Disolución dinámica de polarización nuclear Instrumentación para el tiempo real enzimática reacción de la tasa mediciones realizadas por RMN

El objetivo general de este experimento es seguir los procesos enzimáticos en tiempo real mediante resonancia magnética nuclear potenciada por polarización nuclear dinámica. La resonancia magnética en estado líquido mejorada por la polarización nuclear dinámica, DNP, puede ayudar a responder preguntas clave: cómo determinar, por ejemplo, las tasas de transformación enzimática de un par de moléculas en células o in vivo sin tener que modificar de ninguna manera a este par de moléculas. La instalación de nuestro equipo de DNP por disolución en nuestro laboratorio y la llegada aquí del Dr. Riccardo Balzan, doctorado en el Laboratorio de Arnaud Comment en Lausanne, representa un gran avance para nuestra investigación.

DNP aumenta significativamente la sensibilidad de los experimentos que podemos realizar en nuestros espectrómetros de RMN de 500 megahercios. Este equipo de DNP fue el primero en instalarse en Francia y me gustaría mencionar que, para hacer funcional este equipo, todos los miembros de nuestro equipo de RMN participaron, y en particular deseo mencionar a Gildas Bertho, nuestro ingeniero de investigación, y a Fatiha Kateb, nuestra maestra de conferencias. La principal ventaja de esta técnica es que permite la cuantificación directa y en tiempo real del sustrato y sus derivados endógenos con una resolución temporal de segundos.

Para la solución polarizante, prepare dos mililitros de una solución de piruvato de sodio marcado con carbono 13, 1,12 molar, dopada con 33 milimolares del radical TEMPO en una proporción de volumen de dos a uno de agua deuterada a etanol deuterado para observaciones de carbono 13. Reduzca la temperatura del criostato de polarización nuclear dinámica, o DNP, mediante el procedimiento de enfriamiento haciendo clic en el botón de enfriamiento en la interfaz de software del criostato. Recoja helio líquido en el criostato DNP mediante el procedimiento de llenado.

Haga clic en el botón de llenado en la interfaz de software del criostato. Luego coloque 300 microlitros de la solución polarizante optimizada en el recipiente de muestra proporcionado con el polarizador DNP. Congele el recipiente de muestra con la muestra en su interior sumergiéndolo suavemente en un baño de nitrógeno líquido.

Elimine el nitrógeno líquido que pueda estar presente en el recipiente de la muestra después del procedimiento de congelación extrayendo el recipiente de la muestra del baño de nitrógeno líquido y girándolo boca abajo. A continuación, inserte la muestra en el criostato introduciendo primero el recipiente de la muestra en el portaobjetos. Luego coloque el portaobjetos en la inserción principal del criostato antes de insertar la guía de ondas del microondas en el portaobjetos.

Reduzca la temperatura del criostato iniciando el procedimiento de enfriamiento a un kelvin. Haga clic en el botón de enfriamiento a un kelvin en la interfaz de software del criostato. Encienda la fuente de microondas e irradie la muestra haciendo clic en el botón de microondas encendidas en la interfaz de software del criostato.

Desconecte el cable coaxial del canal de detección de la consola de RMN del bobinado del espectrómetro girando el conector en sentido antihorario 90 grados y tirando de él. Conecte el cable coaxial del canal de detección al conector coaxial del bobinado de RMN del criostato. Luego inserte el conector macho del cable de la consola de RMN en el conector hembra del bobinado de RMN del criostato, prestando atención al pasador de orientación.

Presione firmemente y gire el conector en sentido horario 90 grados. Mida la señal térmica de RMN en estado sólido en el sitio del criostato utilizando una secuencia simple de pulso-adquisición con pulsos de ángulo de giro bajo sin calibrar, repetidos a intervalos de t igual a cinco minutos. Después de configurar la medición, escriba zg en la línea de comandos del software y presione enter en el teclado.

Después de iniciar el procedimiento de polarización, mida la señal de RMN mejorada por DNP en estado sólido con el mismo procedimiento y condiciones utilizados para la medición de la señal térmica. Desconecte el cable coaxial del canal de detección de la consola de RMN del bobinado de RMN del criostato girando el conector en sentido antihorario 90 grados y tirando de él. Luego, conecte el cable coaxial del canal de detección al conector coaxial del bobinado del espectrómetro.

Inserte el conector macho del cable de la consola de RMN en el conector hembra de la bobina del espectrómetro, prestando atención al pasador de orientación. Empuje firmemente y gire el conector 90 grados en sentido horario. Prepare recientemente una solución de LDH de músculo de conejo a una unidad por mililitro en tampón de reacción con 20 microgramos por mililitro de albúmina sérica bovina.

A continuación, mezcle 478 microlitros de tampón de reacción, 2 microlitros de solución de LDH y 20 microlitros de agua deuterada para permitir la estabilización del campo del espectrómetro, o bloqueo. Luego, coloque el volumen de solución de 500 microlitros en un tubo de RMN de 5 milímetros. Conecte el tubo de transferencia a un dispositivo de inyección automatizado y hecho a medida que separa la solución hiperpolarizada del gas helio utilizado para la transferencia.

El dispositivo entrega automáticamente 500 microlitros de solución hiperpolarizada en el tubo de muestra. Antes de la disolución, coloque el tubo de RMN de cinco milímetros que contiene 500 microlitros de muestra en el isocentro del espectrómetro de RMN de 11,74 tesla. Introduzca 5 mililitros de agua deuterada en la caldera del inserto de disolución.

Presurice y caliente el agua deuterada mediante el alambre resistivo hasta alcanzar una temperatura aproximada de 180 a 200 grados Celsius, haciendo clic en el botón de preparación del calentador en la interfaz de software del criostato. Haga clic en el botón de Operaciones SS en la interfaz de software del criostato. Luego, retire la guía de microondas del inserto de disolución.

Deslice el inserto de disolución hacia abajo dentro del portamuestras. El inserto de disolución debe llegar hasta el fondo del portamuestras y debe empujarse firmemente para establecer una conexión hermética con el recipiente de muestra, evitando así que el agua deuterada se filtre al criostato. Presione el disparador de hardware para iniciar la secuencia de disolución, una secuencia predeterminada y temporizada de operaciones de las válvulas neumáticas.

Inmediatamente después de la disolución, el dispositivo de inyección mezcla 500 microlitros de solución hiperpolarizada con la muestra colocada en el espectrómetro de RMN. Después de la disolución, mida la señal hiperpolarizada de RMN de la muestra en el espectrómetro mediante una serie de secuencias de pulso-adquisición con ángulo de giro de 10 grados, separadas por 1,5 segundos, para seguir la evolución de la magnetización del sustrato y del producto. Después de configurar la medición, escriba zg en la línea de comandos del software y presione enter.

Una vez que la magnetización esté completamente relajada, mida la señal térmica de RMN mediante una serie de secuencias de pulso-adquisición con ángulo de giro de 90 grados separadas por aproximadamente tres minutos, lo que corresponde a unos 3T1. Después de configurar la medición, escriba zg en la línea de comandos del software y presione la tecla Intro. Aquí, el curso temporal de los espectros obtenidos mediante pulsos repetidos con ángulo de giro de 10 grados muestra la sensibilidad y la resolución temporal de la técnica.

Tras la identificación de los picos del sustrato de piruvato y del producto lactato, se realiza la cuantificación mediante la integración de las señales de los metabolitos. La actividad enzimática se determina a partir del curso temporal de la señal del producto, ajustándolo a un modelo lineal. Para validar la medición, se evalúa la misma cantidad mediante la velocidad inicial de la reacción, a partir de la relación entre las señales del producto y del sustrato.

Una vez dominado, se puede realizar una medición completa de la actividad enzimática en aproximadamente dos horas si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería comprender cómo producir un sustrato altamente polarizado para RMN, inyectarlo en una solución que contiene una enzima y seguir la actividad enzimática mediante RMN potenciada por DNP. Al intentar este procedimiento, es importante preparar cuidadosamente la solución enzimática con enzima y cosustratos frescos, y evitar cualquier burbuja de aire en el tubo de muestra.

Con el desarrollo de la resonancia magnética mejorada por DNP en estado líquido, los investigadores ahora pueden explorar la captación de sustratos y su transformación enzimática dentro de diversos tipos de células mediante la medición de la velocidad de formación de productos. No olvide que trabajar con equipos criogénicos y campos magnéticos intensos puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar precauciones, como usar protecciones personales contra criógenos y verificar la ausencia de objetos magnéticos, al realizar estas mediciones.

A diferencia de la RMN clásica, la RMN basada en DNP por disolución está limitada a una ventana temporal experimental de minutos como máximo, dependiendo del sustrato y del estado actual de vida. Esto dificulta avanzar más allá de la espectroscopía en una dimensión. La RMN por DNP por disolución necesita desarrollo para alcanzar el nivel de versatilidad de la RMN multidimensional clásica.