Name: Un modelo de ratón para inducida por láser neovascularización coroidea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Aprende a inducir neovascularización coroidea en ratones mediante láser para investigar la degeneración macular asociada a la edad neovascular. Este protocolo reproducible permite estudiar tratamientos farmacéuticos y factores genéticos en oftalmología.

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Los autores desean agradecer a Jonathan Chou, MD por su ayuda en la preparación y edición del manuscrito final y a Wenzhong Liu por los datos de OCT. También nos gustaría agradecer el apoyo de la Beca de Investigación de la Sociedad de la Mácula (AAF), el apoyo de una subvención sin restricciones a la Universidad Northwestern de Investigación para Prevenir la Ceguera, Inc., Nueva York, NY, EE. UU., y el apoyo de NIH-EY019951.

Todos los animales son tratados de acuerdo con la Guía del Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio 2013 Edition, la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) Declaración para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research, y aprobada por el Animal Institucional Cuidado y el empleo Comisión de la Universidad Northwestern. Nota: El siguiente procedimiento se puede realizar en su totalidad con un operador; sin embargo, se llevó a cabo mucho más eficiente con dos operadores con las tareas se dividen en consecuencia. 1. Prepare la estación láser y Pre-láser <ol><li> Coloque el láser y lámpara de hendidura donde puede ser fácilmente accesible. A su vez en láser y ajustado a los parámetros predeterminados (por ejemplo, 75 micras de tamaño punto, 100 mW de potencia, 100 ms de duración). PRECAUCIÓN: Asegúrese de que el operador lleva todas las señales de seguridad láser animales y equipo de protección personal y de seguridad láser pertinente se muestran fuera de la sala de procedimientos. <ol><li> Antes de usar cualquier animales de experimentación, encontrar parámetros ideales utilizando una calibración, el ratón no experimental. Los parámetros del láser dependerá del láser utilizado. Ideal parámetros son definidos por el ajuste de la potencia del láser más bajo que hace que constantemente la formación de &quot;burbuja&quot; cuando se enfoca correctamente. Ver video de ejemplo de lesión con la formación adecuada &quot;burbuja&quot;. </li></ol></li><li> Prepare la estación de pre-láser de modo que la anestesia, todas las gotas para los ojos (tropicamida, tetracaína, y lágrimas artificiales) animales más cálido, toallitas de tejidos, y son fácilmente a su alcance para el operador. <ol><li> Asegúrese de que los animales más cálido se precalienta para corregir la temperatura (37 ° C) antes de la inyección de anestésico en primer ratón con el fin de evitar la hipotermia inducida por anestesia. </li></ol></li><li> Coloque etapa del ratón en más cálido por lo que puede retener el calor y permanecer caliente una vez que comience el procedimiento láser. </li></ol> 2. Ratón Anestesia y Preparación Pre-láser <ol><li> Antes de inyectaring anestesia, inspeccione el ojo macroscópicamente para asegurarse de que no tiene deformaciones o anomalías que disminuyen la claridad de la córnea (por ejemplo, cataratas). </li><li> Pesar ratón. </li><li> Apunte el peso, el sexo y el número de identificación de los animales. </li><li> Usando peso, calcular la cantidad adecuada de anestesia que se utilizará en base a las directrices dadas por la institución (por ejemplo, 100 mg / kg de clorhidrato de ketamina, 10 mg / kg de xilazina O tribromoetanol 250 mg / kg; para un ratón de 20 g inyectar 0,20 ml de xilazina / cóctel de ketamina O 0,25 ml de tribromoetanol). Tener una tabla de dosis previamente calculado por peso en incrementos de 1 g con el fin de reducir los errores matemáticos. </li><li> Scruff ratón e inyectar anestesia intraperitoneal basan en cálculos del paso 2.4. </li><li> Coloca el ratón sobre los animales más cálido y espere hasta que el ratón está completamente anestesiado marcando el reflejo pedal a través pizca dedo del pie (aproximadamente 3-5 minutos). </li><li> Enrolle un tejido limpiar y proteger la zona nasal del ratón para evitar que aspiratión de líquido roll-off. Ratón rollo en su lado y colocar una gota (aproximadamente 30 l) de clorhidrato de tetracaína en cada ojo para la anestesia tópica. Espere 2 minutos para la solución tenga efecto. </li><li> Repita el paso 2.7 con una gota de tropicamida tópico para la dilatación pupilar. Como alternativa, utilice clorhidrato de fenilefrina (2,5%) para la dilatación. </li><li> Espere 2 minutos para las soluciones que se apliquen; mantener a los animales en el más cálido durante este tiempo. </li><li> Una vez transcurrido el tiempo adecuado, colocar rápidamente el ratón en el escenario del ratón y colocar la etapa en la barbilla resto de lámpara de hendidura. </li><li> Encienda la lámpara de hendidura para el brillo de la luz más baja y comprobar el grado de dilatación pupilar. Si alumno no se dilata de manera adecuada (aproximadamente 2,5 a 3 mm), devuelva ratón para animales más caliente y esperar. Alternativamente, administrar otra gota de tropicamida. Una vez que el ojo es suficientemente dilatada, continúe con el procedimiento con láser. </li></ol> Procedimiento 3. Láser Nota: Asegúrese de otra personas en la sala de llevar gafas de protección cuando están lejos de láser protegido lámpara de hendidura ocular <ol><li> Ajuste la colocación del ratón en la etapa del ratón, por lo que está en una posición ideal para la visualización de nervio óptico (ver 3.1.2). <ol><li> Oriente el ratón sobre su soporte de manera que quede en posición horizontal, perpendicular a la hendidura del haz de la lámpara, con la cabeza en un lado y la cola en el otro. Colocación Ideal ratón hará que la visualización del nervio óptico mucho más fácil una vez que se aplica hoja de la cubierta. </li><li> Ligeramente gire el ratón por lo que es en un ángulo de 170 ° ~ con la cabeza más cerca de operador de láser. </li><li> Asegúrese de que el ratón es tan cerca como sea posible de la lámpara de hendidura, sin embargo, todavía en una posición en la que es estable y donde la mano del operador tendrá espacio suficiente para la manipulación fina. </li></ol></li><li> Después de que el ratón está en una posición ideal, coloque una gota de solución de lágrimas artificiales en un 25 mm x 25 mm cubreobjetos de vidrio. <ol><li> Coloque una gota de solución de lágrima artificial en del opp del ratónojo osite - este ojo se asegurará se hidrata y la formación ayuda retardo de cataratas. </li></ol></li><li> Mantenga esquina de cubreobjetos entre el pulgar y los dedos de puntero; posición de modo que el vidrio se comprime entre las puntas de los dedos de ambas. </li><li> Envolver suavemente los tres dedos restantes en todo el cuerpo del animal para el apoyo y la estabilización mano. Posición de la mano de modo que el cubreobjetos de vidrio se puede colocar fácilmente en el ojo del ratón. <ol><li> Asegúrese de que la muñeca se estabiliza en una superficie firme con el fin de reducir el temblor de las manos. </li></ol></li><li> Una vez que se obtiene la posición estable, presione con cuidado cubreobjetos de vidrio (con la gota de lágrima artificial todavía adherido) en el ojo del ratón. <ol><li> Asegúrese de que el cubreobjetos se coloca lo más perpendicular posible al rayo láser con el fin de prevenir la dispersión de haz de láser o la reflexión. El cubreobjetos actúa como una lente de contacto para aplanar la córnea. </li></ol></li><li> Mira a través de la lámpara de hendidura y con la mano libre de palanca centrarse untretina il se pueden visualizar. La retina tendrá un color claro-amarillo / rojo dependiendo de la ubicación visualizada, vasos, rojas definidas serán visibles. </li><li> Poco a poco y con cuidado manipular cabeza de ratón y / o cubreobjetos hasta visualizar el nervio óptico. El nervio óptico será de color amarillo con múltiples vasos que irradian de él. </li><li> Una vez que el operador ha confirmado la visualización del nervio óptico, encienda el láser de enfoque del haz. </li><li> Una vez que haz de láser se ha encendido, maniobrar enfoque del láser de haz a la posición deseada (aproximadamente 1 diámetro del disco del nervio óptico). </li><li> Enfoque rayo láser en la RPE del fondo de ojo. El enfoque correcto se logra haciendo que el rayo láser más nítida y más clara. Si el objetivo del haz se ve oval o fuera de foco, alternar el foco de la lámpara de hendidura o colocar cubreobjetos de vidrio. </li><li> Una vez que el haz de encuadre se centra en RPE, iniciar la administración láser utilizando gatillo pie del láser. <ol><li> Asegúrese de evitar los vasos de la retina para prevenir intraocular quemorrhage. </li></ol></li><li> Atento a la aparición de una burbuja inmediatamente después de la administración láser. El contorno de la disparo de láser debe ser clara y no turbia de ninguna manera. <ol><li> Si el disparo de láser no da lugar a la formación de burbujas, o área de impacto se ve nebuloso (aspecto turbio con borde circular mal definido vs. clara frontera claramente definida de un impacto con éxito), o si la hemorragia es visto después de la administración de láser, NO incluir estas lesiones para el análisis futuro. </li></ol></li><li> Repita los pasos 03.10 a 03.12 para todas las posiciones deseadas de la CNV (por lo general a las 3, 6, 9, y 12 en punto alrededor del nervio óptico). Si se aplican las inducciones láser en aproximadamente misma distancia del nervio óptico, el nuevo enfoque no debería ser necesario. Sin embargo, debido a la fuerte curvatura del ojo del ratón y pequeñas variaciones que puedan existir en la retina, la reorientación de la viga puede ser necesario entre las administraciones de láser consecutivos. </li><li> Grabar en un cuaderno la ubicación y el resultado de correoadministración disparo de láser ada y resultado (éxito, nebuloso, hemorragia, etc.) de cada disparo se administra para el ojo. Asegúrese de colocar el láser en modo de espera cuando no esté en uso. </li><li> Repita 03/01 a 03/14 para el ratón del otro ojo, si es necesario, usando la mano opuesta para la estabilización y un nuevo cubreobjetos. </li><li> Después se administran todos los disparos de láser deseados, apague láser y con lámpara de hendidura. </li><li> Deseche cubreobjetos y el lugar del ratón en más cálido para la recuperación de la anestesia. Macroscópicamente inspeccionar ojo por cualquier lesión y colocar una gota de solución de lágrimas artificiales para mantener el ojo hidratado y potencialmente prevenir futuro desarrollo de cataratas. Una vez que el ratón se recupere de la anestesia, volver a la jaula. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td></td><td> AVERTIN </td><td> AVERTIN </td><td> AVERTIN </td><td> XYL / KET </td><td> XYL / KET </td></tr><tr><td> Ratón Peso (g) </td><td> Dosis (mg / kg) </td><td&gt; concentración de la solución (mg / ml) </td><td> Dosis anestésico (ml) </td><td> Dosis (mg / kg) </td><td> Dosis anestésico (ml) </td></tr><tr><td> 15 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0.1875 </td><td> 100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> 16 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0.2 </td><td> 100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0.16 </td></tr><tr><td> 17 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0.2125 </td><td> 100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0.17 </td></tr><tr><td> 18 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,225 </td><td> 100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0.18 </td></tr><tr><td> 19 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0.2375 </td><td> 100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0.19 </td></tr><tr><td> 20 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0.25</td><td> 100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> 21 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0.2625 </td><td> 100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0.21 </td></tr><tr><td> 22 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,275 </td><td> 100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0.22 </td></tr><tr><td> 23 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0.2875 </td><td> 100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0.23 </td></tr><tr><td> 24 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0.3 </td><td> 100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0.24 </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0.3125 </td><td> 100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> 26 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,325 </td><td> 100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0.26 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 250 </td><td&gt; 20 </td><td> 0.3375 </td><td> 100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0.27 </td></tr><tr><td> 28 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0.35 </td><td> 100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0.28 </td></tr><tr><td> 29 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0.3625 </td><td> 100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0.29 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,375 </td><td> 100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0.3 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Dosis XyIKet Chart.

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Existen múltiples factores que pueden afectar la entrega de láser y la consiguiente desarrollo de la lesión NVC tras éxito láser inducción. Estos factores deben ser controlados por y estandarizados con el fin de tener los resultados más confiables. El más pertinente de estos factores son la selección del ratón (genotipo, edad y sexo), la selección de anestésico, y la configuración de láser. El modelo específico de ratón utilizada puede tener un efecto significativo en el curso del desarrollo...

Edad relacionados con la degeneración macular (AMD) es una de las principales causas de ceguera en personas mayores de 50 1.3. AMD se puede clasificar en dos formas: atrófica (&quot;secar&quot;) y AMD neovascular (&quot;húmeda&quot;) de AMD. El primero se caracteriza por la atrofia geográfica del epitelio pigmentario de la retina (RPE), coriocapilar, y los fotorreceptores, mientras que el último se caracteriza por la invasión de vasos anormales de la coroides en las capas externas de la retina causando fugas, hemorragia y fibrosis, y en última instancia que conduce a la ceguera 1,2. De las dos formas, AMD neovascular da cuenta de la mayoría de la pérdida de visión 1. Afortunadamente, esta forma tiene numerosas opciones de gestión farmacológicos eficaces, mientras que su contraparte atrófica Actualmente no ha probado los tratamientos médicos 3. Además, debido a la forma neovascular ha sido re-capitulado fácilmente en un modelo animal, ha sido más ampliamente accesible a A básicaInvestigación MD explorar los mecanismos patológicos subyacentes a fin de desarrollar nuevas terapias 4. El primer modelo animal experimental de la neovascularización coroidea (CNV) fue desarrollado por Ryan et al. en primates no humanos 5. Esta ruptura modelo inducido de la membrana de Bruch a través de la fotocoagulación con láser, lo que provocó una respuesta inflamatoria local dando como resultado en la angiogénesis similar a la observada en neovascular AMD. Se encontró que la progresión histopatológico de la angiogénesis inducción post-láser para imitar la DMAE neovascular, que confirmó la validez del modelo de 6. Los primates no humanos ofrecer la anatomía más similares a los humanos, pero desafortunadamente, son caros de mantener, no puede ser manipulado fácilmente genéticamente, y tienen un curso lento tiempo de progresión de la enfermedad 7. En contraste, los modelos de roedores son mucho más rentable para mantener, pueden ser manipulados genéticamente con relativa facilidad, y tienen un mucho más rápido course de progresión de la enfermedad (experimentos pueden llevarse a cabo en una escala de tiempo de semana frente a meses). Estos experimentos solamente deben llevarse a cabo en roedores pigmentadas ya que es muy difícil de visualizar en animales albinos. El modelo CNV inducida por láser del ratón, primero desarrollado por el grupo Campochiaro a finales del 90 de 10, se ha convertido en el modelo animal dominante en la mayoría de los estudios recientes 11-16. Debido a la patogénesis complejo y todavía no está claro de CNV, el modelo de láser se ha aplicado en todos los aspectos de la investigación AMD húmeda que van desde el estudio de los mecanismos moleculares de conducción de la angiogénesis para la evaluación de nuevas modalidades de tratamiento para el futuro uso humano. Por ejemplo, Sakurai et al. y Espinosa-Heidmann et al. utilizado el modelo de láser para investigar el efecto de los macrófagos en el desarrollo de la CNV utilizando ratones transgénicos y los tratamientos farmacológicos de agotamiento 15, 16. Giani et al. y Hoerster et al. usado tomografía óptica de coherencia-(OCT) para la imagen de la CNV en un esfuerzo por caracterizar la progresión de la CNV y comparar los resultados con los hallazgos histopatológicos observados en imágenes de OCT 12,17 inducida por láser. Finalmente, los estudios que implican la inyección intravítrea de agentes anti-angiogénicos se han utilizado como pre-requisitos para los ensayos en humanos y fueron vitales en el desarrollo de la primera generación de agentes anti-VEGF utilizadas en la gestión de AMD neovascular hoy 10,18,19. Modelos alternativos para la CNV experimental utilizan métodos quirúrgicos para inducir la CNV. Este procedimiento implica la inyección de sustancias pro-angiogénicos (por ejemplo, vectores virales recombinantes que sobreexpresan VEGF, inyección subretiniana de células del EPR y / o perlas de poliestireno) para imitar el aumento de la expresión del VEGF se ve en neovascular AMD, con el objetivo de causar la angiogénesis 8,20. Sin embargo, este método produce una incidencia drásticamente inferior de la neovascularización; estos estudios mostraron que en la CNVRatones C57 / BL6 se produce en 31% de las inyecciones frente al ~ 70% de éxito visto en el método de la fotocoagulación con láser en la misma cepa de ratones 8,14. Por estas razones, y dadas las ventajas del uso de roedores en comparación con primates no humanos, el modelo de ratón de la CNV inducida por láser se ha convertido en el modelo animal estándar para la mayoría de CNV neovasculares experimentos de estudio de AMD 8. El ojo es un ratón, delicado tejido minúsculo para trabajar. Maniobras del ojo para visualizar la retina es difícil y requiere mucha práctica hasta que se alcanza la maestría. Esta tarea se complica por el hecho de que debe ser aprendido con la mano dominante y no dominante. Por otra parte, después de que los finos movimientos necesarios para visualizar la retina se han aprendido, la coordinación entre ambas manos y el pedal de funcionamiento del láser son importantes. En este trabajo, hemos tratado de destilar los desafíos de aprender todas las manipulaciones físicas involucradas en la CNV proc inducida por láseredure en una guía que ayudará a los operadores a lograr un rápido éxito con este modelo.

<table><tbody><tr><td>Láser oftálmico de argón de 532 nm (verde)</td><td>IRIDEX</td><td>GLx</td><td>cualquier láser de argón oftálmico de 532 nm (verde) se puede utilizar</td></tr> lámpara <tr>de<td>hendidura</td><td>Carl Zeiss</td><td>30SL-M</td><td>cualquier lámpara de hendidura puede utilizarse siempre que sea compatible con el láser</td></tr><tr><td>tribromoetanol</td><td>Sigma</td><td>T48402-25G</td><td>utilizado para fabricar anestésico</td></tr><tr><td>alcohol terc-amílico</td><td>Sigma</td><td>152463-1L</td><td>utilizado para hacer anestésico</td></tr><tr><td>viales de vidrio ámbar + septos</td><td>Wheaton</td><td>WH-223696</td> toallitas tisú de <td>almacenamiento de tribromoetanol</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td>varios&nbsp;</td></tr><tr><td>1% Tropicamide</td><td>Falcon Pharmaceuticals</td><td>RXD2974251</td><td>dilatación pupilar</td></tr><tr><td>0,5% Clorhidrato de tetracaína</td><td>Alcon</td><td>&nbsp; 0065-0741-12</td><td>anestesia tópica</td></tr><tr><td>lágrimas artificiales</td><td>Alcon</td><td>&nbsp; 58768-788-25 bomba de terapia de</td> calor de <td>hidratación</td></tr><tr><td>(para calentar animales)</td><td>Kent Scientific</td><td>HTP-1500</td><td>utilizado para mantener la temperatura corporal de los animales</td></tr><tr><td>almohadilla de calentamiento</td><td>Kent Scientific</td><td>TPZ-0510EA mantiene la</td><td>temperatura corporal del animal</td></tr><tr><td>30 G agujas de insulina</td><td>BD</td><td>328418</td> IP báscula de <td>inyección de anestesia</td></tr><tr><td></td><td>Báscula de pesaje americana</td><td>AWS-1KG-BLK</td><td>Pesaje de ratón</td></tr><tr><td>cubreobjetos (25 mm x 25 mm)</td><td>VWR</td><td></td><td>48366089 aplanar la córnea para visualizar la retina del ratón</td></tr><tr><td>xilacina</td><td>obtenida de la institución</td> obtenida de la <td>anestesia</td>de <td>la institución</td></tr><tr><td>ketamina</td><td>obtenida</td><td>de la</td> institución de <td>la anestesia</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>utilizada para la reconstrucción volumétrica</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Institutos Nacionales de Salud</td><td></td><td>utilizados para el análisis de imágenes</td></tr></tbody></table>

un modelo de ratón para inducida por láser neovascularización coroidea

A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

El modelo de neovascularización coroidea (CNV) inducida por láser en ratón ha sido un modelo crucial para la investigación de la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) neovascular. Al administrar una lesión selectiva con láser en el EPR y la membrana de Bruch, el procedimiento induce la angiogénesis, modelando la patología distintiva observada en la DMAE neovascular. 
Desarrollado por primera vez en primates no humanos, el modelo CNV inducido por láser ha llegado a implementarse en muchas otras especies, la más reciente de las cuales es el ratón. Los experimentos con ratones son ventajosamente más rentables, los experimentos se pueden ejecutar en una línea de tiempo mucho más rápida y permiten el uso de varios modelos transgénicos. Sin embargo, el tamaño en miniatura del ojo del ratón plantea un desafío particular al realizar el procedimiento. La manipulación del ojo para visualizar la retina requiere la práctica de habilidades de destreza fina, así como la coordinación simultánea mano-ojo-pie para operar el láser. Sin embargo, una vez dominado, el modelo se puede aplicar para estudiar muchos aspectos de la DMAE neovascular, como los mecanismos moleculares, el efecto de las manipulaciones genéticas y los efectos del tratamiento farmacológico. 
El modelo de CNV inducido por láser, aunque útil, no es un modelo perfecto de la enfermedad. Por lo demás, el ojo del ratón de tipo salvaje está sano, y el entorno corio-retiniano no imita los cambios patológicos en la DMAE humana. Además, la angiogénesis inducida por lesiones no refleja las mismas vías que la angiogénesis que ocurre en un estado de enfermedad crónica y relacionada con la edad como en la DMAE.
A pesar de sus deficiencias, el modelo de CNV inducido por láser es uno de los mejores métodos disponibles actualmente para estudiar la patología debilitante de la DMAE neovascular. Su implementación ha llevado a una comprensión más profunda de la patogénesis de la DMAE, además de contribuir al desarrollo de muchas de las terapias disponibles actualmente para la DMAE.

La cuantificación de las lesiones CNV se puede realizar mediante el análisis de coroides-plana montada utilizando la tinción de inmunofluorescencia para etiquetar los vasos de la CNV. Los dos métodos utilizados con mayor frecuencia de la preparación del tejido son etiquetado FITC-dextrano, hecho a través de la perfusión inmediatamente antes del sacrificio de los animales, o post-mortem inmuno-tinción con un marcador de células endoteliales. Ambos métodos se han descrito anteriormente en detalle 13,14,21; <str...

Aquí, presentamos el protocolo de neovascularización coroidea (CNV) inducida por láser en ratones, un modelo experimental que recrea las características vasculares de la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) neovascular. Una vez dominado, puede inducir de forma fiable y eficaz la CNV como sistema modelo para probar diversas medidas experimentales.

Un modelo de ratón para inducida por láser neovascularización coroidea

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

El objetivo general de este procedimiento es recrear los signos característicos de la degeneración macular relacionada con la edad de tipo neovascular o una MD en un modelo animal fácil de estudiar. Este método puede utilizarse para investigar diferentes aspectos de la investigación sobre la DM neovascular, incluyendo cómo las alteraciones genéticas o los tratamientos farmacéuticos pueden afectar la enfermedad, o cómo ésta puede manifestarse bajo diferentes modalidades de imagen. La principal ventaja de esta técnica es que, una vez dominada, es fácil de reproducir, lo que permite realizar experimentos de forma rápida y eficiente.Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque carecen de la destreza fina y la coordinación necesarias para tener éxito, ambas mejoran con la práctica. Para preparar la posición de la estación del láser, coloque el láser y la lámpara de hendidura de manera que puedan accederse fácilmente, encienda el láser y ajústelo a los parámetros predeterminados. Aquí, se utiliza una configuración de 75 micrómetro, tamaño de punto, potencia de 100 milivatios y duración de 100 milisegundos.A continuación, coloque cerca del operador del láser el anestésico, el calentador para animales, las toallitas para tejidos y los colirios. Después de anestesiar al primer ratón, colóquelo sobre el calentador para animales durante aproximadamente tres a cinco minutos. Realice una compresión del dedo del pie para asegurar una anestesia completa.Luego, utilice una toallita de papel enrollada para prevenir la aspiración nasal del líquido que pueda escurrir. Coloque una gota de 30 microlitros de clorhidrato de tetracaína en cada ojo. Espere dos minutos para que la solución haga efecto.A continuación, aplique una gota de anestésico tópico a cada ojo para dilatar las pupilas. Espere dos minutos para que la solución haga efecto. Ahora coloque rápidamente el ratón en la plataforma para ratón y luego coloque la plataforma en el reposacabezas del biomicroscopio de hendidura.Encienda la lámpara de hendidura y ajústela al nivel más bajo de intensidad luminosa. Evalúe la dilatación de la pupila del ratón. Si la pupila no ha alcanzado una dilatación de 2,5 a tres milímetros.Devuelva el ratón al calentador de animales o administre una gota adicional de tropicamida tras la dilatación de la pupila. Oriente el ratón sobre la plataforma de manera que quede horizontal y perpendicular al haz de luz estrecha. Gire ligeramente el ratón para que no forme un ángulo aproximado de 170 grados.Con la cabeza orientada más cerca del operador del láser, coloque al ratón lo más cerca posible de la lámpara de hendidura, manteniendo la estabilidad de la plataforma y dejando suficiente espacio para que el operador realice manipulaciones motoras finas. Una vez que el ratón esté correctamente posicionado, aplique una gota de solución de lágrima artificial sobre un cubreobjetos de vidrio de 25 milímetros por 25 milímetros. Asimismo, coloque una gota de esta solución sobre el ojo no tratado del ratón para prevenir la deshidratación.Sujete una esquina de la lámina de cubierta entre el pulgar y el dedo índice, y enrolle los tres dedos restantes alrededor del ratón para sostener y estabilizar tanto al animal como la mano del operador. Luego, presione cuidadosamente la lámina de cubierta sobre el ojo del ratón para aplanar la córnea.Coloque el cubreobjetos perpendicular al trayecto del haz láser para evitar dispersión o reflexión del haz. Mirando a través de la lámpara de hendidura, use la mano libre para ajustar el enfoque hasta que la retina entre en el campo de visión. La retina debe aparecer de color amarillo claro a rojo con vasos sanguíneos rojos bien definidos; mueva lentamente y con cuidado la cabeza del ratón o el cubreobjetos hasta que se observe el nervio óptico.El nervio óptico será de color amarillo con múltiples vasos sanguíneos que irradian desde él. Luego encienda el haz láser de enfoque y ajústelo para enfocar en el epitelio pigmentario retiniano o EPR del fondo del ojo. Si el haz de enfoque parece ovalado o desenfocado, ajuste el enfoque de la lámpara de hendidura o la cubierta de la lámina.Cuando el haz de enfoque esté adecuadamente ajustado, use el activador con el pie para iniciar la administración del láser. Debe formarse una burbuja inmediatamente después de la administración del láser. Las lesiones con bordes difusos o los ojos con lesiones hemorrágicas deben excluirse del análisis. Asegúrese de observar la formación de la burbuja y un área circular clara y bien definida, lo que indica una quemadura láser enfocada.Las lesiones que no produzcan una burbuja podrían no inducir adecuadamente la neovascularización coroidea o CNV. Cree lesiones adicionales en todas las posiciones deseadas de neovascularización coroidea o CNV. Cambie el láser al modo de espera cuando no esté en uso y registre en un cuaderno de laboratorio la ubicación y el resultado de cada administración del láser.Repita la administración del láser en el segundo ojo del ratón utilizando un portaobjetos nuevo y la mano opuesta para estabilizar al ratón. Después de completar todas las administraciones, apague el láser y la lámpara de hendidura, deseche el portaobjetos y coloque al ratón sobre el calentador de animales. Macroscópicamente.Inspeccione el ojo en busca de lesiones en la superficie corneal o cataratas. Tras la recuperación, devuelva el ratón a su jaula. Las CNV se cuantificaron mediante el análisis de montajes planos de coroides tras la tinción inmunofluorescente aquí descrita.La marcación con dextrano se realizó mediante perfusión inmediatamente antes del sacrificio del animal. A continuación, se llevó a cabo la cuantificación del área mediante umbralización en ImageJ. Posteriormente, se realizó la tinción inmunológica post mortem con el marcador de células endoteliales ISO selectina GS IB cuatro, seguida de imágenes mediante microscopía confocal.Se generaron reconstrucciones 3D de la lesión de NVC en vista frontal y lateral. También se utilizó la imagenología de tomografía de coherencia óptica para visualizar las lesiones de NVC in vivo. Aquí se muestra una imagen transversal de la retina con una lesión de NVC marcada con un círculo amarillo.Asimismo, se muestra una imagen en FOSS de la lesión, marcada con un círculo amarillo. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 10 minutos si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que el animal esté adecuadamente anestesiado y colocar las manos de forma que el animal quede sostenido y estable.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar el enfoque. Las quemaduras con láser para inducir la NVC, que posteriormente puede estudiarse de varias maneras.

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Research

Investigación

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Medicine

Medicina

El glaucoma es una de las principales causas de ceguera en el mundo. La presión intraocular elevada es un factor de riesgo importante. La fotocoagulación con láser hipertensión ocular inducida es uno de los modelos animales bien establecida. Este video muestra la forma de inducir la hipertensión ocular mediante fotocoagulación con láser de argón en la rata.

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Hipertensión ocular crónica se induce mediante fotocoagulación con láser de la malla trabecular en los ojos de ratón. La presión intraocular (PIO) es elevada durante varios meses después del tratamiento con láser. La disminución de la agudeza visual y la sensibilidad al contraste de los animales experimentales se vigila por medio de la prueba de optomotor.

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La neovascularización (NV) de la córnea puede complicar múltiples patologías visuales. Utilizando un modelo de lesión de álcali-quema controlada, un nivel cuantificable de NV corneal puede ser producido para el estudio mecanicista de la NV corneal y la evaluación de posibles terapias para trastornos neovasculares.

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Aquí, describimos un protocolo optimizado para la oclusión de la vena retiniana utilizando rosa de bengala y un sistema de microscopio de imágenes de retina guiado por láser con recomendaciones para maximizar su reproducibilidad en cepas modificadas genéticamente.

Optimización del modelo de ratón de oclusión de venas retinianas para limitar la variabilidad

Aquí, describimos una técnica de imagen in vivo utilizando tomografía de coherencia óptica para facilitar el diagnóstico y la medición cuantitativa de la retinopatía en ratones.

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Este protocolo se centra en la neovascularización corneal inducida por quemaduras alcalinas en ratones. El método genera un modelo de enfermedad corneal reproducible y controlable para estudiar la angiogénesis patológica y los mecanismos moleculares asociados y probar nuevos agentes farmacológicos para prevenir la neovascularización corneal.

Un modelo de ratón para la neovascularización corneal por quemadura alcalina

Actualmente, la angiografía con fluoresceína (AF) es el método preferido para identificar patrones de fuga en modelos animales de neovascularización coroidea (NVC). Sin embargo, la AF no proporciona información sobre la morfología vascular. Este protocolo describe el uso de la angiografía con verde de indocianina (ICGA) para caracterizar diferentes tipos de lesiones de NVC inducida por láser en modelos de ratón.

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Indocianina verde Angiografía (o ICGA) realizado por inyección en la vena de la cola proporciona imágenes de curso temporal ICGA alta calidad para caracterizar las anormalidades en la coroides ratón.

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Aprende a inducir neovascularización coroidea en ratones mediante láser para investigar la degeneración macular asociada a la edad neovascular. Este protocolo reproducible permite estudiar tratamientos farmacéuticos y factores genéticos en oftalmología.

Un modelo de ratón para inducida por láser neovascularización coroidea

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