Generación de doble emulsión utilizando un flujo Focus Dispositivo de polidimetilsiloxano (PDMS) Co-axial

El objetivo general de este procedimiento es construir y probar un dispositivo microfluídico de polidimetilsuboxano que utilice el enfoque de flujo coaxial para generar emulsiones dobles. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en química y biología que requieren un cribado de rendimiento ultra alto, como la evolución dirigida de las enzimas y la identificación de fenotipos raros. La principal ventaja de esta técnica es que permite la producción rápida de generadores de doble emulsión utilizando la fabricación de litografía blanda sin tratamientos superficiales especializados.

Para empezar, diseñe las estructuras microfluídicas para la fabricación de dos capas. Con el software AutoCAD, imprima los diseños en una película de placa de circuito con una resolución de 10 micras como se describe en la referencia que se muestra aquí. Aplique uno o dos mililitros de SU 8 30 35 en el centro de una oblea de silicona de tres pulgadas de diámetro previamente limpia, colóquela en un codificador de giro y fíjela al mandril.

Gire durante 20 segundos a 500 RPM seguido de 30 segundos a 2000 RPM. Retire la oblea y hornee en una placa caliente a 135 grados Celsius durante 30 minutos. Deje que la oblea se enfríe a temperatura ambiente antes de pasar al siguiente paso.

Ahora exponga la oblea recubierta a la máscara para la primera capa bajo una luz LED intercalada durante 90 segundos. Después de la exposición, vuelva a colocar la oblea en la placa caliente a 135 grados centígrados durante un minuto. Una vez enfriado, aplique uno o dos mililitros de SUH 2050 en el centro de la oblea.

Vuelva a colocar la oblea en el codificador de giro y gire durante 20 segundos a 500 RPM. Luego gire durante 30 segundos a 1, 375 RPM. Cuando el codificador de giro deje de girar, retire la oblea y vuelva a colocarla en la placa calefactora a 135 grados centígrados durante 30 minutos.

Luego, enfríe la oblea nuevamente a temperatura ambiente antes de pasar al siguiente paso. Alinee la máscara de la segunda capa con la geometría que se modeló en los pasos anteriores y exponga la oblea recubierta a la luz ultravioleta una vez más durante tres minutos después de la exposición, coloque la oblea en la placa calefactora de 135 grados Celsius durante un minuto. Una vez enfriadas, se desarrollaron las mascarillas sumergiendo la oblea en un baño agitado de propilenglicol, acetato de éter monometílico.

Después de 30 minutos en el baño, retire la oblea y lávela con isopropanol. A continuación, hornee la oblea en la placa calefactora a 135 grados centígrados durante un minuto. Enfríe la oblea y luego coloque el maestro desarrollado en una placa de Petri de 100 milímetros.

Prepare un lote de PDMS combinando 50 gramos de base de silicona con cinco gramos de agente de curado en un vaso de plástico. Utilice una herramienta rotativa equipada con una varilla para mezclar los componentes y luego desgasifique la mezcla dentro de un desecador durante unos 30 minutos o hasta que se eliminen todas las burbujas de aire. A continuación, vierta el PDMS sobre el maestro hasta obtener un grosor de tres milímetros.

A continuación, coloque la placa de Petri en el desecado para su posterior desgasificación. Una vez que se hayan eliminado todas las burbujas, hornee el dispositivo a 60 grados centígrados durante dos horas. Corta el dispositivo PDMS del molde con un bisturí y colócalo sobre una superficie limpia con el lado del patrón hacia arriba.

A continuación, corte el PDMS por la mitad con una cuchilla de afeitar para separar los dos lados del dispositivo en la pieza que contiene la geometría de manejo de fluidos de 50 micrómetros impresa por el maestro uno. Perfore las entradas y salidas fluídicas con un punzón de biopsia de 0,75 milímetros. A continuación, coloque las piezas de PDMS con sus lados estampados hacia arriba en un plasma de cámara de plasma.

Trate el dispositivo con plasma de oxígeno a un milibar durante 60 segundos en un limpiador de plasma de 300 vatios. A continuación, retire las muestras y humedezca la superficie de la pieza no apagada de PDMS con una gota de agua desionizada para que sirva como lubricante temporal mientras observa el dispositivo a través de un microscopio estereoscópico. Coloque las superficies tratadas con plasma juntas y deslice las superficies hasta lograr un bloqueo mecánico.

Cuando los marcos empotrados y los marcos que sobresalen se acoplen, una vez ensamblados, coloque el dispositivo en un horno a 60 grados centígrados y hornee durante dos días para que evapore el agua y complete la unión. Luego, fije el dispositivo ensamblado a un portaobjetos de vidrio con varias gotas de PDMS sin curar, hornee la construcción en un horno a 60 grados centígrados durante una hora. Para curar el PDMS coloca, el chip microfluídico en la platina de un microscopio invertido junto con una cámara digital que es capaz de velocidades de obturación de al menos 100 microsegundos.

A continuación, monte tres jeringas de 10 mililitros en bombas de jeringa y coloque agujas de calibre 27 en cada una de ellas. Conecte unos 30 centímetros de PE a dos tubos en cada una de las agujas e inserte los extremos sueltos de los tubos en los orificios perforados apropiados del dispositivo. A continuación, inserte una longitud de 10 centímetros de PE dos en el puerto de salida del dispositivo y coloque el otro extremo en un contenedor de recogida de residuos.

Una vez configurado, cebe el dispositivo haciendo funcionar las bombas de jeringa a alta velocidad. Detenga las bombas. Una vez que el fluido en los segmentos de la tubería llega a los puertos de entrada del dispositivo, enfoque el microscopio en la región del chip que contiene un orificio de 50 por 50 micrómetros y ajuste el marco para que incluya el canal de salida aguas abajo.

Configure las bombas de jeringa para suministrar el fluido al generador de doble emulsión a un caudal de 250 microlitros por hora para la fase interna, 100 microlitros por hora para la fase intermedia y 700 microlitros por hora. Para la fase continua. Espere 10 minutos para que el sistema se equilibre.

A continuación, aumente el caudal de la fase exterior a 1050 microlitros por hora. Espere de tres a cinco minutos adicionales para que la generación de emulsiones dobles se estabilice bajo este conjunto de condiciones de flujo. Una vez estabilizado, adquiera cinco segundos de imágenes de video a 30 hercios.

Guarde los videos para procesarlos sin conexión mediante el análisis manual de imágenes. Repita este proceso mientras varía el caudal de la fase externa utilizando los valores que se encuentran en la tabla uno del protocolo de texto adjunto. Mantener las tasas de las fases interna y media.

Durante este proceso, el dispositivo de doble emulsión se probó en una variedad de condiciones de flujo. Para demostrar la formación de emulsiones dobles monodispersas de tamaño variado, se muestra encima de cada imagen la relación entre la fase continua y la suma de la fase interna y media. Los histogramas de los diámetros de las gotas para seleccionar las relaciones de flujo muestran la uniformidad relativa en el tamaño de las gotas generadas.

Las emulsiones dobles resultantes producen una variación del coeficiente de diámetro promedio del 5.2%El dispositivo demuestra la capacidad de formar emulsiones dobles significativamente más pequeñas que el ancho del orificio y muestra una clara tendencia decreciente con relaciones de flujo aumentadas. En la fase portadora más alta, se probaron emulsiones dobles de 14 micrómetros utilizando el orificio de 50 por 50 micrómetros después de su desarrollo. Esta técnica allana el camino para que los investigadores químicos y biológicos realicen experimentos de microfluídica de gotas que sean compatibles con las plataformas de detección de citometría de flujo estándar.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo fabricar y probar generadores microfluídicos de doble emulsión que utilizan técnicas de construcción simples de PDMS.