La generación de CRISPR / Cas9 mediada monoallelic deleciones para estudiar la función del reforzador en las células madre embrionarias de ratón
2 de abril de 2016
La validación experimental de la actividad potenciadora se aborda mejor mediante el análisis de pérdida de función. Aquí se presenta un protocolo eficiente que utiliza la deleción mediada por CRISPR/Cas9 para estudiar la regulación específica de alelos de la transcripción génica en células ES F1 que contienen un genoma híbrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).
El objetivo general de este procedimiento es utilizar la deleción mediada por CRISPR/Cas9 alelo específico para estudiar la regulación de la transcripción génica en células madre embrionarias de ratón. La principal ventaja de esta técnica, que utiliza un genoma híbrido para generar y analizar deleciones monoalélicas. En cambio, elimina la necesidad de analizar deleciones monoalélicas mejoradas que pueden no ser viables.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genómica funcional. Por ejemplo, qué gen regula un potenciador específico y qué tan dependiente es ese gen de cualquier potenciador para su actividad. Con este método se puede obtener información sobre la pluripotencia de las células madre, también se puede aplicar a otros sistemas.
Por ejemplo, puede ayudarnos a entender cómo las células madre cambian su destino para convertirse en neuronas, células sanguíneas o músculos. Después de diseñar, construir y confirmar la secuencia del ARN guía, o ARNg, que se utilizará, prepárese para transfectar los plásmidos libres de endotoxinas en células ES. Usando una centrífuga, pellet una vez diez a la sexta F1 células madre embrionarias generadas cruzando Mus musculus 129 con Mus castaneus en un tubo de 1,5 mililitros a 300 veces g'durante cinco minutos.
Después del centrifugado, deseche el sobrenadante y agregue 100 microlitros del tampón de resuspensión suministrado por el fabricante del kit. Para la deleción de la región de ADN diana, agregue cinco microgramos de cada uno de los plásmidos de ARNg P Cas9 GFP 5-prime y 3-prime. Con una pipeta, mezcle suavemente.
Evite introducir burbujas. A continuación, utilice la punta de pipeta electrónica del microporador para aspirar 100 microlitros de la mezcla de electroporación, teniendo cuidado de evitar introducir aire en la punta. A continuación, conecte la pipeta al dispositivo de transfección.
Seleccione el protocolo adecuado y pulse inicio. Mientras se ejecuta la electroporación, observe la punta. Con la configuración correcta, deberían salir pequeñas burbujas del electrodo del tubo.
Una chispa indica la presencia de una burbuja de aire e interferirá con la transfección. Si esto ocurre, la electroporación debe repetirse con un nuevo lote de celdas. Después de la electroporación, expulse las células transfectadas en un plato recubierto de gelatina de diez centímetros que contenga diez mililitros de medio de célula ES.
Incubar las células transfectadas a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono. Después de 48 horas, use un citómetro de flujo para clasificar y aislar las nueve células madre embrionarias positivas para GFP. A continuación, alimente de 1 a 1,5 veces 10 a la cuarta célula GFP positiva en un plato de 10 centímetros recubierto de gelatina que contenga 10 mililitros de medio celular ES.
La siembra a esta baja densidad facilitará la recogida de colonias individuales de células madre embrionarias. Cuatro o cinco días después, use un microscopio para identificar colonias individuales de células madre embrionarias individuales en forma de bola. Con una pipeta, transfiera cada colonia a un pocillo de una placa de 96 pocillos pretratada con gelatina y que contenga 30 microlitros de tripsom.
Una vez que se hayan recogido todas las colonias y se hayan disociado en medio, cultive las células a 37 grados centígrados en la incubadora de dióxido de carbono hasta que la mayoría de los pocillos tengan más del 70% de confluentes. Esto suele tardar unos dos días. Cuando las celdas estén listas para dividirse, retire el medio y agregue 30 microlitros de tripsom.
Incuba las células durante cinco minutos. Luego, a cada pocillo se le añaden 180 microlitros de medio de células madre embrionarias para neutralizar el triposo. Pipetea hacia arriba y hacia abajo para lograr una suspensión de una sola celda.
De cada pocillo, transfiera 70 microlitros a cada una de las tres placas de 96 pocillos recubiertas de gelatina que contienen 130 microlitros de medio celular ES en cada pocillo. Incubar a 37 grados centígrados. Cuando las placas alcancen un 70 a 85% de confluencia, utilícelas para realizar el genotipado y el análisis de expresión de cada clon, como se describe en las secciones siguientes.
Congele las existencias de celdas como se describe en el documento adjunto. Aquí, se diseñarán cuatro juegos de cebadores para examinar los clones en busca de la eliminación deseada. Estos incluyen: cebadores interiores, cebadores exteriores y cebadores flanqueantes de ARNg para sitios diana de ARNg de 5 y 3 primos.
Comience visitando el sitio web que se muestra aquí para obtener el polimorfismo de un solo nucleótido o la pista de corte correspondiente a los genotipos 129 y Cas. Esto dirige a la página web de Mitchell Lab CRISPR. Allí, haga clic en el enlace dado.
El sitio redirigirá al navegador del genoma de la UCSC que contiene la pista que muestra recortes entre los genomas 129 y Cas en el ensamblaje del genoma del ratón MM-9. A continuación, introduzca las coordenadas de la región que se va a eliminar. y haga clic en ir"Acérquese a una región de aproximadamente 500 pares de bases en el medio de la eliminación deseada que contiene más de tres recortes.
El diseño de cebadores específicos de alelos puede ser complicado si las tijeras son escasas. Si no es posible diseñar cebadores específicos de alelos absolutos, se pueden usar cebadores específicos de alelos moderados. Solo recuerde comparar los valores de CT entre los clones eliminados y no eliminados durante el análisis de los resultados de la qPCR.
Ahora, haga clic en "Ver" en el panel superior. En el menú desplegable, seleccione ADN. Aparecerá la página "Obtener ADN en la ventana".
En las opciones de formato de secuencia, elija todo en mayúsculas, luego haga clic en Obtener ADN" para mostrar la secuencia objetivo en formato de mayúsculas. Copie esta secuencia y péguela en un archivo de documento de Word. A continuación, compare la secuencia con la pista de recorte de 129 lanzamientos y resalte las posiciones de recorte y marque los 129 recortes con minúsculas.
Cuando hayas terminado con la secuencia 129, cópiala para crear dos secuencias con formato de día rápido. Uno para 129 y otro para Cas. En la secuencia de lanzamiento, sustituya la base correcta en cada posición de recorte, marcando el recorte con minúsculas.
A continuación, etiquete la secuencia con su genoma correspondiente, 129 o Cas. Luego, en el navegador, escriba la dirección de Primer3Plus. En el área apropiada, pegue la secuencia 129 sustituida por el recorte.
Utilice la configuración predeterminada para diseñar las imprimaciones. Para diseñar los cebadores específicos de alelos internos, haga clic en el menú desplegable a la derecha de "Tarea" y seleccione Lista de cebadores" y haga clic en Seleccionar cebadores. Se abrirá una nueva página que muestra una lista de cebadores hacia adelante y hacia atrás.
Marque la casilla de selección para elegir un cebador hacia adelante o hacia atrás que tenga un recorte marcado con minúsculas, ya sea en el extremo de 3 primos o dentro de las cuatro bases del extremo de 3 cebadores. Obsérvese que los cebadores que tienen un corte en el extremo de 3 cebadores muestran una mayor especificidad alélica durante la qPCR. Haga clic en Enviar a Primer3 Manager" en la parte inferior de la pantalla.
Se abrirá una nueva página que muestra la imprimación seleccionada. Para seleccionar la segunda imprimación, vuelva a la página de lista de cebadores y haga clic en el botón Atrás para volver a la página principal. En el menú desplegable de tareas, seleccione Detección.
La página principal se actualizará y aparecerá un cuadro de secuencia de cebadores izquierdo y derecho en la parte inferior. Pega la primera secuencia de cebadores en el cuadro correspondiente. A continuación, vaya a la pestaña Configuración general ubicada junto a la pestaña Principal y cambie la configuración del rango de tamaño del producto a 80 a 200 pares de base.
Haga clic en Seleccionar cebadores"Se abrirá una página que muestra cinco posibles pares de cebadores para la primera secuencia de cebadores. Elija un juego de cebadores de la lista de pares de cebadores marcando las casillas a la izquierda de los cebadores y haga clic en Enviar a Primer3 Manager" en la parte inferior de la pantalla. Estos serán los 129 cebadores específicos de alelos internos.
Repita estos pasos para diseñar cebadores para el alelo fundido. A continuación, aplique esta técnica al diseño de cebadores externos específicos de alelos y cebadores no específicos de alelos. Por último, pruebe la especificidad alélica de los cebadores mediante qPCR como se describe en el documento adjunto.
Extraiga el ADN genómico de la placa de 96 pocillos preparada anteriormente. Centrifuga la placa brevemente para sedimentar cualquier condensación en el fondo del pozo. Este ADN servirá como plantilla para el cribado de deleción.
A continuación, en una placa de 384 pocillos, preforme qPCR y duplíquelo para cada clon. Utilice una PCR de dos pasos seguida de un análisis de la curva de fusión con detección. Después de la ejecución, primero verifique la amplificación de cada alelo con los cebadores específicos del alelo interno.
La ausencia de amplificación de un alelo o las diferencias en el valor de CT de más de cinco ciclos entre alelos sugieren que estos clones portan una deleción heterocigótica. La ausencia de amplificación de ambos alelos sugiere que portan una deleción homocigótica. A continuación, compruebe la amplificación de cada alelo con los cebadores específicos del alelo exterior.
Si la deleción de destino es mayor de un KB, la amplificación con cebadores externos solo se producirá si hay una deleción. Un valor de CT de 22 a 28 confirma la deleción. En el caso de las deleciones objetivo de menos de un KB, confirme el tamaño del amplicón mediante eletroforesis.
Una placa de 96 pocillos de clones de deleción se examinó mediante qPCR utilizando cebadores internos específicos de alelos. Las barras grises representan los cebadores específicos de Cas y las barras negras representan la amplificación de los cebadores específicos de 129. Un valor bajo de CT o ninguna amplificación con cebadores internos indica la deleción del objetivo.
Los clones con una deleción en uno o ambos alelos se examinan con los cebadores externos. Con cebadores externos, la amplificación confirma la eliminación. Los clones con una deleción monoalélica se examinan utilizando cebadores que flanquean las regiones diana del ARNg para confirmar la ausencia de inserciones o deleciones, llamadas indels, en el alelo no delecionado.
En el análisis de expresión posterior solo se utilizan clones monoalélicos sin indels grandes en los sitios objetivo del alelo no delecionado. A continuación se muestran los resultados representativos de 129 clones eliminados de Cas SCR. El SCR es un potenciador específico de Sox2 recientemente descrito en células madre embrionarias.
Las barras rojas representan la expresión del alelo Sox2 Cas, y las barras azules representan la amplificación del alelo Sox2 129. Como se puede ver en esta figura, la deleción de la SCR en el alelo 129 o Cas redujo la expresión de Sox2 en CIS. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo generar una deleción grande usando la tecnología CRISPR y usar cebadores específicos de alelos para genotipar tus clones eliminados.
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Resumen
Este artículo presenta un protocolo para utilizar la eliminación mediada por CRISPR/Cas9 con el fin de estudiar la regulación alélica específica de la transcripción génica en células madre embrionarias de ratón. La técnica aprovecha un genoma híbrido para facilitar el análisis de deleciones monoalélicas, proporcionando información sobre la regulación génica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Genómica funcional
- Regulación de la transcripción génica
- Tecnología CRISPR/Cas9
Antecedentes
- Comprender la actividad de los potenciadores es fundamental para la regulación génica.
- El análisis de pérdida de función es un enfoque clave en este campo.
- Las células madre embrionarias de ratón proporcionan un modelo para estudiar la regulación génica.
- Los genomas híbridos pueden ayudar a analizar interacciones génicas específicas.
Objetivo del estudio
- Investigar el papel de potenciadores específicos en la regulación génica.
- Determinar la dependencia de los genes respecto a potenciadores particulares.
- Mejorar la comprensión de la pluripotencia de las células madre y sus aplicaciones.
Métodos Utilizados
- Técnica de eliminación mediada por CRISPR/Cas9.
- Uso de células ES F1 con un genoma híbrido (Mus musculus 129 x Mus castaneus).
- Análisis de eliminaciones monoalélicas para estudiar la transcripción génica.
- Validación experimental de la actividad de potenciadores mediante análisis de pérdida de función.
Resultados principales
- Implementación exitosa de deleciones alélicas específicas en células madre.
- Conocimientos sobre la regulación de la transcripción génica por potenciadores específicos.
- Demuestra la aplicabilidad del método a diversos sistemas biológicos.
- Contribución al entendimiento de la genómica funcional.
Conclusiones
- El método CRISPR/Cas9 es eficaz para estudiar la actividad de los potenciadores.
- Este enfoque puede aclarar la relación entre los potenciadores y la expresión génica.
- Los hallazgos podrían tener implicaciones más amplias para la investigación con células madre y la genómica funcional.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite una interrogación precisa de la función de los potenciadores mediante la eliminación alélica específica de CRISPR/Cas9 en células madre embrionarias de ratón híbridas, abordando un desafío clave en la validación de objetivos: vincular elementos reguladores distales con la expresión génica. Aprovechando los polimorfismos naturales de nucleótido único (SNP) entre los alelos de Mus musculus 129 y Mus castaneus, este enfoque facilita la reducción mecanicista de riesgos en reguladores transcripcionales sin la letalidad homocigótica que podría confundir los resultados, proporcionando una confianza predictiva en las relaciones entre potenciadores y genes desde las primeras etapas del descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la evaluación de la necesidad de potenciadores para la expresión génica en un modelo de células madre fisiológicamente relevante.
- Valor científico: Facilita la reducción de riesgos biológicos mediante análisis de pérdida de función monoalélica que evita confusiones fenotípicas derivadas de la eliminación completa de elementos reguladores.
- Valor científico: Aumenta la confianza en el blanco al proporcionar evidencia directa de regulación cis mediante cribado por eliminación alélica específica utilizando cebadores que discriminan SNPs.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor operativo: Facilita la estandarización del ensayo mediante genotipificación por qPCR con cebadores específicos de alelo internos y externos para distinguir clones heterocigotos, homocigotos y de tipo silvestre.
- Valor operativo: Permite un flujo de trabajo de cribado escalable mediante la selección de colonias en placas de 96 pocillos y qPCR en placas de 384 pocillos para la validación de eliminaciones de alto rendimiento.
- Valor operativo: Apoya la reproducibilidad del ensayo al requerir la confirmación de la ausencia de inserciones o deleciones en el alelo no eliminado mediante cebadores que flanquean el ARN-g antes del análisis de expresión.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor traslacional: Proporciona información relevante sobre el sistema de la enfermedad mediante el estudio de la regulación mediada por potenciadores de factores de pluripotencia como Sox2 en células madre embrionarias de ratón.
- Valor traslacional: Apoya la confianza predictiva en las decisiones del destino de las células madre al vincular la eliminación de potenciadores con cambios en la expresión génica relevantes para las vías de diferenciación.
- Valor traslacional: Permite la reducción mecanicista de riesgos en objetivos potenciadores mediante análisis cuantitativo de expresión (qPCR) que muestra una reducción alélica específica en la transcripción del gen objetivo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la transición desde la biología de descubrimiento hasta la identificación de candidatos al proporcionar una validación funcional de elementos reguladores no codificantes antes de su intervención terapéutica, generando resultados que informan directamente las decisiones de priorización de objetivos y reducción de riesgos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre las relaciones entre potenciadores y genes mediante la eliminación alélica específica y el análisis de expresión en un modelo genéticamente manejable.
- Selección: Ofrece preparación para ensayos mediante un protocolo estandarizado de qPCR que utiliza cebadores específicos para cada alelo, cuantificando la eficiencia y especificidad de la eliminación en diferentes clones.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes (valores CT, curvas de disociación) que permiten comparar la expresión alélica y la homocigosidad/heterocigosidad de la eliminación.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al estudiar la función de potenciadores en un modelo de células madre relevante para la diferenciación y la modelización de enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para la validación de potenciadores en distintas regiones genómicas, empleando el mismo diseño de cebadores basado en SNP y el mismo protocolo de CRISPR.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la función del potenciador mediante evidencia directa de pérdida de función, sin mecanismos compensatorios derivados de la eliminación homocigota.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad mediante el diseño de cebadores alélo-específicos guiado por SNP y protocolos de cribado por qPCR.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción del proyecto al aclarar la dependencia del potenciador y reducir la ambigüedad mecanicista en la validación del objetivo.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de objetivos transcripcionales basada en relaciones gen-potenciador validadas en un contexto celular relevante para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el diseño de CRISPR/Cas9, la ingeniería de cebadores alélicos específicos y el análisis de PCR cuantitativa para la discriminación alélica.
- Depende del acceso a células madre embrionarias híbridas F1 con densidad suficiente de SNP (cada ~125 pb) para un direccionamiento alélico confiable.
- Necesita estandarización entre equipos en los flujos de trabajo de diseño de cebadores mediante el navegador del genoma UCSC y Primer3Plus para garantizar la especificidad alélica.
- Incluye consideraciones de adaptación para modelos no híbridos en los que la densidad de SNP puede ser insuficiente para lograr resolución alélica específica.
- Comprende limitaciones prácticas, como la necesidad de confirmar la ausencia de indels en el alelo no eliminado antes de atribuir cambios en la expresión a la pérdida del potenciador.
