo de plástico al techo de la cámara, asegurándose de que los tubos estén bien colocados en los orificios apropiados.
Coloque la cámara sobre la manta quirúrgica bajo el microscopio. Todo el sistema está representado en este esquema. Se coloca una llave de paso de tres vías en la salida del vaporizador.
Aquí, el camino a la cámara de sueño está libre, mientras que el camino a la máscara está bloqueado y el mouse se puede colocar en la cámara de sueño para iniciar la sedación. Girar la llave de paso de tres vías hacia la derecha permite que el gas fluya hacia la máscara y bloquea el camino hacia la cámara de sueño. En esta configuración, el ratón se puede transferir a la máscara.
La fuga de gas se elimina por vacío de la cámara de desbordamiento. Seleccione un cachorro de ratón que haya estado bebiendo leche recientemente, como lo demuestra el color blanco visible a través de la piel. Coloque al cachorro en la cámara de sueño e introduzca Isoflurano vaporizado al 4% para lograr una sedación rápida.
Transfiere al cachorro a la máscara. Coloque con cuidado el hocico del ratón bien dentro de la mascarilla para asegurar una exposición suficiente al gas anestésico. Gire la llave de paso de tres vías para desviar el gas hacia la máscara.
Inyectar por vía subcutánea, 50 microlitros de Marcaína a 2,5 miligramos por mililitro, en el sitio deseado de la cirugía. Tenga cuidado de no inyectar demasiado profundo, ya que los vasos sanguíneos pueden golpearse fácilmente y la introducción de la Marcaine en un vaso es letal. Limpie el exceso de Marcaine con una pequeña compresa estéril.
Laminectomía dorsal. Reduzca la concentración de isoflurano al uno o dos por ciento. Después de unos minutos, perfore la piel con un micro cuchillo y haga una apertura de transferencia de ocho a nueve milímetros tirando suavemente de la piel en dirección caudal rostral.
Una abertura de transferencia es mucho más conveniente y proporciona un mejor acceso lateral para realizar la laminectomía. Retraiga los bordes de la incisión cutánea del tejido subyacente, insertando trozos de espongistatina, subcutáneamente rostral y caudal a la incisión. Corta los músculos prevertebrales con unas tijeras finas para exponer la columna vertebral.
Tenga en cuenta que en el neonato, la apófisis espinal no está completamente desarrollada. Identifica la línea media y corta la lámina transversalmente con las tijeras finas. Preste atención a no cortar demasiado profundo, ya que esto puede dañar la duramadre e incluso la médula espinal.
Coloque con cuidado una hoja de una pinza delgada entre la lámina y la duramadre. Agarre la lámina cerrando las pinzas y levántela con cuidado hasta que se desprenda, dejando la duramadre intacta. Repita el paso, dos o tres veces para obtener una laminectomía de uno a dos segmentos.
Controle el sangrado con pequeños trozos de espongistatina. Usando las pinzas delgadas como rongeurs, retire partes de las articulaciones facetarias bilateralmente para ganar suficiente espacio para colocar el miniclip del aneurisma modificado dentro del canal vertebral. Este paso a menudo resulta en sangrado que se puede controlar con pequeños trozos de espongistatina.
Para mejorar la visibilidad, a veces es una ventaja enjuagar con PBS estéril tibio, a 37 grados centígrados. Generando la lesión medular por compresión. Abra el clip y coloque las cuchillas a cada lado de la médula espinal en los espacios entre las articulaciones facetarias y la médula.
Asegúrese de que las cuchillas estén insertadas lo suficientemente profundo como para abarcar la parte ventral de la médula espinal. Cierre rápidamente el clip, mientras sostiene el aplicador en su lugar, para evitar que el clip se deslice hacia atrás. Después de 15 segundos, suelte rápidamente el clip.
Limpie la herida con espongistatina. Para lograr una compresión simétrica, invierta las cuchillas y realice una segunda compresión durante 15 segundos en la orientación opuesta. Sutura. Retire los trozos de espongistatina que se colocaron debajo de la piel al comienzo de la cirugía y cierre la piel con suturas 6.0.
Inyecte 0,05 mililitros, Temgesic, a 0,03 miligramos por mililitro. por vía subcutánea con una jeringa de insulina de calibre 30 y coloque al cachorro en un ambiente con temperatura controlada a 30 grados centígrados durante unas horas. Para reducir el comportamiento materno agresivo hacia el cachorro operado durante la primera noche, después de la cirugía, prepare una solución de Diazepam, diluida en PBS limpio, a 0,1 miligramos por mililitro para inyección intraperitoneal a ocho gramos por kilogramo. Resultados.
Como se muestra en este gráfico, seis horas después de la compresión de la médula espinal, a niveles torácicos más bajos, las extremidades traseras de los ratones lesionados están paralizadas, mientras que las extremidades anteriores no lo están. En el caso de los animales de control simulados, que solo recibieron una laminectomía, tanto las extremidades posteriores como las anteriores son altamente móviles. La sección de la médula espinal muestra sangre residual a la vista de la lesión.
Además, el tejido es translúcido, lo que sugiere pérdida de tejido, lo que a menudo conduce a la formación de una caries varios días después. Conclusión. Después de este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar una lesión por compresión de la médula espinal en un ratón neonatal. La ventaja de usar ratones neonatos es que podemos usar métodos específicos para abordar la plasticidad adaptativa, que no se puede usar en ratones adultos.
Además, el modelo proporciona una plataforma para probar enfoques terapéuticos, como el trasplante de células madre.
Descripción general
Este artículo describe un método para generar una lesión por compresión de la médula espinal (SCI) reproducible en ratones neonatos. Este modelo es ventajoso para estudiar los mecanismos de plasticidad adaptativa que subyacen a la recuperación funcional espontánea.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Neurobiología
- Modelos de lesión
Antecedentes
- Las lesiones de la médula espinal pueden provocar discapacidades funcionales significativas.
- Los ratones recién nacidos muestran una capacidad notable de recuperación.
- Comprender la plasticidad adaptativa es fundamental para desarrollar tratamientos.
- Este modelo permite realizar experimentos controlados sobre lesiones de la médula espinal (SCI).
Objetivo del estudio
- Establecer un modelo reproducible de lesión por compresión de la médula espinal.
- Investigar los mecanismos de recuperación en ratones neonatos.
- Proporcionar información para posibles enfoques terapéuticos.
Métodos Utilizados
- Anestesia profunda de ratones neonatos.
- Laminectomía dorsal para exponer la médula espinal.
- Lesión por compresión utilizando un miniclamp de aneurisma temporal Yasargil modificado.
- Analgesia postoperatoria para el manejo del dolor.
Resultados principales
- El modelo induce con éxito una lesión por compresión de la médula espinal.
- Los ratones neonatos muestran una plasticidad adaptativa significativa tras la lesión.
- Los conocimientos obtenidos podrían orientar futuros tratamientos para lesiones de la médula espinal.
- El protocolo quirúrgico detallado asegura la reproductibilidad del modelo.
Conclusiones
- Este modelo es una herramienta valiosa para estudiar lesiones de la médula espinal.
- Comprender los mecanismos de recuperación puede conducir a terapias mejores.
- La investigación futura puede basarse en este trabajo fundamental.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este modelo de compresión de la médula espinal en ratones neonatos permite la investigación mecanicista de la plasticidad adaptativa en la recuperación tras lesiones en la primera infancia, ofreciendo un sistema relevante para la enfermedad que ayuda a reducir el riesgo de hipótesis terapéuticas. Al capturar la dinámica espontánea de recuperación funcional, el modelo respalda la validación de dianas y el cribado fenotíp游戏副本
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas relacionadas con mecanismos de plasticidad adaptativa en la lesión de la médula espinal.
- Valor operativo: Proporciona un sistema biológicamente relevante para la validación funcional de objetivos terapéuticos mediante lecturas conductuales y electrofisiológicas.
- Valor predictivo: Facilita la reducción del riesgo mecanicista al vincular las vías de plasticidad en las etapas tempranas de la vida con posibles objetivos terapéuticos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayos: Genera un modelo de lesión estandarizado y reproducible adecuado para la selección de compuestos y la evaluación de intervenciones terapéuticas.
- Resultados cuantitativos: Facilita mediciones de variables dependientes, incluyendo la motilidad de las extremidades posteriores, la conectividad sináptica y la actividad electrofisiológica.
- Escalabilidad: Permite grabaciones ópticas de alto rendimiento y análisis fisiológicos ex vivo para el desarrollo de ensayos posteriores.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la lesión de la médula espinal pediátrica con evidencia de deterioro agudo de las extremidades posteriores y recuperación funcional dentro de las dos semanas.
- Continuidad traslacional: Aprovecha los mecanismos compartidos de plasticidad entre la médula espinal neonatal y adulta para generar conocimientos aplicables entre diferentes edades.
- Avance ajustado al riesgo: Permite la evaluación de candidatos terapéuticos utilizando la recuperación funcional y la reconexión sináptica como biomarcadores predictivos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El modelo se integra en el continuo de descubrimiento que va desde la validación del blanco hasta las pruebas de eficacia preclínica, especialmente para enfoques neuroprotectores y neurorestauradores.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la plasticidad adaptativa y los mecanismos de recuperación funcional tras la compresión de la médula espinal.
- Selección: Permite el desarrollo de ensayos para la evaluación de compuestos mediante puntos finales conductuales y fisiológicos cuantificables.
- Análisis: Genera mediciones de variables dependientes, como la señalización electrofisiológica y el registro óptico de la conectividad sináptica.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos sobre plasticidad en etapas tempranas de la vida con lesiones medulares en adultos a través de mecanismos biológicos conservados.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la prueba iterativa de intervenciones terapéuticas en fases de descubrimiento y preclínicas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza en el objetivo al esclarecer los mecanismos de recuperación espontánea y plasticidad adaptativa.
- Valor operativo: Proporciona un modelo quirúrgico reproducible con parámetros de compresión estandarizados y cuidados posoperatorios.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción del desarrollo al ofrecer señales tempranas de eficacia en un modelo de lesión con alta plasticidad.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de neuroterapéuticos basada en biomarcadores de recuperación funcional y reparación sináptica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de ratones neonatos, microcirugía y técnicas de registro electrofisiológico.
- Depende de instrumentación especializada, incluyendo microscopio estereoscópico, aplicador de miniabrazaderas para aneurisma y sistemas de recuperación con control de temperatura.
- Necesita estandarización entre los equipos quirúrgicos para lograr una laminectomía y aplicación de lesión por compresión consistentes.
- Implica consideraciones de adaptación al trasladar los hallazgos desde el contexto de médula espinal neonatal al adulto o humano.
- Las limitaciones prácticas incluyen la especificidad del modelo para etapas posnatales tempranas y la posible variabilidad en la gravedad de la lesión debido a la colocación de la abrazadera.
