Un modelo de ratón para inducida por láser neovascularización coroidea
27 de diciembre de 2015
Aquí, presentamos el protocolo de neovascularización coroidea (CNV) inducida por láser en ratones, un modelo experimental que recrea las características vasculares de la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) neovascular. Una vez dominado, puede inducir de forma fiable y eficaz la CNV como sistema modelo para probar diversas medidas experimentales.
El objetivo general de este procedimiento es recrear las características distintivas de la degeneración macular neovascular relacionada con la edad o una distrofia muscular en un modelo animal fácil de estudiar. Este método se puede utilizar para estudiar diferentes facetas de la investigación neovascular A MD, incluida la forma en que las alteraciones genéticas o los tratamientos farmacéuticos pueden afectar a la enfermedad o cómo la enfermedad puede manifestarse bajo diferentes modalidades de imagen. La principal ventaja de esta técnica es que, una vez dominada, es fácil de reproducir, lo que permite realizar experimentos de forma rápida y eficaz.
Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque carecen de la destreza y la coordinación finas para tener éxito, las cuales mejoran con la práctica. Para preparar la posición de la estación láser, el láser y la lámpara de hendidura donde se pueda acceder fácilmente, encienda el láser y configúrelo a los parámetros predeterminados. Aquí, se utilizan los ajustes de 75 micrómetros, el tamaño del punto, la potencia de 100 milivatios y la duración de 100 milisegundos.
A continuación, coloque la anestesia, el calentador de animales, las toallitas y las gotas para los ojos con un fácil alcance del operador láser. Después de anestesiar al primer ratón, colóquelo en el calentador de animales durante aproximadamente tres a cinco minutos. Realice un pellizco en el dedo del pie para asegurar una anestesia completa.
Luego, use una toallita de papel enrollada para evitar la aspiración nasal del deslizamiento de líquidos. Coloque una gota de 30 microlitros de clorhidrato de tetracaína en cada ojo. Espere dos minutos para que la solución haga efecto.
A continuación, aplique una gota de Tropic Aide tópico en cada ojo para dilatar las pupilas. Y espere dos minutos para que la solución haga efecto. Ahora coloque rápidamente el mouse en el escenario del mouse y luego coloque el escenario en el resto de la barbilla de la lámpara de hendidura.
Encienda la lámpara de hendidura y ajústela al brillo de luz más bajo. Evalúa la dilatación de la pupila del ratón. Si la pupila no ha alcanzado de 2,5 a tres milímetros de dilatación.
Regrese el ratón al calentador de animales o administre una gota adicional de tropic aide después de la dilatación de la pupila. Oriente el ratón sobre la plataforma de modo que quede horizontalmente perpendicular a la viga de hendidura. Gire ligeramente el ratón para que no quede en un ángulo de aproximadamente 170 grados.
Con el cabezal orientado más cerca del operador láser, coloque el mouse lo más cerca posible de la lámpara de hendidura mientras mantiene la estabilidad de la plataforma y deja suficiente espacio para que el operador realice manipulaciones de motricidad fina. Una vez que el mouse esté colocado correctamente, aplique una gota de solución de lágrimas artificiales en un cubreobjetos de vidrio de 25 milímetros por 25 milímetros. Además, coloque una gota de esta solución en el ojo no deseado del ratón para evitar la deshidratación.
Sujete una esquina de la cubierta entre el pulgar y el dedo índice, y envuelva los tres dedos restantes alrededor del ratón para sostener y estabilizar tanto el animal como la mano del operador. A continuación, presione con cuidado la tapa. Deslízalo sobre el ojo del ratón para aplanar la córnea.
Coloque el cubreobjetos perpendicular a la trayectoria del rayo láser para evitar la dispersión o el reflejo del haz. Mirando a través de la lámpara de hendidura, use la mano libre para ajustar el enfoque hasta que la retina aparezca a la vista. La retina debe aparecer de color amarillo claro a rojo, con la presencia de vasos sanguíneos rojos distintivos, moviendo lenta y cuidadosamente la cabeza del ratón o el cubreobjetos hasta que se observe el nervio óptico.
El nervio óptico será amarillo con múltiples vasos sanguíneos irradiando desde él. A continuación, encienda el haz de enfoque láser y maniobre para enfocar el epitelio pigmentario de la retina o RPE del fondo del ojo. Si el haz de enfoque parece estar ovalado o desenfocado, ajuste el enfoque de la lámpara de hendidura o el deslizamiento de la cubierta.
Cuando el haz de enfoque esté ajustado correctamente, use el gatillo de pie para iniciar la administración del láser. Se debe formar una burbuja inmediatamente después de la administración del láser. Las lesiones con bordes borrosos o los ojos con lesiones hemorrágicas deben excluirse del análisis. Asegúrese de observar la formación de burbujas y un área circular clara y bien definida que indica una quemadura láser enfocada.
Las lesiones que no producen una burbuja pueden no inducir adecuadamente la NVC. Crear lesiones adicionales en todas las posiciones deseadas de neovascularización coroidea o CNV. Cambie el láser al modo de espera cuando no esté en uso, registre en un cuaderno de laboratorio la ubicación y el resultado de cada administración de láser.
Repita la administración del láser para el segundo ojo del ratón utilizando un cubreobjetos nuevo y la mano opuesta para estabilizar el ratón. Después de completar todas las administraciones, apague el láser y la lámpara de hendidura, deseche el cubreobjetos y coloque el ratón sobre el animal. Más cálido macroscópicamente.
Inspeccione el ojo en busca de cualquier superficie de la córnea o lesión de cataratas. Después de la recuperación, regrese el ratón a su jaula. Las CNV se cuantificaron mediante el análisis de coroides montadas en plano después de la tinción inmunofluorescente aquí.
El marcaje de dextrano Fit c se realizó por perfusión inmediatamente antes del sacrificio del animal. A esto le siguió la cuantificación del área mediante umbral en la inmunotinción postmortem de la imagen J.Here con el marcador de células endoteliales. Se realizó la selección ISO GS IB cuatro, seguida de imágenes mediante microscopía confocal.
Se generaron reconstrucciones 3D de la lesión de CNV en FOSS y vista lateral. También se utilizó la tomografía de coherencia óptica para visualizar las lesiones de CNV in vivo. Aquí, se muestra una imagen transversal de la retina con una lesión de CNV encerrada en un círculo amarillo.
También se muestra una imagen en FOSS de la lesión, encerrada en un círculo amarillo. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 10 minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que el animal esté debidamente anestesiado y colocar las manos de manera que esté apoyado y estable.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo entregar el enfoque. El láser quema para inducir CNV, que posteriormente se puede estudiar de diversas maneras.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para inducir neovascularización coroidea (CNV) en ratones, imitando las características vasculares de la degeneración macular relacionada con la edad de tipo neovascular (AMD). El método está diseñado para ser reproducible y eficiente en diversos estudios experimentales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Oftalmología
- Modelos experimentales
Antecedentes
- La DMAE neovascular es una causa principal de pérdida de la visión.
- Los modelos animales son esenciales para estudiar los mecanismos de la enfermedad.
- El modelo de CNV permite probar intervenciones genéticas y farmacéuticas.
- Las habilidades motoras finas son cruciales para la implementación exitosa del protocolo.
Objetivo del estudio
- Reproducir los signos característicos de la DMAE neovascular en un modelo murino.
- Facilitar la investigación sobre los efectos de tratamientos y factores genéticos.
- Proporcionar un método confiable para estudiar la progresión de la enfermedad.
Métodos Utilizados
- Preparación de la estación láser con configuraciones específicas.
- Uso de un láser y lámpara de hendidura para inducir la NVC.
- Seguimiento de la neovascularización inducida.
- Evaluación de la reproducibilidad y eficiencia del modelo.
Resultados principales
- El protocolo induce eficazmente la neovascularización coroidea en ratones.
- Una vez dominado, el método permite realizar experimentos rápidamente.
- Se observa variabilidad en las tasas de éxito entre usuarios inexpertos.
- El modelo puede utilizarse para explorar diversas líneas de investigación sobre la DMAE.
Conclusiones
- El modelo de CNV en ratón es una herramienta valiosa para la investigación de la DMAE.
- El dominio de la técnica es esencial para obtener resultados consistentes.
- Este método puede avanzar en la comprensión de la DMAE y de tratamientos potenciales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El modelo de ratón de neovascularización coroidea (CNV) inducida por láser proporciona un sistema reproducible y rentable para estudiar la degeneración macular relacionada con la edad de tipo neovascular (DMAE), permitiendo la evaluación rápida de intervenciones genéticas y farmacológicas. Su utilidad radica en la modelización de vías angiogénicas relevantes para la validación de dianas y la reducción de riesgos preclínicos en el descubrimiento de fármacos en oftalmología. El modelo permite estudios mecanicistas y cribado terapéutico, ofreciendo una continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la optimización de compuestos líderes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar las vías angiogénicas y los mecanismos moleculares que impulsan la formación de neovasos coroideos (CNV).
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de dianas mediante manipulación genética y lecturas fenotípicas.
- Valor estratégico: Facilita la comprobación de hipótesis y la reducción biológica de riesgos de dianas implicadas en la disregulación vascular.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera lesiones de CNV cuantificables mediante tinción por inmunofluorescencia y umbralización con ImageJ para análisis de respuesta a la dosis.
- Valor operativo: Permite la inducción estandarizada de lesiones con parámetros láser reproducibles (tamaño de punto de 75 µm, potencia de 100 mW, duración de 100 ms).
- Valor estratégico: Permite la evaluación de alto rendimiento de los efectos de compuestos sobre la fuga vascular y la neovascularización.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Modela la angiogénesis relevante para la enfermedad para evaluar la eficacia terapéutica en un sistema vivo.
- Valor operativo: Compatible con modalidades de imagen como la tomografía de coherencia óptica (OCT) y la microscopía confocal para el monitoreo longitudinal.
- Valor estratégico: Apoya las decisiones de continuar o descartar al vincular la modulación del blanco con resultados fenotípicos en un modelo preclínico de DMAE.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El modelo se integra en el continuo de descubrimiento desde la identificación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, proporcionando lecturas fenotípicas que informan las decisiones de avance preclínico.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la aclaración de vías y la validación de dianas mediante la formación inducible de CNV en ratones silvestres y transgénicos.
- Detección: Proporciona resultados angiogénicos estandarizados y cuantificables adecuados para la exploración de bibliotecas de compuestos.
- Análisis: Permite la cuantificación del área de lesión y la reconstrucción 3D para análisis comparativo entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta intervenciones moleculares con patología vascular, apoyando la evaluación preclínica alineada con biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la prueba iterativa de modificadores genéticos y farmacológicos de CNV.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la interacción con el blanco mediante la modelización de respuestas angiogénicas in vivo.
- Valor operativo: Ofrece reproducibilidad y escalabilidad una vez alcanzada la competencia técnica, reduciendo la variabilidad experimental.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir iteraciones rápidas y la detección temprana de fracasos en programas de DMAE.
- Impacto en la cartera: Informa la priorización ajustada al riesgo de blancos basándose en su modulación de fenotipos de neovascularización coroidea.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microcirugía, interacción láser-tejido y visualización retiniana con guía de lámpara de hendidura.
- Depende de la calibración precisa del láser y de la posición estable del animal para asegurar la formación consistente de lesiones.
- Necesita estandarización entre operadores para minimizar la variabilidad en la inducción y cuantificación de la neovascularización coroidea (CNV).
- Las consideraciones para la adaptación incluyen fondos transgénicos y puntos finales de imagen alternativos para lecturas específicas de vías.
- Las limitaciones prácticas incluyen la naturaleza aguda e inducida por lesión de la angiogénesis, que puede no replicar completamente la fisiopatología crónica de la DMAE.
