Disolución dinámica de polarización nuclear Instrumentación para el tiempo real enzimática reacción de la tasa mediciones realizadas por RMN

El objetivo general de este experimento es seguir los procesos enzimáticos en tiempo real mediante polarización nuclear dinámica y resonancia magnética nuclear mejorada. La resonancia magnética en estado líquido mejorada por la polarización nuclear dinámica, DNP, puede ayudar a responder preguntas clave: cómo determinar, por ejemplo, las tasas de transformación enzimática de un par de moléculas en célula o in vivo sin tener que alterar este par de moléculas de ninguna manera. La instalación de nuestro equipo de disolución DNP en nuestro laboratorio y la llegada aquí del Dr. Riccardo Balzan, PhD en el Laboratorio Arnaud Comment en Lausana, es un gran paso adelante para nuestra investigación.

El DNP aumenta significativamente la sensibilidad de los experimentos que podemos realizar en nuestros espectrómetros de RMN de 500 megahercios. Este equipo DNP fue el primero que se instaló en Francia y me gustaría mencionar que, en la puesta en funcionamiento de este equipo, participaron todos los miembros de nuestro equipo de RMN y me gustaría mencionar en particular a Gildas Bertho, nuestro ingeniero de investigación, y a Fatiha Kateb, nuestra maître de conferencias. La principal ventaja de esta técnica es que permite la cuantificación directa y en tiempo real del sustrato y sus derivados endógenos con una resolución temporal de segundos.

Para la solución polarizante, prepare dos mililitros de una solución de piruvato de sodio marcada con carbono 13 de 1,12 molares dopada con 33 milimolares de radical TEMPO en un volumen de dos a uno de agua deuterada a etanol deuterado para observaciones de carbono 13. Reduzca la temperatura del criostato de polarización nuclear dinámica, o DNP, a través del procedimiento de enfriamiento haciendo clic en el botón de enfriamiento en la interfaz del software del criostato. Recoja el helio líquido en el criostato DNP a través del procedimiento de llenado.

Haga clic en el botón de llenado en la interfaz del software del criostato. A continuación, coloque 300 microlitros de la solución polarizadora optimizada en el recipiente de muestra provisto con el polarizador DNP. Congele el recipiente de muestra con la muestra en su interior sumergiéndolo suavemente en un baño de nitrógeno líquido.

Elimine el nitrógeno líquido que pueda estar presente en el recipiente de muestra después del procedimiento de congelación extrayendo el recipiente de muestra del baño de nitrógeno líquido y girándolo boca abajo. A continuación, inserte la muestra en el criostato insertando primero el recipiente de la muestra en el portamuestras. A continuación, coloque el portamuestras en el inserto principal del criostato antes de insertar la guía de ondas del microondas en el portamuestras.

Baje la temperatura del criostato iniciando el procedimiento de enfriamiento de un Kelvin. Haga clic en el botón de enfriamiento de un Kelvin en la interfaz del software del criostato. Encienda la fuente de microondas e irradie la muestra haciendo clic en el botón de microondas en la interfaz del software de criostato.

Desconecte el cable coaxial del canal de detección de la consola de RMN de la bobina del espectrómetro girando el conector en sentido contrario a las agujas del reloj 90 grados y tirando de él. Conecte el cable coaxial del canal de detección al conector coaxial de la bobina de RMN del criostato. A continuación, inserte el conector macho del cable de la consola de RMN en el conector hembra de la bobina de RMN del criostato, prestando atención al pin de orientación.

Empuje firmemente y gire el conector en el sentido de las agujas del reloj 90 grados. Mida la señal térmica de RMN en estado sólido en el sitio del criostato utilizando una secuencia simple de adquisición de pulsos con pulsos no calibrados de ángulo de giro bajo repetidos en un intervalo de t igual a cinco minutos. Después de configurar la medición, escriba zg en la línea de comandos del software y presione enter en el teclado.

Después de iniciar el procedimiento de polarización, mida la señal de RMN mejorada con DNP en estado sólido con el mismo procedimiento y condiciones utilizados para la medición de la señal térmica. Desconecte el cable coaxial del canal de detección de la consola de RMN de la bobina de RMN del criostato girando el conector en sentido contrario a las agujas del reloj 90 grados y tirando de él. A continuación, conecte el cable coaxial del canal de detección al conector coaxial de la bobina del espectrómetro.

Inserte el conector macho del cable de la consola de RMN en el conector hembra de la bobina del espectrómetro, prestando atención al pin de orientación. Empuje firmemente y gire el conector en el sentido de las agujas del reloj 90 grados. Preparar una solución de LDH de músculo de conejo a una unidad por mililitro en tampón de reacción con 20 microgramos por mililitro de albúmina sérica bovina.

A continuación, mezcle 478 microlitros de tampón de reacción, 2 microlitros de solución de LDH y 20 microlitros de agua deuterada para permitir la estabilización o el bloqueo del campo del espectrómetro. A continuación, coloque el volumen de solución de 500 microlitros en un tubo de RMN de 5 milímetros. Conecte el tubo de transferencia a un dispositivo de inyección automatizado y hecho a medida que separa la solución hiperpolarizada del gas helio utilizado para la transferencia.

El dispositivo suministra automáticamente 500 microlitros de solución hiperpolarizada en el tubo de muestra. Antes de la disolución, coloque el tubo de RMN de cinco milímetros que contiene 500 microlitros de muestra en el isocentro del espectrómetro de RMN de 11,74 teslas. Inserte 5 mililitros de agua deuterada en la caldera de inserción de disolución.

Presurice y caliente el agua deuterada por medio del cable resistivo hasta alcanzar una temperatura de aproximadamente 180 a 200 grados Celsius haciendo clic en el botón preparar calentador en la interfaz del software de criostato. Haga clic en el botón SS Operations en la interfaz del software del criostato. A continuación, retire la guía de microondas del inserto de disolución.

Deslice el inserto de disolución hacia abajo en el portamuestras. El inserto de disolución debe llegar a la parte inferior del soporte de muestras y debe empujarse firmemente para hacer una conexión hermética con el recipiente de muestras para evitar fugas de agua deuterada en el criostato. Presione el gatillo de hardware para comenzar la secuencia de disolución, una secuencia cronometrada predeterminada de operaciones de válvulas neumáticas.

Justo después de la disolución, el dispositivo de inyección mezcla 500 microlitros de solución hiperpolarizada con la muestra colocada en el espectrómetro de RMN. Después de la disolución, mida la señal hiperpolarizada de RMN de la muestra en el espectrómetro mediante una serie de secuencias de adquisición de pulsos de ángulo invertido de 10 grados espaciadas por 1,5 segundos para seguir la progresión de la magnetización del sustrato y el producto. Después de configurar la medición, escriba zg en la línea de comandos del software y presione enter.

Una vez que la magnetización esté completamente relajada, mida la señal térmica de RMN mediante una serie de secuencias de adquisición de pulsos con ángulo de giro de 90 grados espaciadas por unos tres minutos, lo que corresponde a aproximadamente 3T1. Después de configurar la medición, escriba zg en la línea de comandos del software y presione la tecla enter. Aquí, el curso temporal de los espectros obtenidos a partir de pulsos repetidos de ángulo de giro de 10 grados muestra la sensibilidad y la resolución temporal de la técnica.

Tras la identificación del pico del sustrato de piruvato y el producto de lactato, la cuantificación se realiza mediante la integración de señales de los metabolitos. La actividad enzimática se determina a partir del curso del tiempo de la señal del producto mediante el ajuste con un modelo lineal. Para validar la medición, la misma cantidad se evalúa por la velocidad de reacción inicial, a partir de la relación de señales de producto y sustrato.

Una vez dominado, se puede realizar una medición completa de la actividad enzimática en aproximadamente dos horas si se realiza correctamente. Después de ver este video, debe comprender cómo producir un sustrato altamente polarizado para RMN, inyectarlo en una solución que contenga una enzima y seguir la actividad enzimática utilizando la RMN mejorada con DNP. Al intentar este procedimiento, es importante preparar cuidadosamente la solución enzimática con enzimas frescas y cosustratos, y evitar cualquier burbuja de aire en el tubo de muestra.

Con el desarrollo de la resonancia magnética mejorada DNP en estado líquido, los investigadores ahora pueden explorar la absorción de sustrato y su transformación enzimática dentro de varios tipos de células midiendo la tasa de formación de producto. No olvide que trabajar con equipos criogénicos y campos magnéticos altos puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar precauciones, como el uso de protecciones personales contra los criógenos y la verificación de la ausencia de objetos magnéticos al realizar estas mediciones.

A diferencia de la RMN clásica, la RMN basada en DNP de disolución se limita a una ventana de tiempo experimental de minutos como máximo, dependiendo del sustrato y del estado actual de la vida. Esto se interpone en el camino de ir más allá de una espectroscopia D. La RMN DNP de disolución necesita desarrollo para llevarla al nivel de versatilidad de la RMN multidimensional clásica.