Name: La generación de CRISPR / Cas9 mediada monoallelic deleciones para estudiar la función del reforzador en las células madre embrionarias de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprende a generar deleciones monoalélicas con CRISPR/Cas9 en células madre embrionarias de ratón para estudiar la regulación de genes por reforzadores. Este método permite analizar la función específica de alelos en genómica funcional.

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Nos gustaría agradecer a todos los miembros del laboratorio Mitchell por sus útiles discusiones. Este trabajo contó con el apoyo de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud, la Fundación Canadiense para la Innovación y el Ministerio de Investigación e Innovación de Ontario (subvenciones operativas y de infraestructura de JAM).

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<li>Melnikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+dissection+and+optimization+of+inducible+enhancers+in+human+cells+using+a+massively+parallel+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 271-277 (2012).</li>
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<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+off-target+effects+of+CRISPR%2FCas-derived+RNA-guided+endonucleases+and+nickases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases.</a> Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).</li>
<li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28 (24), 2699-2711 (2014).</li>
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<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
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Los autores han leído las políticas de Júpiter sobre el conflicto de intereses y no tienen conflictos a revelar.

CRISPR / Cas9 tecnología de edición genoma mediada proporciona un método sencillo, rápido y barato para la modificación del genoma. El método detallado aquí para generar y analizar eliminación potenciador monoallelic para la caracterización funcional potenciador se aprovecha de SNPs en células de ratón F1. Las ventajas de este tipo de enfoque son: 1) deleciones potenciador monoallelic no producen efectos de confusión que se producen cuando un promotor de crítico se elimina de ambos alelos, es decir, una gran re...

Elementos reguladores de la transcripción son críticos para la puesta a punto espacio-temporal de la expresión génica durante el desarrollo 1 y la modificación de estos elementos puede dar lugar a la enfermedad debido a la expresión aberrante de genes 2. Muchas regiones asociadas a la enfermedad identificados por el genoma estudios de asociación de todo se encuentran en las regiones no codificantes y tienen características de potenciadores de la transcripción 3-4. La identificación de los potenciadores y emparejarlos con los genes que regulan se complica ya que a menudo se encuentran varias kilobases lejos de los genes que regulan y pueden ser activados de una manera específica de tejido 5-6. Predicciones Enhancer se basan comúnmente en marcas de modificación de las histonas, complejos de cohesinas-mediador y la unión de células de transcripción de tipo específico factores de 7-10. Validación de potenciadores predichos a menudo se realiza a través de un ensayo basado en vector en el que el potenciador activa la expresión de un gen indicador 11-12. Estos datos proporcionan valuable información sobre el potencial regulador de las secuencias potenciadoras putativos, pero no revelan su función en su contexto genómico endógeno o identificar los genes que regulan. edición genoma sirve como una poderosa herramienta para estudiar la función de los elementos reguladores de la transcripción en su contexto endógena mediante análisis de la pérdida de función. Los avances recientes en la edición del genoma, es decir, el sistema de edición de genoma / Cas9 CRISPR, facilitar la investigación de la función del genoma. El sistema / Cas9 CRISPR es fácil de usar y adaptable para muchos sistemas biológicos. La proteína Cas9 está dirigida a un sitio específico en el genoma por un ARN de guía (gRNA) 13. El complejo SpCas9 / gRNA escanea el genoma de su secuencia genómica diana que debe ser de 5 &#39;a una secuencia protospacer motivo adyacente (PAM), NGG 14-15. el apareamiento de bases de la gRNA a su diana, un (nt) secuencia de 20 nucleótidos complementaria a la gRNA, activa la actividad nucleasa SpCas9 que resulta en una doubldescanso e hebra (DSB) 3 pb aguas arriba de la secuencia de PAM. La especificidad se logra a través de apareamiento de bases completa en la región de la semilla gRNA, el 6-12 nt adyacente a la PAM; por el contrario, no corresponde a 5 &#39;de la semilla son generalmente tolerada 16-17. El OSD introducido se puede reparar, ya sea por el extremo no homóloga (NHEJ) de reparación del ADN o reparación dirigida homología de reparación del ADN (HDR) mechanisms.NHEJ menudo crea inserción / deleción (indeles) de unos pocos pares de bases en el sitio diana que puede interrumpir el marco de lectura abierto (ORF) de un gen. Para generar deleciones de mayor tamaño en el genoma de dos gRNAs, que flanquean la región de interés, se puede utilizar 18-19. Este enfoque es particularmente útil para el estudio de los potenciadores de la transcripción agrupadas en regiones de control de locus o super-potenciadores que son más grandes que los potenciadores convencionales 9,18,20-22. Supresiones monoallelic son un modelo valioso para el estudio de -Reglamento cis de la transcripción. El chang observadoe en el nivel de transcripción después de la eliminación monoallelic de un potenciador se correlaciona con el papel de promotor de que en la regulación de genes, sin los efectos de confusión que pueden ocurrir cuando la transcripción de ambos alelos se ve afectada potencialmente influir en la aptitud celular. Evaluación de la reducción de expresión es difícil, sin embargo, sin la capacidad de distinguir el borrado de el alelo de tipo salvaje. Además, la genotipificación de deleciones en cada alelo sin la capacidad de distinguir los dos alelos es un reto, especialmente para las grandes deleciones de&gt; 10 kb a 1 Mb 23 en el que es difícil para amplificar toda la región de tipo salvaje por PCR. El uso de células ES F1 generados por musculus cruce Mus 129 con Mus castaneus permite que los dos alelos que se diferencian por alelo-específico PCR 18,24. El genoma híbrido en estas células facilita alelo cribado deleción específica y análisis de la expresión. En promedio hay un SNP cada 125 pb entre estos dos genomas, Proporcionando flexibilidad en el diseño de cebadores para la expresión y genotipado analiza. La presencia de un SNP puede influir en la temperatura de fusión del cebador (T m) y apuntar a la especificidad en la amplificación cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) lo que permite la discriminación de los dos alelos 25. Además, una falta de coincidencia dentro de el extremo 3 &#39;del cebador influye en gran medida la capacidad de la ADN polimerasa para extender el cebador de la prevención de la amplificación de la diana alelo no deseado 26. Describe en el siguiente protocolo es el uso de células madre embrionarias para la F1 deleciones específicas de alelo potenciador de más de 1 kb y el análisis posterior expresión que utilizan el sistema de CRISPR / Cas9 edición genoma (Figura 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53552/53552fig1.jpg" /> Figura 1. eliminación reforzador usando CRISPR / Cas9 para estudiar cis -regulación de la expresión génica. células F1 ES (A) generados por un cruce entre Mus musculus 129 y castaneus Mus se utilizan para permitir la supresión alelo específico. (B) dos ARN de guía (gRNA) se utilizan para inducir una gran deleción mediada por Cas9 de la región potenciadora. (C) Los conjuntos de cebadores se utilizan para identificar gran mono- y bi-deleciones alélicas. Los cebadores de color naranja son los iniciadores en el interior, los cebadores de color púrpura son los cebadores externos y los cebadores verdes son los cebadores que flanquean gRNA. (D) Los cambios en la expresión génica son monitoreados mediante qPCR específica de alelo. RFU denota unidades relativas de fluorescencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53552/53552fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>NEB</td><td>M0530S</td> ADN <td>polimerasa de alta fidelidad utilizada en el ensamblaje de ARNg</td></tr><tr><td>Mezcla maestra de ensamblaje de Gibson</td><td>Vector de gRNA_Cloning NEB</td><td>E2611L</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Addgene</td><td>41824</td><td>Se clona una secuencia objetivo en este vector para crear el plásmido de ARNg</td></tr><tr><td>pCas9_GFP</td><td>Addgene</td><td>44719</td><td>SpCas9 y EGFP optimizados para codón plásmido de co-expresión</td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de transfección de neón 100 &micro; L Kit</td><td>Life Technologies</td><td>MPK10096</td><td>Tecnología de transfección de Microporator</td></tr><tr><td>prepGEM</td><td>ZyGEM</td><td>PT10500</td><td>reactivo de extracción de ADN genómico</td></tr><tr><td>Nucleo Spin Gel & Limpieza PCR</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit de plásmido de alta velocidad</td><td>Geneaid</td><td>PD300</td><td></td></tr><tr><td>Maxi Kit de plásmido libre de endotoxinas;</td><td>Geneaid</td><td>PME25</td><td></td></tr><tr><td>SYBR mezcla selecta para CFX</td><td>Life Technologies</td><td>4472942</td><td>reactivo de qPCR</td></tr><tr><td>kit de síntesis de ADNc iScript</td><td>Bio-rad</td><td>170-8891</td><td>Reactivo de transcripción inversa</td></tr><tr><td>0,25% Tripsina con EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>PBS sin Ca/Mg2+</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>13630080</td><td></td></tr><tr><td>BSA fracción V (7,5%)</td><td>Life Technologies</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Máxima eficiencia DH5 y alfa; células competentes</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ES cualificado</td><td></td><td>FBS se somete a una prueba previa en células madre embrionarias de ratón para determinar su pluripotencia</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11960069</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>No esencial aminoácido</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de sellado</td><td>Sarstedt</td><td>95.1994</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX</td><td>Biocision</td><td>BCS-405</td><td>contenedor de congelación celular sin alcohol</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Biovision</td><td>1748-5</td><td>Inhibidor para el cultivo de células F1 ES</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Invivogen</td><td>inh-pd32</td><td>Inhibidor para el cultivo celular de F1 ES</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Inhibidor de ESG1107 de quimio</td><td></td><td>para el cultivo de células F1 ES</td></tr></tbody></table>

la generación de crispr / cas9 mediada monoallelic deleciones para estudiar la función del reforzador en las células madre embrionarias de ratón

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Los potenciadores controlan la identidad celular regulando la expresión génica específica del tejido de manera independiente de la posición y la orientación. Estos potenciadores a menudo se localizan distalmente del gen regulado en regiones intergénicas o incluso dentro del cuerpo de otro gen. La naturaleza independiente de la posición de la actividad de los potenciadores hace que sea difícil hacer coincidir los potenciadores con los genes que regulan. La deleción de una región potenciadora proporciona evidencia directa de la actividad potenciadora y es el estándar de oro para revelar el papel de un potenciador en la transcripción de genes endógenos. Los métodos convencionales de deleción basados en la recombinación homóloga han sido superados por los avances recientes en la tecnología de edición del genoma, que permiten cambios rápidos y localizados con precisión en los genomas de numerosos organismos modelo. La edición del genoma mediada por CRISPR/Cas9 se puede utilizar para manipular el genoma en muchos tipos de células y organismos de forma rápida y rentable, debido a la facilidad con la que Cas9 puede dirigirse al genoma mediante un ARN guía de un plásmido de expresión a medida. La deleción homocigótica de elementos esenciales reguladores de genes podría conducir a la letalidad o alterar el fenotipo celular, mientras que la deleción monoalélica de potenciadores transcripcionales permite el estudio de la regulación cis de la expresión génica sin este problema de confusión. Aquí se presenta un protocolo para la deleción mediada por CRISPR/Cas9 en células madre embrionarias (ES) de ratón F1 (Mus musculus129 x Mus castaneus). La deleción monoalélica, el cribado y el análisis de la expresión se ven facilitados por los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) entre los dos alelos, que se producen en promedio cada 125 pb en estas células.

El protocolo descrito aquí utiliza células F1 ES para estudiar -regulación cis de la expresión génica en las células potenciador eliminado monoallelic generados usando CRISPR / edición genoma Cas9 (Figura 1). El gRNA y el diseño del cebador específico de alelo para el genotipado y la expresión génica son los factores clave en este enfoque. Cada conjunto de cebadores alelo-específica debe ser validado por qPCR para confirmar la especificidad de alelo. Cebadores e...

La validación experimental de la actividad potenciadora se aborda mejor mediante el análisis de pérdida de función. Aquí se presenta un protocolo eficiente que utiliza la deleción mediada por CRISPR/Cas9 para estudiar la regulación específica de alelos de la transcripción génica en células ES F1 que contienen un genoma híbrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).

La generación de CRISPR / Cas9 mediada monoallelic deleciones para estudiar la función del reforzador en las células madre embrionarias de ratón

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la eliminación mediada por CRISPR/Cas9 específica de alelo para estudiar la regulación de la transcripción génica en células madre embrionarias de ratón. La principal ventaja de esta técnica, que utiliza un genoma híbrido para generar y analizar deleciones monoalélicas, es que elimina la necesidad de analizar deleciones aumentadas monoalélicas que podrían no ser viables.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genómica funcional. Por ejemplo, qué gen regula un potenciador específico y en qué medida ese gen depende de un potenciador determinado para su actividad. Aunque este método puede proporcionar información sobre la pluripotencia de las células madre, también puede aplicarse a otros sistemas.Por ejemplo, puede ayudarnos a comprender cómo las células madre cambian su destino para convertirse en neuronas, células sanguíneas o músculo. Después de diseñar, construir y confirmar la secuencia del ARN guía, o ARN-g, que se utilizará, prepárese para transfectar los plásmidos libres de endotoxinas en células ES. Utilizando una centrífuga, separe por centrifugación un tiempo diez a la sexta células madre embrionarias F1 generadas mediante el cruce de Mus musculus 129 con Mus castaneus en un tubo de 1,5 mililitros a 300 veces g durante cinco minutos.Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y agregue 100 microlitros del tampón de resuspensión proporcionado por el fabricante del kit. Para la eliminación de la región de ADN diana, agregue cinco microgramos de cada uno de los plásmidos P Cas9 GFP 5-primo y 3-primo gRNA. Utilizando una pipeta, mezcle suavemente.Evite introducir burbujas. A continuación, use la punta electrónica de la micropipeta para aspirar 100 microlitros de la mezcla de electrotransferencia, teniendo cuidado de evitar introducir aire en la punta. Luego, conecte la pipeta al dispositivo de transfección.Seleccione el protocolo adecuado y presione inicio. Mientras la electroporación está en curso, observe la punta. Con la configuración correcta, deben emerger pequeñas burbujas del electrodo del tubo.Una chispa indica la presencia de una burbuja de aire e interferirá con la transfección. Si esto ocurre, debe repetirse la electroforesis con un nuevo lote de células. Tras la electroforesis, expulse las células transfectadas en una placa recubierta con gelatina de diez centímetros que contenga diez mililitros de medio para células ES.Incube las células transfectadas a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono. Después de 48 horas, utilice un citómetro de flujo para clasificar y aislar las células ES positivas para GFP del grupo nueve. Luego, siembre de 1 a 1,5 veces 10 a la cuarta células positivas para GFP en un plato de 10 centímetros, recubierto con gelatina y que contenga 10 mililitros de medio para células ES.El siembra a esta baja densidad facilitará la selección de colonias individuales de células ES. Cuatro a cinco días después, utilice un microscopio para identificar colonias individuales de células ES con forma esférica. Mediante una pipeta, transfiera cada colonia a un pocillo de una placa de 96 pocillos previamente tratada con gelatina y que contenga 30 microlitros de tripsom.Una vez que se hayan recolectado todas las colonias y disociado en el medio, cultive las células a 37 grados Celsius en la incubadora de dióxido de carbono hasta que la mayoría de los pocillos tengan más del 70 % de confluencia. Esto generalmente tarda unos dos días. Cuando las células estén listas para ser divididas, retire el medio y agregue 30 microlitros de tripsom.Incube las células durante cinco minutos. Luego, agregue 180 microlitros de medio para células ES a cada pocillo para neutralizar la tripsina. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión de células individuales.De cada pocillo, transfiera 70 microlitros a cada una de tres placas de 96 pocillos recubiertas con gelatina que contengan 130 microlitros de medio para células ES en cada pocillo. Incube a 37 grados Celsius. Cuando las placas alcancen una confluencia del 70 al 85 %, utilícelas para realizar la genotipificación y el análisis de expresión de cada clon, tal como se describe en las secciones siguientes.Congele las muestras celulares según se describe en el documento adjunto. Aquí, se diseñarán cuatro conjuntos de cebadores para analizar las cepas en busca de la eliminación deseada. Estos incluyen: cebadores internos, cebadores externos y cebadores que flanquean el ARN-g para ambos sitios diana del ARN-g en la región 5 prima y 3 prima.Comience visitando el sitio web que se muestra aquí para obtener la pista de polimorfismo de nucleótido único o snip correspondiente a los genotipos 129 y Cas. Esto redirige a la página web de CRISPR del Laboratorio Mitchell. Allí, haga clic en el enlace proporcionado.El sitio redirigirá al navegador de genoma UCSC que contiene la pista que muestra los SNPs entre los genomas 129 y Cas en el ensamblaje del genoma de ratón MM-9. A continuación, ingrese las coordenadas de la región que se eliminará y haga clic en «ir». Acérquese a una región de aproximadamente 500 pares de bases en el centro de la eliminación deseada que contenga más de tres SNPs.El diseño de cebadores específicos para alelos puede ser complicado si los SNPs son escasos. Si no es posible diseñar cebadores absolutamente específicos para alelos, pueden utilizarse cebadores moderadamente específicos. Solo recuerde comparar los valores de CT entre los clones eliminados y no eliminados durante el análisis de los resultados de qPCR.Ahora, haga clic en Ver en el panel superior. En el menú desplegable, seleccione ADN. Aparecerá la página Obtener ADN en la ventana.En las opciones de formato de secuencia, seleccione todo en mayúsculas y luego haga clic en "Obtener ADN" para mostrar la secuencia objetivo completamente en mayúsculas. Copie esta secuencia y péguela en un documento de Word. A continuación, compare la secuencia con la pista de corte 129 cast y resalte las posiciones de corte, marcando los cortes 129 con letras minúsculas.Cuando haya terminado con la secuencia 129, cópiela para crear dos secuencias en formato fast day. Una para 129 y otra para Cas. En la secuencia de Cas, sustituya la base correcta en cada posición de corte, marcando el corte con una letra minúscula.A continuación, etiquete la secuencia con su genoma correspondiente, 129 o Cas. Luego, en el navegador, escriba la dirección de Primer3Plus. En el área correspondiente, pegue la secuencia 129 con el fragmento sustituido.Utilice la configuración predeterminada para diseñar los cebadores. Para diseñar los cebadores internos específicos de alelo, haga clic en el menú desplegable a la derecha de "Task" y seleccione "Primer List", luego haga clic en "Pick Primers". Se abrirá una nueva página que mostrará una lista de cebadores directos e inversos.Marque la casilla de selección para elegir un cebador directo o inverso que tenga un snip marcado con una letra minúscula ya sea en el extremo 3-primo o dentro de cuatro bases del extremo 3-primo. Tenga en cuenta que los cebadores que tienen un snip en el extremo 3-primo muestran una especificidad alélica aumentada durante la qPCR. Haga clic en Enviar al Administrador de Primer3 en la parte inferior de la pantalla.Se abrirá una nueva página que mostrará el cebador seleccionado. Para seleccionar el segundo cebador, regrese a la página de la lista de cebadores y haga clic en el botón de retroceso para volver a la página principal. En el menú desplegable de tareas, seleccione Detección.La página principal se actualizará y aparecerá una caja para la secuencia del cebador izquierdo y otra para la derecha en la parte inferior. Pegue la secuencia del primer cebador en la caja correspondiente. A continuación, vaya a la pestaña Configuración general ubicada junto a la pestaña Principal y cambie la configuración del rango de tamaño del producto a 80-200 pares de bases.Haga clic en "Seleccionar cebadores". Se abrirá una página que mostrará cinco pares de cebadores posibles para la primera secuencia de cebador. Elija un conjunto de cebadores de la lista de pares de cebadores marcando las casillas a la izquierda de los cebadores y haga clic en "Enviar al administrador de Primer3" en la parte inferior de la pantalla. Estos serán los cebadores específicos del alelo interno 129.Repita estos pasos para diseñar cebadores para el alelo cast. Luego, aplique esta técnica al diseño de cebadores externos específicos de alelo y cebadores no específicos de alelo. Finalmente, pruebe la especificidad de los cebadores respecto al alelo mediante qPCR, como se describe en el documento adjunto.Extraiga el ADN genómico de la placa de 96 pocillos preparada anteriormente. Centrifugue brevemente la placa para hacer descender cualquier condensación al fondo del pocillo. Este ADN servirá como plantilla para la detección de deleciones.A continuación, en una placa de 384 pocillos, realice la qPCR por duplicado para cada clon. Utilice una PCR de dos pasos seguida de un análisis de curva de disociación con detección. Tras el análisis, revise primero cada alelo en busca de amplificación con los cebadores específicos del alelo interno.La ausencia de amplificación de un alelo o diferencias en los valores de CT de más de cinco ciclos entre alelos sugiere que estas colonias portan una deleción heterocigota. La falta de amplificación de ambos alelos sugiere que portan una deleción homocigota. A continuación, verifique la amplificación de cada alelo utilizando los cebadores específicos para alelos externos.Si la deleción objetivo es mayor de un KB, la amplificación con cebadores externos solo ocurrirá si está presente una deleción. Un valor de CT de 22 a 28 confirma la deleción. Para deleciones objetivo menores de un KB, confirme el tamaño del amplicón mediante electroforesis.Se analizó una placa de 96 pocillos con clones de deleción mediante qPCR utilizando cebadores internos específicos para cada alelo. Las barras grises representan la amplificación con cebadores específicos para Cas y las barras negras representan la amplificación con cebadores específicos para 129. Un valor bajo de CT o ausencia de amplificación con los cebadores internos indica la deleción del objetivo.Los clones con una deleción en uno o ambos alelos se analizan luego con los cebadores externos. Con los cebadores externos, la amplificación confirma la deleción. Los clones con deleción monoalélica se analizan utilizando cebadores que flanquean las regiones diana del ARN-g para confirmar la ausencia de inserciones o deleciones, denominadas indels, en el alelo no eliminado.Solo se utilizan clones monoalélicos sin indels grandes en los sitios diana del alelo no eliminado en el análisis subsiguiente de expresión. Aquí se muestran resultados representativos de clones eliminados de 129 o Cas SCR. El SCR es un potenciador específico de Sox2 recientemente descrito en células madre embrionarias.Las barras rojas representan la expresión del alelo Sox2 Cas, y las barras azules representan la amplificación del alelo Sox2 129. Como puede observarse en esta figura, la eliminación del SCR en el alelo 129 o Cas redujo la expresión de Sox2 en CIS. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar una eliminación grande utilizando la tecnología CRISPR y cómo usar cebadores específicos de alelo para genotipar sus clones eliminados.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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