La generación de CRISPR / Cas9 mediada monoallelic deleciones para estudiar la función del reforzador en las células madre embrionarias de ratón
2 de abril de 2016
La validación experimental de la actividad potenciadora se aborda mejor mediante el análisis de pérdida de función. Aquí se presenta un protocolo eficiente que utiliza la deleción mediada por CRISPR/Cas9 para estudiar la regulación específica de alelos de la transcripción génica en células ES F1 que contienen un genoma híbrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).
El objetivo general de este procedimiento es utilizar la eliminación mediada por CRISPR/Cas9 específica de alelo para estudiar la regulación de la transcripción génica en células madre embrionarias de ratón. La principal ventaja de esta técnica, que utiliza un genoma híbrido para generar y analizar deleciones monoalélicas, es que elimina la necesidad de analizar deleciones aumentadas monoalélicas que podrían no ser viables.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genómica funcional. Por ejemplo, qué gen regula un potenciador específico y en qué medida ese gen depende de un potenciador determinado para su actividad. Aunque este método puede proporcionar información sobre la pluripotencia de las células madre, también puede aplicarse a otros sistemas.
Por ejemplo, puede ayudarnos a comprender cómo las células madre cambian su destino para convertirse en neuronas, células sanguíneas o músculo. Después de diseñar, construir y confirmar la secuencia del ARN guía, o ARN-g, que se utilizará, prepárese para transfectar los plásmidos libres de endotoxinas en células ES. Utilizando una centrífuga, separe por centrifugación un tiempo diez a la sexta células madre embrionarias F1 generadas mediante el cruce de Mus musculus 129 con Mus castaneus en un tubo de 1,5 mililitros a 300 veces g durante cinco minutos.
Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y agregue 100 microlitros del tampón de resuspensión proporcionado por el fabricante del kit. Para la eliminación de la región de ADN diana, agregue cinco microgramos de cada uno de los plásmidos P Cas9 GFP 5-primo y 3-primo gRNA. Utilizando una pipeta, mezcle suavemente.
Evite introducir burbujas. A continuación, use la punta electrónica de la micropipeta para aspirar 100 microlitros de la mezcla de electrotransferencia, teniendo cuidado de evitar introducir aire en la punta. Luego, conecte la pipeta al dispositivo de transfección.
Seleccione el protocolo adecuado y presione inicio. Mientras la electroporación está en curso, observe la punta. Con la configuración correcta, deben emerger pequeñas burbujas del electrodo del tubo.
Una chispa indica la presencia de una burbuja de aire e interferirá con la transfección. Si esto ocurre, debe repetirse la electroforesis con un nuevo lote de células. Tras la electroforesis, expulse las células transfectadas en una placa recubierta con gelatina de diez centímetros que contenga diez mililitros de medio para células ES.
Incube las células transfectadas a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono. Después de 48 horas, utilice un citómetro de flujo para clasificar y aislar las células ES positivas para GFP del grupo nueve. Luego, siembre de 1 a 1,5 veces 10 a la cuarta células positivas para GFP en un plato de 10 centímetros, recubierto con gelatina y que contenga 10 mililitros de medio para células ES.
El siembra a esta baja densidad facilitará la selección de colonias individuales de células ES. Cuatro a cinco días después, utilice un microscopio para identificar colonias individuales de células ES con forma esférica. Mediante una pipeta, transfiera cada colonia a un pocillo de una placa de 96 pocillos previamente tratada con gelatina y que contenga 30 microlitros de tripsom.
Una vez que se hayan recolectado todas las colonias y disociado en el medio, cultive las células a 37 grados Celsius en la incubadora de dióxido de carbono hasta que la mayoría de los pocillos tengan más del 70 % de confluencia. Esto generalmente tarda unos dos días. Cuando las células estén listas para ser divididas, retire el medio y agregue 30 microlitros de tripsom.
Incube las células durante cinco minutos. Luego, agregue 180 microlitros de medio para células ES a cada pocillo para neutralizar la tripsina. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión de células individuales.
De cada pocillo, transfiera 70 microlitros a cada una de tres placas de 96 pocillos recubiertas con gelatina que contengan 130 microlitros de medio para células ES en cada pocillo. Incube a 37 grados Celsius. Cuando las placas alcancen una confluencia del 70 al 85 %, utilícelas para realizar la genotipificación y el análisis de expresión de cada clon, tal como se describe en las secciones siguientes.
Congele las muestras celulares según se describe en el documento adjunto. Aquí, se diseñarán cuatro conjuntos de cebadores para analizar las cepas en busca de la eliminación deseada. Estos incluyen: cebadores internos, cebadores externos y cebadores que flanquean el ARN-g para ambos sitios diana del ARN-g en la región 5 prima y 3 prima.
Comience visitando el sitio web que se muestra aquí para obtener la pista de polimorfismo de nucleótido único o snip correspondiente a los genotipos 129 y Cas. Esto redirige a la página web de CRISPR del Laboratorio Mitchell. Allí, haga clic en el enlace proporcionado.
El sitio redirigirá al navegador de genoma UCSC que contiene la pista que muestra los SNPs entre los genomas 129 y Cas en el ensamblaje del genoma de ratón MM-9. A continuación, ingrese las coordenadas de la región que se eliminará y haga clic en «ir». Acérquese a una región de aproximadamente 500 pares de bases en el centro de la eliminación deseada que contenga más de tres SNPs.
El diseño de cebadores específicos para alelos puede ser complicado si los SNPs son escasos. Si no es posible diseñar cebadores absolutamente específicos para alelos, pueden utilizarse cebadores moderadamente específicos. Solo recuerde comparar los valores de CT entre los clones eliminados y no eliminados durante el análisis de los resultados de qPCR.
Ahora, haga clic en Ver en el panel superior. En el menú desplegable, seleccione ADN. Aparecerá la página Obtener ADN en la ventana.
En las opciones de formato de secuencia, seleccione todo en mayúsculas y luego haga clic en "Obtener ADN" para mostrar la secuencia objetivo completamente en mayúsculas. Copie esta secuencia y péguela en un documento de Word. A continuación, compare la secuencia con la pista de corte 129 cast y resalte las posiciones de corte, marcando los cortes 129 con letras minúsculas.
Cuando haya terminado con la secuencia 129, cópiela para crear dos secuencias en formato fast day. Una para 129 y otra para Cas. En la secuencia de Cas, sustituya la base correcta en cada posición de corte, marcando el corte con una letra minúscula.
A continuación, etiquete la secuencia con su genoma correspondiente, 129 o Cas. Luego, en el navegador, escriba la dirección de Primer3Plus. En el área correspondiente, pegue la secuencia 129 con el fragmento sustituido.
Utilice la configuración predeterminada para diseñar los cebadores. Para diseñar los cebadores internos específicos de alelo, haga clic en el menú desplegable a la derecha de "Task" y seleccione "Primer List", luego haga clic en "Pick Primers". Se abrirá una nueva página que mostrará una lista de cebadores directos e inversos.
Marque la casilla de selección para elegir un cebador directo o inverso que tenga un snip marcado con una letra minúscula ya sea en el extremo 3-primo o dentro de cuatro bases del extremo 3-primo. Tenga en cuenta que los cebadores que tienen un snip en el extremo 3-primo muestran una especificidad alélica aumentada durante la qPCR. Haga clic en Enviar al Administrador de Primer3 en la parte inferior de la pantalla.
Se abrirá una nueva página que mostrará el cebador seleccionado. Para seleccionar el segundo cebador, regrese a la página de la lista de cebadores y haga clic en el botón de retroceso para volver a la página principal. En el menú desplegable de tareas, seleccione Detección.
La página principal se actualizará y aparecerá una caja para la secuencia del cebador izquierdo y otra para la derecha en la parte inferior. Pegue la secuencia del primer cebador en la caja correspondiente. A continuación, vaya a la pestaña Configuración general ubicada junto a la pestaña Principal y cambie la configuración del rango de tamaño del producto a 80-200 pares de bases.
Haga clic en "Seleccionar cebadores". Se abrirá una página que mostrará cinco pares de cebadores posibles para la primera secuencia de cebador. Elija un conjunto de cebadores de la lista de pares de cebadores marcando las casillas a la izquierda de los cebadores y haga clic en "Enviar al administrador de Primer3" en la parte inferior de la pantalla. Estos serán los cebadores específicos del alelo interno 129.
Repita estos pasos para diseñar cebadores para el alelo cast. Luego, aplique esta técnica al diseño de cebadores externos específicos de alelo y cebadores no específicos de alelo. Finalmente, pruebe la especificidad de los cebadores respecto al alelo mediante qPCR, como se describe en el documento adjunto.
Extraiga el ADN genómico de la placa de 96 pocillos preparada anteriormente. Centrifugue brevemente la placa para hacer descender cualquier condensación al fondo del pocillo. Este ADN servirá como plantilla para la detección de deleciones.
A continuación, en una placa de 384 pocillos, realice la qPCR por duplicado para cada clon. Utilice una PCR de dos pasos seguida de un análisis de curva de disociación con detección. Tras el análisis, revise primero cada alelo en busca de amplificación con los cebadores específicos del alelo interno.
La ausencia de amplificación de un alelo o diferencias en los valores de CT de más de cinco ciclos entre alelos sugiere que estas colonias portan una deleción heterocigota. La falta de amplificación de ambos alelos sugiere que portan una deleción homocigota. A continuación, verifique la amplificación de cada alelo utilizando los cebadores específicos para alelos externos.
Si la deleción objetivo es mayor de un KB, la amplificación con cebadores externos solo ocurrirá si está presente una deleción. Un valor de CT de 22 a 28 confirma la deleción. Para deleciones objetivo menores de un KB, confirme el tamaño del amplicón mediante electroforesis.
Se analizó una placa de 96 pocillos con clones de deleción mediante qPCR utilizando cebadores internos específicos para cada alelo. Las barras grises representan la amplificación con cebadores específicos para Cas y las barras negras representan la amplificación con cebadores específicos para 129. Un valor bajo de CT o ausencia de amplificación con los cebadores internos indica la deleción del objetivo.
Los clones con una deleción en uno o ambos alelos se analizan luego con los cebadores externos. Con los cebadores externos, la amplificación confirma la deleción. Los clones con deleción monoalélica se analizan utilizando cebadores que flanquean las regiones diana del ARN-g para confirmar la ausencia de inserciones o deleciones, denominadas indels, en el alelo no eliminado.
Solo se utilizan clones monoalélicos sin indels grandes en los sitios diana del alelo no eliminado en el análisis subsiguiente de expresión. Aquí se muestran resultados representativos de clones eliminados de 129 o Cas SCR. El SCR es un potenciador específico de Sox2 recientemente descrito en células madre embrionarias.
Las barras rojas representan la expresión del alelo Sox2 Cas, y las barras azules representan la amplificación del alelo Sox2 129. Como puede observarse en esta figura, la eliminación del SCR en el alelo 129 o Cas redujo la expresión de Sox2 en CIS. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar una eliminación grande utilizando la tecnología CRISPR y cómo usar cebadores específicos de alelo para genotipar sus clones eliminados.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Resumen
Este artículo presenta un protocolo para utilizar la eliminación mediada por CRISPR/Cas9 con el fin de estudiar la regulación alélica específica de la transcripción génica en células madre embrionarias de ratón. La técnica aprovecha un genoma híbrido para facilitar el análisis de deleciones monoalélicas, proporcionando información sobre la regulación génica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Genómica funcional
- Regulación de la transcripción génica
- Tecnología CRISPR/Cas9
Antecedentes
- Comprender la actividad de los potenciadores es fundamental para la regulación génica.
- El análisis de pérdida de función es un enfoque clave en este campo.
- Las células madre embrionarias de ratón proporcionan un modelo para estudiar la regulación génica.
- Los genomas híbridos pueden ayudar a analizar interacciones génicas específicas.
Objetivo del estudio
- Investigar el papel de potenciadores específicos en la regulación génica.
- Determinar la dependencia de los genes respecto a potenciadores particulares.
- Mejorar la comprensión de la pluripotencia de las células madre y sus aplicaciones.
Métodos Utilizados
- Técnica de eliminación mediada por CRISPR/Cas9.
- Uso de células ES F1 con un genoma híbrido (Mus musculus 129 x Mus castaneus).
- Análisis de eliminaciones monoalélicas para estudiar la transcripción génica.
- Validación experimental de la actividad de potenciadores mediante análisis de pérdida de función.
Resultados principales
- Implementación exitosa de deleciones alélicas específicas en células madre.
- Conocimientos sobre la regulación de la transcripción génica por potenciadores específicos.
- Demuestra la aplicabilidad del método a diversos sistemas biológicos.
- Contribución al entendimiento de la genómica funcional.
Conclusiones
- El método CRISPR/Cas9 es eficaz para estudiar la actividad de los potenciadores.
- Este enfoque puede aclarar la relación entre los potenciadores y la expresión génica.
- Los hallazgos podrían tener implicaciones más amplias para la investigación con células madre y la genómica funcional.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite una interrogación precisa de la función de los potenciadores mediante la eliminación alélica específica de CRISPR/Cas9 en células madre embrionarias de ratón híbridas, abordando un desafío clave en la validación de objetivos: vincular elementos reguladores distales con la expresión génica. Aprovechando los polimorfismos naturales de nucleótido único (SNP) entre los alelos de Mus musculus 129 y Mus castaneus, este enfoque facilita la reducción mecanicista de riesgos en reguladores transcripcionales sin la letalidad homocigótica que podría confundir los resultados, proporcionando una confianza predictiva en las relaciones entre potenciadores y genes desde las primeras etapas del descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la evaluación de la necesidad de potenciadores para la expresión génica en un modelo de células madre fisiológicamente relevante.
- Valor científico: Facilita la reducción de riesgos biológicos mediante análisis de pérdida de función monoalélica que evita confusiones fenotípicas derivadas de la eliminación completa de elementos reguladores.
- Valor científico: Aumenta la confianza en el blanco al proporcionar evidencia directa de regulación cis mediante cribado por eliminación alélica específica utilizando cebadores que discriminan SNPs.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor operativo: Facilita la estandarización del ensayo mediante genotipificación por qPCR con cebadores específicos de alelo internos y externos para distinguir clones heterocigotos, homocigotos y de tipo silvestre.
- Valor operativo: Permite un flujo de trabajo de cribado escalable mediante la selección de colonias en placas de 96 pocillos y qPCR en placas de 384 pocillos para la validación de eliminaciones de alto rendimiento.
- Valor operativo: Apoya la reproducibilidad del ensayo al requerir la confirmación de la ausencia de inserciones o deleciones en el alelo no eliminado mediante cebadores que flanquean el ARN-g antes del análisis de expresión.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor traslacional: Proporciona información relevante sobre el sistema de la enfermedad mediante el estudio de la regulación mediada por potenciadores de factores de pluripotencia como Sox2 en células madre embrionarias de ratón.
- Valor traslacional: Apoya la confianza predictiva en las decisiones del destino de las células madre al vincular la eliminación de potenciadores con cambios en la expresión génica relevantes para las vías de diferenciación.
- Valor traslacional: Permite la reducción mecanicista de riesgos en objetivos potenciadores mediante análisis cuantitativo de expresión (qPCR) que muestra una reducción alélica específica en la transcripción del gen objetivo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la transición desde la biología de descubrimiento hasta la identificación de candidatos al proporcionar una validación funcional de elementos reguladores no codificantes antes de su intervención terapéutica, generando resultados que informan directamente las decisiones de priorización de objetivos y reducción de riesgos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre las relaciones entre potenciadores y genes mediante la eliminación alélica específica y el análisis de expresión en un modelo genéticamente manejable.
- Selección: Ofrece preparación para ensayos mediante un protocolo estandarizado de qPCR que utiliza cebadores específicos para cada alelo, cuantificando la eficiencia y especificidad de la eliminación en diferentes clones.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes (valores CT, curvas de disociación) que permiten comparar la expresión alélica y la homocigosidad/heterocigosidad de la eliminación.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al estudiar la función de potenciadores en un modelo de células madre relevante para la diferenciación y la modelización de enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para la validación de potenciadores en distintas regiones genómicas, empleando el mismo diseño de cebadores basado en SNP y el mismo protocolo de CRISPR.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la función del potenciador mediante evidencia directa de pérdida de función, sin mecanismos compensatorios derivados de la eliminación homocigota.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad mediante el diseño de cebadores alélo-específicos guiado por SNP y protocolos de cribado por qPCR.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción del proyecto al aclarar la dependencia del potenciador y reducir la ambigüedad mecanicista en la validación del objetivo.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de objetivos transcripcionales basada en relaciones gen-potenciador validadas en un contexto celular relevante para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el diseño de CRISPR/Cas9, la ingeniería de cebadores alélicos específicos y el análisis de PCR cuantitativa para la discriminación alélica.
- Depende del acceso a células madre embrionarias híbridas F1 con densidad suficiente de SNP (cada ~125 pb) para un direccionamiento alélico confiable.
- Necesita estandarización entre equipos en los flujos de trabajo de diseño de cebadores mediante el navegador del genoma UCSC y Primer3Plus para garantizar la especificidad alélica.
- Incluye consideraciones de adaptación para modelos no híbridos en los que la densidad de SNP puede ser insuficiente para lograr resolución alélica específica.
- Comprende limitaciones prácticas, como la necesidad de confirmar la ausencia de indels en el alelo no eliminado antes de atribuir cambios en la expresión a la pérdida del potenciador.
