Name: Disolución dinámica de polarización nuclear Instrumentación para el tiempo real enzimática reacción de la tasa mediciones realizadas por RMN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Aprende a monitorizar procesos enzimáticos en tiempo real mediante disolución DNP y RMN de 500 MHz. Esta técnica permite cuantificar sustratos con resolución de segundos sin alterar las moléculas estudiadas.

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Los autores agradecen al Dr. JJ van der Klink para la asistencia en la elección y el montaje de los equipos, así como el Dr. F. Kateb y el Dr. G. Bertho útil para los debates. CA fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (subvención PPOOP2_157547). Reconocemos la financiación de Paris Sorbonne Cité (RMN @ Com, DIM Analytics, Ville de París, la Fundación de la Investigación Médica (FRM ING20130526708), y el Parteneriat Hubert Curien Brancusi 32662QK. Nuestro equipo es parte de los programas Equipex Paris-en-RESONANCIA y CACSICE.

NOTA: Todos los análisis de los datos se realizó utilizando el software comercial. 1. Preparar la solución polarizante <ol><li> Preparar 2 ml de una piruvato de sodio 1,12 M 13 C marcado con (Na + [CH 3 -CO- 13 COO] -, sustrato) solución dopa con 33 mM de radical TEMPOL (4-hidroxi-2,2,6,6 tetrametil-1-oxilo, agente polarizador) 4 en 2: 1 D 2 O / d 6 etanol durante 13 observaciones C. PRECAUCIÓN: Precauciones de manipulación deben ser tomadas debido a la naturaleza inflamable de d6 etanol. </li><li> Compruebe que la concentración de radicales es óptima en términos de polarización conseguido. <ol><li> Cambiar ligeramente la concentración de radicales de la solución en el punto 1.1 (por ejemplo, a 30 mM o 35 mM). </li><li> Determinar iterativamente la mejora de estado sólido (ver paso 3) y encontrar la concentración radical que conduce a la mejora máxima. </li></ol></li></ol> 2. Polarization <ol><li> Bajar la temperatura del criostato DNP a través del procedimiento de reutilización. Haga clic en el botón &#39;Enfriamiento&#39; en la interfaz de software criostato (Figura 2D). </li><li> Recoger el helio líquido en el criostato DNP a través del proceso de llenado. Haga clic en el botón de &#39;Relleno&#39; en la interfaz de software criostato (Figura 2D). </li><li> Coloque 300 l de la solución de polarización optimizado del Paso 1.1 en el recipiente de la muestra proporcionado con el polarizador de DNP. Congelar el recipiente de la muestra con la muestra en el interior por inmersión suavemente en un baño de nitrógeno líquido. </li><li> Eliminar el nitrógeno líquido que pueda estar presente en el recipiente de la muestra después de que el procedimiento de congelación (Paso 2.3) mediante la extracción del recipiente de la muestra del baño de nitrógeno líquido y girando al revés. NOTA: Este paso es crucial para obtener una disolución completa de la muestra (véase el paso 5). </li><li> Insertar la muestra en el criostato. NOTA: Este Step, compuesto por los siguientes sub-etapa, debe realizarse rápidamente (es decir, en menos de 10-20 segundos) para evitar que la muestra de la fundición. <ol><li> Insertar el recipiente de la muestra en el soporte de la muestra. Inserte el soporte de la muestra en el inserto principal criostato. Insertar la guía de ondas microondas en el soporte de la muestra. </li></ol></li><li> Bajar la temperatura del criostato iniciando el procedimiento de 1 K refrigeración. Haga clic en el botón &#39;1K de enfriamiento &quot;en la interfaz de software criostato (Figura 2D). </li><li> Encienda la fuente de microondas en e irradiar la muestra. Haga clic en el botón &quot;MW-ON &#39;en la interfaz de software criostato (Figura 2D). </li></ol> 3. Las mediciones de RMN de estado sólido <ol><li> Desconectar el cable coaxial del canal de detección de la consola de RMN de la bobina espectrómetro girando en sentido antihorario el conector de 90 ° y tirando de él. Enchufe el cable coaxial del canal de detección para el conector coaxial del criostatobobina RMN. Inserte el conector macho del cable de la consola de RMN en el conector hembra de la bobina RMN criostato, prestando atención a la orientación del pasador; presione firmemente y gire el conector hacia la derecha 90 °. </li><li> Medir la señal térmica NMR en el estado sólido en el sitio de criostato usando una secuencia de pulso-acquire sencilla con pulsos flip-ángulo bajo sin calibrar repetidas en un intervalo de T = 5 min. Después de configurar la medición, escriba en la línea de comandos del software &#39;ZG&#39; y pulse la tecla &quot;Intro&quot; del teclado. Consulte el manual de operación del espectrómetro de RMN para más detalles sobre el funcionamiento del espectrómetro y la configuración de la medición. </li><li> Medir la señal de RMN mejorada con DNP. Repetir las operaciones de paso de 3,2 después de iniciar el proceso de DNP como se describe en la Sección 2. </li><li> Desconectar el cable de canal de detección coaxial consola NMR de la bobina RMN criostato girando en sentido antihorario el conector de 90 ° y tirando de él. Conecte el cable coaxial de la detecanal cción al conector coaxial de la bobina espectrómetro. Inserte el conector macho del cable de la consola de RMN en el conector hembra de la bobina espectrómetro, prestando atención a la orientación del pasador; presione firmemente y gire el conector hacia la derecha 90 °. </li></ol> 4. Optimizar la homogeneidad del campo del imán principal ( &#39;Nivelación&#39;) <ol><li> Colocar en el espectrómetro de un tubo que contiene 500 l de mezcla producida en los experimentos anteriores (es decir, después de la etapa 6.2). </li><li> Realizar RMN espectrómetro de acuñamiento mediante la variación de la corriente en las bobinas de gradiente cuñas en busca de la máxima &#39;bloquear&#39; la señal de deuterio. Seleccione la bobina de calce correspondiente pulsando el botón correspondiente en la consola de RMN. <ol><li> Gire la perilla en la consola de RMN para determinar el sentido de giro que aumenta la señal de bloqueo. Continúe girando hasta que la señal alcanza un máximo. Seleccione otra bobina cuñas y repetir la maximización de la ONUhasta un máximo local para todas las bobinas de compensación magnética se encuentra. Consulte el manual de operación del espectrómetro de RMN para más detalles. Al final, retire la muestra utilizada para el bloqueo. </li></ol></li></ol> 5. Disolución <ol><li> Inserte 5 ml de D 2 O en la caldera de disolución de inserción. Presurizar y calentar la D 2 O por medio del hilo resistivo hasta que se alcanza T ≈ 180-200 ° C. Haga clic en el botón &quot;Preparar Calentador &#39;en la interfaz de software criostato (Figura 2D). </li><li> Después de la terminación del procedimiento de ejemplo de polarización (por ejemplo, después 3 T DNP), presurizar el criostato ligeramente por encima de la presión ambiente. Haga clic en el botón &#39;Operaciones SS&#39; en la interfaz de software criostato (Figura 2D). Retire la guía de microondas de la inserción de la disolución. </li><li> Deslizar el inserto de la disolución (Figura 3B) hacia abajo en el soporte de muestra (Figura 3A-C). El inserto de la disolución tiene que llegar a la parte inferior del soporte de la muestra y debe ser empujado firmemente para realizar una conexión estanca con el recipiente de la muestra con el fin de evitar fugas D 2 O en el criostato. </li><li> Apretar el gatillo hardware (Figura 3C-h) para comenzar la secuencia de disolución, una secuencia temporizada predeterminada de operaciones de válvulas neumáticas. </li></ol> 6. inyección <ol><li> Antes de la disolución lugar un tubo de RMN de 5 mm, que contiene 500 l de muestra (por ejemplo, D 2 O durante <img alt="Equation13" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation13.jpg" width="29" /> la medición en el paso 7 o LDH solución de la etapa 8 para las mediciones de la actividad enzimática en el Paso 9), en el isocentro del espectrómetro 11.74 T NMR (ver paso 4). </li><li> Justo después de la disolución (Paso 5), mezclar 500 l de solución hiperpolarizado con la muestra colocada en el espectrómetro de RMN en el paso 6.1. <ol><li> Inyección Manual: recoger el hiperpolarizadosolución al final de un tubo de transferencia de largo 2,5 m en un vaso de precipitados de vidrio colocado cerca del imán espectrómetro de RMN. inyectar manualmente 500 l de solución hiperpolarizado en el tubo de la muestra de RMN a través de un sistema capilar por encargo. </li><li> inyección automática: antes de que el proceso de disolución, conecte el tubo de transferencia a un dispositivo de inyección por encargo automatizado que separa la solución hiperpolarizado del gas helio utilizado para la transferencia. El dispositivo de entrega automáticamente a 500 l de solución hiperpolarizado en el tubo de muestra. </li></ol></li></ol> La medición de RMN 7. Líquido-Estado <ol><li> Después de la disolución, medir la señal hiperpolarizado RMN de la muestra en el espectrómetro por una serie de 10 secuencias de pulsos a adquirir ángulo ° flip espaciadas por 1,5 segundos para seguir la progresión de la magnetización del sustrato (A) y el producto (B). Después de configurar la medición, escriba en la línea de comandos del software &#39;ZG&#39; y pulse el botón &amp; #39, Enter &quot;del teclado. Consulte el manual de operación del espectrómetro de RMN para más detalles sobre el funcionamiento del espectrómetro y la configuración de la medición. </li><li> Una vez que la magnetización es totalmente relajado (es decir, después de T = 10 T 1), medir la señal térmica NMR por una serie de 90 ° de ángulo de flip-pulso adquirir secuencias espaciadas por T = 3 T 1 ≈ 3 min. Después de configurar la medición, escriba en la línea de comandos del software &#39;ZG&#39; y pulse la tecla &quot;Intro&quot; del teclado. Consulte el manual de operación del espectrómetro de RMN para más detalles sobre el funcionamiento del espectrómetro y la configuración de la medición. </li></ol> 8. Preparación de muestras que contienen la enzima (específico para la Transformación-piruvato a lactato) <ol><li> Preparar el tampón de reacción con la siguiente receta: 50 mM reducido de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH), ácido etilendiaminotetraacético 1 mM (EDTA), ditiotreitol 0,1 mM (DTT) en tampón fosfato 0,1 M, pH =7.0. </li><li> Preparar una solución de LDH de músculo de conejo 1 U / ml preparada recientemente en tampón de reacción con 20 g de albúmina / ml de suero bovino, BSA. </li><li> Mezclar 478 l de tampón de reacción (Paso 8.1), 20 l D2O para permitir la estabilización del campo espectrómetro ( &#39;bloqueo&#39;) y una solución de LDH 2 l (Paso 7.2). </li><li> Coloque el volumen de la solución 500 l preparado en el Paso 8.3 en un tubo de RMN de 5 mm y colocar el tubo en el espectrómetro de RMN 500 MHz. </li></ol> 9. Completar enzimática reacción de la tasa Procedimiento de medición <ol><li> Preparar la muestra de polarización (Paso 1) y polarizar él (Paso 2). </li><li> Realizar cuñas en el espectrómetro (Paso 4) y preparar la muestra enzimática (Paso 8). </li><li> Realizar la disolución (Paso 5) y la inyección (Paso 6). </li><li> Medir una serie de señales de la muestra hiperpolarizado con 10 ° de ángulo flip legumbres adquisiciones separados por 1,5 segundos (paso 7). Este paso permite la medición de la hiperpolarizadodecaimiento de la señal y la acumulación de señal de metabolitos. </li></ol> 10. montaje <ol><li> Para cada espectro adquirido en el paso 9.4, identificar los picos correspondientes al sustrato (A) y el producto (B), respectivamente, e integrarlos (determinar el área de los picos). Las integrales picos dan el curso temporal de magnetización señales (M (A, B) (t), véase la ecuación 2). </li><li> Usando la solución de la ecuación (2), determinar el valor de F = (R A + k eff ) Desde un simple ajuste exponencial de la señal de sustrato integrado en el paso 10.1. </li><li> Utilizando el valor de F = (A + R k eff ) Determinado en el paso 10.2, determinar k eff y R B a partir de un ajuste de la señal de producto M B (t) con la función obtenida mediante la integración de la ecuación (2). Consulte la sección de resultados Representante (Enzymatic actividad y mediciones metabólicas) para obtener detalles sobre la corrección de modelado de reacción, adaptación y rf. </li></ol>

<ol><li>Overhauser, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+of+Nuclei+in+Metals%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev%22%5BJournal%5D)">Polarization of Nuclei in Metals.</a> Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).</li>
<li>Abragam, A., Goldman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+dynamic+nuclear+polarisation%5BTitle%5D)+AND+%22Rep.+Prog.+Phys%22%5BJournal%5D)">Principles of dynamic nuclear polarisation.</a> Rep. Prog. Phys. 41 (3), 395(1978).</li>
<li>Wolber, J., Ellner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+highly+polarized+nuclear+spins+in+solution+using+dynamic+nuclear+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Inst.+Met.+Phys.+Res.+Sec.+A%22%5BJournal%5D)">Generating highly polarized nuclear spins in solution using dynamic nuclear polarization.</a> Nuc. Inst. Met. Phys. Res. Sec. A. 526 (1-2), 173-181 (2004).</li>
<li>Cheng, T., Capozzi, A., Takado, Y., Balzan, R., Comment, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+35%25+liquid-state+13C+polarization+obtained+via+dissolution+dynamic+nuclear+polarization+at+7+T+and+1+K+using+ubiquitous+nitroxyl+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22PCCP%22%5BJournal%5D)">Over 35% liquid-state 13C polarization obtained via dissolution dynamic nuclear polarization at 7 T and 1 K using ubiquitous nitroxyl radicals.</a> PCCP. 15 (48), 20819-20822 (2013).</li>
<li>Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+signal-to-noise+ratio+of+%3E+10%2C000+times+in+liquid-state+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR.</a> PNAS. 100 (18), 10158-10163 (2003).</li>
<li>Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+tumor+response+to+treatment+using+hyperpolarized+13C+magnetic+resonance+imaging+and+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Detecting tumor response to treatment using hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging and spectroscopy.</a> Nat. Med. 13 (11), 1382-1387 (2007).</li>
<li>Keshari, K. R., Wilson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%5B2-13C%5D-Fructose%3A+A+Hemiketal+DNP+Substrate+for+In+Vivo+Metabolic+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized [2-13C]-Fructose: A Hemiketal DNP Substrate for In Vivo Metabolic Imaging.</a> JACS. 131 (48), 17591-17596 (2009).</li>
<li>Zeng, H., Lee, Y., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Rate+Determination+by+Dynamic+Nuclear+Polarization+Enhanced+NMR+of+a+Diels%E2%88%92Alder+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22An.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative Rate Determination by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced NMR of a Diels−Alder Reaction.</a> An. Chem. 82 (21), 8897-8902 (2010).</li>
<li>Harrison, C., Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+kinetic+models+for+analysis+of+pyruvate-to-lactate+exchange+by+hyperpolarized+13C+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biom%22%5BJournal%5D)">Comparison of kinetic models for analysis of pyruvate-to-lactate exchange by hyperpolarized 13C NMR.</a> NMR in Biom. 25 (11), 1286-1294 (2012).</li>
<li>Allouche-Arnon, H., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+visualization+of+betaine+aldehyde+synthesis+and+oxidation+using+hyperpolarized+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">In vitro visualization of betaine aldehyde synthesis and oxidation using hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy.</a> Chem. Comm. 49 (63), 7076-7078 (2013).</li>
<li>Lerche, M. H., Meier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+dynamic+nuclear+polarization-NMR+on+blood+plasma+for+assays+of+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biom%22%5BJournal%5D)">Quantitative dynamic nuclear polarization-NMR on blood plasma for assays of drug metabolism.</a> NMR in Biom. 24 (1), 96-103 (2011).</li>
<li>Nelson, S. J., Kurhanewicz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Imaging+of+Patients+with+Prostate+Cancer+Using+Hyperpolarized+%5B1-13C%5DPyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Trans.+Med%22%5BJournal%5D)">Metabolic Imaging of Patients with Prostate Cancer Using Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate.</a> Sci. Trans. Med. 5 (198), 198ra108(2013).</li>
<li>Kurhanewicz, J., Vigneron, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Cancer+Metabolism+by+Imaging+Hyperpolarized+Nuclei%3A+Prospects+for+Translation+to+Clinical+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Analysis of Cancer Metabolism by Imaging Hyperpolarized Nuclei: Prospects for Translation to Clinical Research.</a> Neoplasia. 13 (2), 81-97 (2011).</li>
<li>Comment, A., Merritt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+Magnetic+Resonance+as+a+Sensitive+Detector+of+Metabolic+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized Magnetic Resonance as a Sensitive Detector of Metabolic Function.</a> Biochem. 53 (47), 7333-7357 (2014).</li>
<li>Carravetta, M., Johannessen, O. G., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+T-1+limit%3A+Singlet+nuclear+spin+states+in+low+magnetic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22PRL%22%5BJournal%5D)">Beyond the T-1 limit: Singlet nuclear spin states in low magnetic fields.</a> PRL. 92 (15), 153003(2004).</li>
<li>Carravetta, M., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+long-lived+nuclear+spin+states+in+solution+nuclear+magnetic+resonance.+I.+Singlet+states+in+low+magnetic+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Theory of long-lived nuclear spin states in solution nuclear magnetic resonance. I. Singlet states in low magnetic field.</a> J. Chem. Phys. 122 (21), 214505(2005).</li>
<li>Vasos, P. R., Comment, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+states+to+sustain+hyperpolarized+magnetization%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Long-lived states to sustain hyperpolarized magnetization.</a> PNAS. 106 (44), 18469-18473 (2009).</li>
<li>Claytor, K., Theis, T., Feng, Y., Warren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+long-lived+13C2+state+lifetimes+at+natural+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22JMR%22%5BJournal%5D)">Measuring long-lived 13C2 state lifetimes at natural abundance.</a> JMR. 239, 81-86 (2014).</li>
<li>Pileio, G., Carravetta, M., Hughes, E., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-lived+nuclear+singlet+state+of+N-15-nitrous+oxide+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">The long-lived nuclear singlet state of N-15-nitrous oxide in solution.</a> JACS. 130 (38), 12582-12583 (2008).</li>
<li>Stevanato, G., Hill-Cousins, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nuclear+Singlet+Lifetime+of+More+than+One+Hour+in+Room-Temperature+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22Ange.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Nuclear Singlet Lifetime of More than One Hour in Room-Temperature Solution.</a> Ange. Chem. Int. Ed. 54 (12), 3740-3743 (2015).</li>
<li>Ghosh, R. K., Kadlecek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+the+Persistent+Singlet+State+of+N%282%29O+in+Blood+and+Other+Solvents-Potential+as+a+Magnetic+Tracer%5BTitle%5D)+AND+%22MRM%22%5BJournal%5D)">Measurements of the Persistent Singlet State of N(2)O in Blood and Other Solvents-Potential as a Magnetic Tracer.</a> MRM. 66 (4), 1177-1180 (2011).</li>
<li>Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+hyperpolarized+13C1-pyruvate+transport+and+metabolism+in+living+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells.</a> PNAS. 106 (43), 18131-18136 (2009).</li>
<li>Comment, A., van den Brandt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+a+DNP+prepolarizer+coupled+to+a+rodent+MRI+scanner%5BTitle%5D)+AND+%22Conc.+Mag.+Res.+B%22%5BJournal%5D)">Design and performance of a DNP prepolarizer coupled to a rodent MRI scanner.</a> Conc. Mag. Res. B. 31 (4), 255-269 (2007).</li>
<li>Balzan, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+for+Molecular+Magnetic+Resonance+Imaging+and+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+using+Hyperpolarized+Nuclei%22">Methods for Molecular Magnetic Resonance Imaging and Magnetic Resonance Spectroscopy using Hyperpolarized Nuclei</a>. 5966, EPFL - EDPY. Available from:
 <a target="_blank" href="http://infoscience.epfl.ch/record/190351/files/EPFL_TH5966.pdf">http://infoscience.epfl.ch/record/190351/files/EPFL_TH5966.pdf</a> 1-140 (2013).</li>
<li>Bornet, A., Melzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boosting+Dissolution+Dynamic+Nuclear+Polarization+by+Cross+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22JPC+Letters%22%5BJournal%5D)">Boosting Dissolution Dynamic Nuclear Polarization by Cross Polarization.</a> JPC Letters. 4 (1), 111-114 (2013).</li>
<li>Bowen, S., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+injection+for+hyperpolarized+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PCCP%22%5BJournal%5D)">Rapid sample injection for hyperpolarized NMR spectroscopy.</a> PCCP. 12 (22), 5766-5770 (2010).</li>
<li>Cavadini, S., Vasos, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Singlet+states+open+the+way+to+longer+time-scales+in+the+measurement+of+diffusion+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Conc.+Mag.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Singlet states open the way to longer time-scales in the measurement of diffusion by NMR spectroscopy.</a> Conc. Mag. Res. A. 32 (1), 68-78 (2008).</li>
<li>Ahuja, P., Sarkar, R., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+States+in+Multiple-Spin+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Long-lived States in Multiple-Spin Systems.</a> Chem. Phys. Chem. 10 (13), 2217-2220 (2009).</li>
<li>Ahuja, P., Sarkar, R., Jannin, S., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+hyperpolarisation+preserved+in+long-lived+states%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Proton hyperpolarisation preserved in long-lived states.</a> Chem. Comm. 46 (43), 8192-8194 (2010).</li>
<li>Sarkar, R., Comment, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+NMR+of+15N-Choline+Metabolites+Enhanced+by+Dynamic+Nuclear+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">Proton NMR of 15N-Choline Metabolites Enhanced by Dynamic Nuclear Polarization.</a> JACS. 131 (44), 16014-16015 (2009).</li>
</ol>

Los autores declaran que no han competencia de los intereses financieros

Los puntos críticos de la disolución experimento DNP RMN son: (i) el nivel de polarización conseguido por el sustrato, que determina la concentración de producto más baja necesaria para los experimentos, así como el número de adquisiciones de señal que se pueden realizar y (ii) los tiempos de vida de magnetización, en comparación con la duración de la transferencia entre la polarización y los sitios de detección y de la tasa de transformación de sustrato. El sistema de inyección de la configuración de DNP disolución des...

<table><tbody><tr><td>Polarizador DNP</td><td>Vanderklink s.a.r.l (Suiza)</td><td></td><td>Criostato y equipos electrónicos para la polarización de muestras</td></tr><tr><td>Componentes del sistema de vacío</td><td>Edwards vacuum (Francia)</td><td>Varios</td><td> - configuración de bombeo turbomolecular - configuración de bombeo de membrana - sistema de bombeo de raíces de alta capacidad - accesorios y componentes de vacío </td></tr><tr><td>DNP 3.35T Magnet</td><td>Bruker (Francia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro de RMN de 500 MHz</td><td>Bruker (Francia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 8.0</td><td>OriginLab (US)</td><td></td><td>Software de análisis</td></tr> <tr><td>de datosChemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C</td><td>Sigma Aldrich (Francia)</td><td>490709</td><td></td></tr><tr><td>ETANOL-D6, ANHIDRO, 99.5 ATOM % D</td><td>Sigma Aldrich (Francia)</td><td>186414</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 4-Hydroxy-TEMPO 97%</td><td>Sigma Aldrich (Francia)</td><td>176141</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de deuterio</td><td>Sigma Aldrich (Francia)</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>nicotinamida reducida dinucleótido de adenina (NADH)</td><td>Sigma Aldrich (Francia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ácido etileno-diaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich (Francia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich (Francia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tampón de fosfato, pH&nbsp;=&nbsp; 7.0</td><td>Sigma Aldrich (Francia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enzima LDH en&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich (Francia)</td><td>L-2500</td><td></td></tr><tr><td>albúmina sérica bovina, BSA</td><td>Sigma Aldrich (Francia)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

disolución dinámica de polarización nuclear instrumentación para el tiempo real enzimática reacción de la tasa mediciones realizadas por rmn

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

La principal limitación de las investigaciones basados ​​en RMN es baja sensibilidad. Esto incita para largos tiempos de adquisición, evitando así que las mediciones de RMN en tiempo real de las transformaciones metabólicas. Hiperpolarización mediante la disolución DNP elude parte de la sensibilidad emite gracias a la gran magnetización nuclear fuera de equilibrio resultante de la transferencia de espín polarización de electrones al núcleo. La señal de RMN de alta obtenida puede ser utilizada para controlar las reacciones químicas en tiempo real. La desventaja de hiperpolarizado NMR reside en la ventana de tiempo limitado disponible para la adquisición de señales, que es generalmente del orden de la constante de tiempo de relajación longitudinal de espín nuclear, T 1, o, en casos favorables, en el orden de la constante de tiempo de relajación asociado con el singlete de estado de los núcleos acoplados, T LLS. La captación celular de moléculas endógenas y las tasas metabólicas puede proporcionar información esencial sobre el desarrollo tumoral y la respuesta al fármaco. Nurosos estudios de RMN hiperpolarizados anteriores han demostrado la relevancia de piruvato como sustrato metabólico para monitorizar la actividad enzimática in vivo. Este trabajo proporciona una descripción detallada de la configuración experimental y métodos necesarios para el estudio de las reacciones enzimáticas, en particular, la tasa de conversión de piruvato a lactato en presencia de lactato deshidrogenasa (LDH), por RMN hiperpolarizado.

ganancias de señal de RMN utilizando DNP disolución El efecto DNP consiste en la transferencia de la alta polarización de espines de los electrones no apareados, típicamente de moléculas de radicales estables, a los núcleos de RMN-activos, bajo irradiación con microondas de la muestra. Los radicales libres más usadas son de TAM (OXO63) y TEMPOL. 4 procedimientos de polarización utilizando TEMPOL pueden ser optimizados por &quot;polarización cruzada &#39;. 25 ...

La mejora de la sensibilidad proporcionada por la polarización nuclear dinámica de disolución (DNP) permite seguir los procesos metabólicos en tiempo real mediante RMN y RMN. Se discuten las características y rendimientos de una configuración DNP de disolución dedicada diseñada para el estudio de reacciones enzimáticas.

Disolución dinámica de polarización nuclear Instrumentación para el tiempo real enzimática reacción de la tasa mediciones realizadas por RMN

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

El objetivo general de este experimento es seguir los procesos enzimáticos en tiempo real mediante resonancia magnética nuclear potenciada por polarización nuclear dinámica. La resonancia magnética en estado líquido mejorada por la polarización nuclear dinámica, DNP, puede ayudar a responder preguntas clave: cómo determinar, por ejemplo, las tasas de transformación enzimática de un par de moléculas en células o in vivo sin tener que modificar de ninguna manera a este par de moléculas. La instalación de nuestro equipo de DNP por disolución en nuestro laboratorio y la llegada aquí del Dr. Riccardo Balzan, doctorado en el Laboratorio de Arnaud Comment en Lausanne, representa un gran avance para nuestra investigación.DNP aumenta significativamente la sensibilidad de los experimentos que podemos realizar en nuestros espectrómetros de RMN de 500 megahercios. Este equipo de DNP fue el primero en instalarse en Francia y me gustaría mencionar que, para hacer funcional este equipo, todos los miembros de nuestro equipo de RMN participaron, y en particular deseo mencionar a Gildas Bertho, nuestro ingeniero de investigación, y a Fatiha Kateb, nuestra maestra de conferencias. La principal ventaj

dissolution-dynamic-nuclear-polarization-instrumentation-for-real

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Este video describe la técnica de espectroscopia de resonancia magnética nuclear para estudiar las interacciones proteína-proteína entre 15proteínas envoplakina mutantes y de tipo salvaje marcadas con N y la proteína vimentina no marcada. La interacción exitosa entre la envoplaquina de tipo salvaje y la vimentina conduce a un amplio ensanchamiento de la línea y a la desaparición de picos en los espectros de RMN, mientras que la ausencia de una interacción entre la envoplaquina mutada y la...

Resonancia magnética nuclear para estudiar las interacciones proteína-proteína a nivel atómico

Un maniquí dinámico multicompartimiento se utiliza para simular alguna biología de interés para estudios metabólicos utilizando agentes de resonancia magnética hiperpolarizados.

El uso de un de varios compartimentos dinámico sola enzima fantasma de Estudios de hiperpolarizados Agentes de Resonancia Magnética

Un método nuevo de resonancia paramagnética electrónica (EPR), rápidos de escaneo de EPR (RS-EPR), se demuestra para la imagen espacial espectral 2D que es superior a la técnica tradicional de onda continua (CW) y abre nuevos lugares para formación de imágenes in vivo. Los resultados se demostraron a 250 MHz, pero la técnica es aplicable a cualquier frecuencia.

El rápido escaneo de electrones resonancia paramagnética abre nuevas vías para Imaging fisiológicamente parámetros importantes<em&gt; En Vivo</em

La polarización nuclear dinámica con la posterior disolución de la muestra ha permitido estudios en tiempo real del metabolismo en sistemas biológicos. Se utilizó piruvato hiperpolarizado [1-13C] para estudiar la actividad de la lactato deshidrogenasa en una línea celular de carcinoma de próstata in vitro.

hiperpolarizado 13 C metabólico espectroscopía de resonancia magnética e Imagen

Describimos aquí un método para identificar múltiples fosforilaciones de una proteína intrínsecamente desordenada mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), utilizando la proteína Tau como caso de estudio. La Tau recombinante se enriquece isotópicamente y se modifica in vitro mediante una quinasa antes de la adquisición y el análisis de datos.

Nuclear espectroscopía de resonancia magnética para la identificación de múltiples fosforilaciones de proteínas intrínsecamente desordenadas

Se presenta un protocolo para preparar 13C,15marcado con N muestras de hongos y plantas para espectroscopia de RMN de estado sólida multidimensional y las investigaciones de la polarización nuclear dinámica (DNP).

Preparación de hongos y materiales vegetales para la elucidación estructural mediante RMN de estado sólido de polarización Nuclear dinámica

Presentamos un protocolo para medir la dependencia del campo magnético del tiempo de relajación de la celosía de espín de 13compuestos enriquecidos con C, hiperpolarizados mediante polarización nuclear dinámica, utilizando relaxometría rápida de ciclo de campo. Específicamente, lo hemos demostrado con [1-13C]pyruvate, pero el protocolo podría extenderse a otros sustratos hiperpolarizados.

Medición de la dependencia del campo magnético de relajación Spin-Lattice de hiperpolarizado [1-13C]pyruvate

Aquí, se proporciona una descripción detallada del protocolo implementado en el laboratorio para la adquisición y análisis de perfiles de dispersión de relajación de 15N por solución de espectroscopia de RMN.

15. N CPMG Dispersión De Relajación Para La Investigación De La Dinámica Conformacional De Proteínas En La Escala De Tiempo μs-ms

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) puede caracterizar la dinámica estructural de proteínas de una manera específica para cada residuo. Proporcionamos un protocolo práctico para registrar la relajación de RMN 15N R1 y R2 y los experimentos de efecto Overhauser heteronuclear (hetNOE) de {1H}-15N, sensible a la escala de tiempo de picosegundos a nanosegundos.

Experimentos de relajación de RMN 15N para la investigación de la dinámica estructural de proteínas de picosegundos a nanosegundos

Este protocolo integra un sistema de biorreactor hecho a medida con espectroscopia de RMN de ¹³C hiperpolarizada para medir el metabolismo del piruvato en tiempo real en células vivas, lo que mejora la reproducibilidad y la precisión cinética para estudios metabólicos y aplicaciones de detección de fármacos.

Detección metabólica en tiempo real en células vivas mediante RMN hiperpolarizada de 13C

Aprende a monitorizar procesos enzimáticos en tiempo real mediante disolución DNP y RMN de 500 MHz. Esta técnica permite cuantificar sustratos con resolución de segundos sin alterar las moléculas estudiadas.

Disolución dinámica de polarización nuclear Instrumentación para el tiempo real enzimática reacción de la tasa mediciones realizadas por RMN (Video) | JoVE Journal

Disolución dinámica de polarización nuclear Instrumentación para el tiempo real enzimática reacción de la tasa mediciones realizadas por RMN

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