Name: La generación de CRISPR / Cas9 mediada monoallelic deleciones para estudiar la función del reforzador en las células madre embrionarias de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprende a generar deleciones monoalélicas con CRISPR/Cas9 en células madre embrionarias de ratón para estudiar la regulación de genes por reforzadores. Este método permite analizar la función específica de alelos en genómica funcional.

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Nos gustaría agradecer a todos los miembros del laboratorio Mitchell por sus útiles discusiones. Este trabajo contó con el apoyo de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud, la Fundación Canadiense para la Innovación y el Ministerio de Investigación e Innovación de Ontario (subvenciones operativas y de infraestructura de JAM).

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<li>Melnikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+dissection+and+optimization+of+inducible+enhancers+in+human+cells+using+a+massively+parallel+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 271-277 (2012).</li>
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<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+off-target+effects+of+CRISPR%2FCas-derived+RNA-guided+endonucleases+and+nickases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases.</a> Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).</li>
<li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28 (24), 2699-2711 (2014).</li>
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<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
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Los autores han leído las políticas de Júpiter sobre el conflicto de intereses y no tienen conflictos a revelar.

CRISPR / Cas9 tecnología de edición genoma mediada proporciona un método sencillo, rápido y barato para la modificación del genoma. El método detallado aquí para generar y analizar eliminación potenciador monoallelic para la caracterización funcional potenciador se aprovecha de SNPs en células de ratón F1. Las ventajas de este tipo de enfoque son: 1) deleciones potenciador monoallelic no producen efectos de confusión que se producen cuando un promotor de crítico se elimina de ambos alelos, es decir, una gran re...

Elementos reguladores de la transcripción son críticos para la puesta a punto espacio-temporal de la expresión génica durante el desarrollo 1 y la modificación de estos elementos puede dar lugar a la enfermedad debido a la expresión aberrante de genes 2. Muchas regiones asociadas a la enfermedad identificados por el genoma estudios de asociación de todo se encuentran en las regiones no codificantes y tienen características de potenciadores de la transcripción 3-4. La identificación de los potenciadores y emparejarlos con los genes que regulan se complica ya que a menudo se encuentran varias kilobases lejos de los genes que regulan y pueden ser activados de una manera específica de tejido 5-6. Predicciones Enhancer se basan comúnmente en marcas de modificación de las histonas, complejos de cohesinas-mediador y la unión de células de transcripción de tipo específico factores de 7-10. Validación de potenciadores predichos a menudo se realiza a través de un ensayo basado en vector en el que el potenciador activa la expresión de un gen indicador 11-12. Estos datos proporcionan valuable información sobre el potencial regulador de las secuencias potenciadoras putativos, pero no revelan su función en su contexto genómico endógeno o identificar los genes que regulan. edición genoma sirve como una poderosa herramienta para estudiar la función de los elementos reguladores de la transcripción en su contexto endógena mediante análisis de la pérdida de función. Los avances recientes en la edición del genoma, es decir, el sistema de edición de genoma / Cas9 CRISPR, facilitar la investigación de la función del genoma. El sistema / Cas9 CRISPR es fácil de usar y adaptable para muchos sistemas biológicos. La proteína Cas9 está dirigida a un sitio específico en el genoma por un ARN de guía (gRNA) 13. El complejo SpCas9 / gRNA escanea el genoma de su secuencia genómica diana que debe ser de 5 &#39;a una secuencia protospacer motivo adyacente (PAM), NGG 14-15. el apareamiento de bases de la gRNA a su diana, un (nt) secuencia de 20 nucleótidos complementaria a la gRNA, activa la actividad nucleasa SpCas9 que resulta en una doubldescanso e hebra (DSB) 3 pb aguas arriba de la secuencia de PAM. La especificidad se logra a través de apareamiento de bases completa en la región de la semilla gRNA, el 6-12 nt adyacente a la PAM; por el contrario, no corresponde a 5 &#39;de la semilla son generalmente tolerada 16-17. El OSD introducido se puede reparar, ya sea por el extremo no homóloga (NHEJ) de reparación del ADN o reparación dirigida homología de reparación del ADN (HDR) mechanisms.NHEJ menudo crea inserción / deleción (indeles) de unos pocos pares de bases en el sitio diana que puede interrumpir el marco de lectura abierto (ORF) de un gen. Para generar deleciones de mayor tamaño en el genoma de dos gRNAs, que flanquean la región de interés, se puede utilizar 18-19. Este enfoque es particularmente útil para el estudio de los potenciadores de la transcripción agrupadas en regiones de control de locus o super-potenciadores que son más grandes que los potenciadores convencionales 9,18,20-22. Supresiones monoallelic son un modelo valioso para el estudio de -Reglamento cis de la transcripción. El chang observadoe en el nivel de transcripción después de la eliminación monoallelic de un potenciador se correlaciona con el papel de promotor de que en la regulación de genes, sin los efectos de confusión que pueden ocurrir cuando la transcripción de ambos alelos se ve afectada potencialmente influir en la aptitud celular. Evaluación de la reducción de expresión es difícil, sin embargo, sin la capacidad de distinguir el borrado de el alelo de tipo salvaje. Además, la genotipificación de deleciones en cada alelo sin la capacidad de distinguir los dos alelos es un reto, especialmente para las grandes deleciones de&gt; 10 kb a 1 Mb 23 en el que es difícil para amplificar toda la región de tipo salvaje por PCR. El uso de células ES F1 generados por musculus cruce Mus 129 con Mus castaneus permite que los dos alelos que se diferencian por alelo-específico PCR 18,24. El genoma híbrido en estas células facilita alelo cribado deleción específica y análisis de la expresión. En promedio hay un SNP cada 125 pb entre estos dos genomas, Proporcionando flexibilidad en el diseño de cebadores para la expresión y genotipado analiza. La presencia de un SNP puede influir en la temperatura de fusión del cebador (T m) y apuntar a la especificidad en la amplificación cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) lo que permite la discriminación de los dos alelos 25. Además, una falta de coincidencia dentro de el extremo 3 &#39;del cebador influye en gran medida la capacidad de la ADN polimerasa para extender el cebador de la prevención de la amplificación de la diana alelo no deseado 26. Describe en el siguiente protocolo es el uso de células madre embrionarias para la F1 deleciones específicas de alelo potenciador de más de 1 kb y el análisis posterior expresión que utilizan el sistema de CRISPR / Cas9 edición genoma (Figura 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53552/53552fig1.jpg" /> Figura 1. eliminación reforzador usando CRISPR / Cas9 para estudiar cis -regulación de la expresión génica. células F1 ES (A) generados por un cruce entre Mus musculus 129 y castaneus Mus se utilizan para permitir la supresión alelo específico. (B) dos ARN de guía (gRNA) se utilizan para inducir una gran deleción mediada por Cas9 de la región potenciadora. (C) Los conjuntos de cebadores se utilizan para identificar gran mono- y bi-deleciones alélicas. Los cebadores de color naranja son los iniciadores en el interior, los cebadores de color púrpura son los cebadores externos y los cebadores verdes son los cebadores que flanquean gRNA. (D) Los cambios en la expresión génica son monitoreados mediante qPCR específica de alelo. RFU denota unidades relativas de fluorescencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53552/53552fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>NEB</td><td>M0530S</td> ADN <td>polimerasa de alta fidelidad utilizada en el ensamblaje de ARNg</td></tr><tr><td>Mezcla maestra de ensamblaje de Gibson</td><td>Vector de gRNA_Cloning NEB</td><td>E2611L</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Addgene</td><td>41824</td><td>Se clona una secuencia objetivo en este vector para crear el plásmido de ARNg</td></tr><tr><td>pCas9_GFP</td><td>Addgene</td><td>44719</td><td>SpCas9 y EGFP optimizados para codón plásmido de co-expresión</td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de transfección de neón 100 &micro; L Kit</td><td>Life Technologies</td><td>MPK10096</td><td>Tecnología de transfección de Microporator</td></tr><tr><td>prepGEM</td><td>ZyGEM</td><td>PT10500</td><td>reactivo de extracción de ADN genómico</td></tr><tr><td>Nucleo Spin Gel & Limpieza PCR</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit de plásmido de alta velocidad</td><td>Geneaid</td><td>PD300</td><td></td></tr><tr><td>Maxi Kit de plásmido libre de endotoxinas;</td><td>Geneaid</td><td>PME25</td><td></td></tr><tr><td>SYBR mezcla selecta para CFX</td><td>Life Technologies</td><td>4472942</td><td>reactivo de qPCR</td></tr><tr><td>kit de síntesis de ADNc iScript</td><td>Bio-rad</td><td>170-8891</td><td>Reactivo de transcripción inversa</td></tr><tr><td>0,25% Tripsina con EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>PBS sin Ca/Mg2+</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>13630080</td><td></td></tr><tr><td>BSA fracción V (7,5%)</td><td>Life Technologies</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Máxima eficiencia DH5 y alfa; células competentes</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ES cualificado</td><td></td><td>FBS se somete a una prueba previa en células madre embrionarias de ratón para determinar su pluripotencia</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11960069</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>No esencial aminoácido</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de sellado</td><td>Sarstedt</td><td>95.1994</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX</td><td>Biocision</td><td>BCS-405</td><td>contenedor de congelación celular sin alcohol</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Biovision</td><td>1748-5</td><td>Inhibidor para el cultivo de células F1 ES</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Invivogen</td><td>inh-pd32</td><td>Inhibidor para el cultivo celular de F1 ES</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Inhibidor de ESG1107 de quimio</td><td></td><td>para el cultivo de células F1 ES</td></tr></tbody></table>

la generación de crispr / cas9 mediada monoallelic deleciones para estudiar la función del reforzador en las células madre embrionarias de ratón

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Los potenciadores controlan la identidad celular regulando la expresión génica específica del tejido de manera independiente de la posición y la orientación. Estos potenciadores a menudo se localizan distalmente del gen regulado en regiones intergénicas o incluso dentro del cuerpo de otro gen. La naturaleza independiente de la posición de la actividad de los potenciadores hace que sea difícil hacer coincidir los potenciadores con los genes que regulan. La deleción de una región potenciadora proporciona evidencia directa de la actividad potenciadora y es el estándar de oro para revelar el papel de un potenciador en la transcripción de genes endógenos. Los métodos convencionales de deleción basados en la recombinación homóloga han sido superados por los avances recientes en la tecnología de edición del genoma, que permiten cambios rápidos y localizados con precisión en los genomas de numerosos organismos modelo. La edición del genoma mediada por CRISPR/Cas9 se puede utilizar para manipular el genoma en muchos tipos de células y organismos de forma rápida y rentable, debido a la facilidad con la que Cas9 puede dirigirse al genoma mediante un ARN guía de un plásmido de expresión a medida. La deleción homocigótica de elementos esenciales reguladores de genes podría conducir a la letalidad o alterar el fenotipo celular, mientras que la deleción monoalélica de potenciadores transcripcionales permite el estudio de la regulación cis de la expresión génica sin este problema de confusión. Aquí se presenta un protocolo para la deleción mediada por CRISPR/Cas9 en células madre embrionarias (ES) de ratón F1 (Mus musculus129 x Mus castaneus). La deleción monoalélica, el cribado y el análisis de la expresión se ven facilitados por los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) entre los dos alelos, que se producen en promedio cada 125 pb en estas células.

El protocolo descrito aquí utiliza células F1 ES para estudiar -regulación cis de la expresión génica en las células potenciador eliminado monoallelic generados usando CRISPR / edición genoma Cas9 (Figura 1). El gRNA y el diseño del cebador específico de alelo para el genotipado y la expresión génica son los factores clave en este enfoque. Cada conjunto de cebadores alelo-específica debe ser validado por qPCR para confirmar la especificidad de alelo. Cebadores e...

La validación experimental de la actividad potenciadora se aborda mejor mediante el análisis de pérdida de función. Aquí se presenta un protocolo eficiente que utiliza la deleción mediada por CRISPR/Cas9 para estudiar la regulación específica de alelos de la transcripción génica en células ES F1 que contienen un genoma híbrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).

La generación de CRISPR / Cas9 mediada monoallelic deleciones para estudiar la función del reforzador en las células madre embrionarias de ratón

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la eliminación mediada por CRISPR/Cas9 específica de alelo para estudiar la regulación de la transcripción génica en células madre embrionarias de ratón. La principal ventaja de esta técnica, que utiliza un genoma híbrido para generar y analizar deleciones monoalélicas, es que elimina la necesidad de analizar deleciones aumentadas monoalélicas que podrían no ser viables.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genómica funcional. Por ejemplo, qué gen regula un potenciador específico y en qué medida ese gen depende de un potenciador determinado para su actividad. Aunque este método puede proporcionar información sobre la pluripotencia de las células madre, también puede aplicarse a otros sistemas.Por ejemplo, puede ayudarnos a comprender cómo las células madre cambian su destino para convertirse en neuronas, células sanguíneas o músculo. Después de diseñar, construir y confirmar la secuencia del ARN guía, o ARN-g, que se utilizará, prepárese para transfectar los plásmidos libres de endotoxinas en células ES. Utilizando una centrífuga, separe por centrifugación un tiempo diez a la sexta células madre

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

CRISPR/Cas9 es un sistema robusto para producir disrupción de genes y elementos genéticos. En este trabajo describimos un protocolo para la creación eficiente de deleciones genómicas en líneas celulares de mamíferos utilizando CRISPR/Cas9.

Generación de deleciones genómicas en líneas celulares de mamíferos a través de CRISPR / Cas9

Las proteínas a menudo contienen varios dominios que pueden ejercer diferentes funciones celulares. Genes knock-out (KO) no tienen en cuenta esta diversidad funcional. Aquí, se presenta un enfoque basado en la estructura-función de intercambio de casete de recombinación mediada (RMCE) en células madre embrionarias de KO que permite la disección molecular de varios dominios funcionales o variantes de una proteína.

Los estudios de estructura-función en las células madre embrionarias de ratón Usando mediada por recombinasa Cambio de Cassette

Este protocolo describe los pasos necesarios para diseñar y realizar targeting multiplexados de potenciadores con la desactivación proteína de fusión SID4X-dCas9-Cascarudo, también conocido como interferencia de enhancer (potenciador-i). Este protocolo permite la identificación de los reforzadores que regulan la expresión génica y facilita la disección de las relaciones entre los potenciadores de regulación de un gen de destino común.

Disección de la función del reforzador mediante Multiplex basados en CRISPR potenciador de interferencia en líneas celulares

Se describen protocolos para la edición del genoma altamente eficiente de células madre hematopoyéticas murinas (HSPC) por el sistema CRISPR/Cas9 para desarrollar rápidamente sistemas de modelos de ratón con modificaciones genéticas específicas del sistema hematopoyético.

Edición del genoma mediado por CRISPR/Cas9 para el estudio de células hematopoyéticas en modelos de enfermedades

Este método está diseñado para seguir la formación de dominios de cromatina mediadas por PRC2 en líneas celulares, y el método se puede adaptar a muchos otros sistemas.

Un método para estudiar la formación de novo de dominios de cromatina

Este protocolo proporciona un método para facilitar la generación de cambios de nucleótidos heterocigotos u homocigotos definidos utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas.

Generación de modificaciones genómicas definidas utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas

Aquí, presentamos un método modificado para la criopreservación de embriones unicelulares, así como un protocolo que combina el uso de embriones de congelación descongelado y electroporación para la generación eficiente de ratones modificados genéticamente.

Uso de embriones congelados descongelados para la producción de alta eficiencia de ratones modificados genéticamente

Aquí, describimos una técnica simple destinada a la generación eficiente de ratones genéticamente modificados llamada CRISPR RNP Electroporación de Cigotos (CRISPR-EZ). Este método proporciona reactivos de edición por electroporación en embriones con una eficiencia cercana al 100%. Este protocolo es efectivo para mutaciones puntuales, pequeñas inserciones genómicas y deleciones en embriones de mamíferos.

Edición eficiente del genoma de ratones mediante electroporación CRISPR de cigotos

Aquí presentamos un protocolo para desarrollar modelos de ratón modificados genéticamente utilizando células madre embrionarias, especialmente para ADN grande knock-in (KI). Este protocolo se ajusta utilizando la edición del genoma CRISPR / Cas9, lo que resulta en una eficiencia de KI significativamente mejorada en comparación con el método convencional de orientación de ADN linealizado mediado por recombinación homóloga.

Focalización génica altamente eficiente mediada por CRISPR/Cas9 en células madre embrionarias para desarrollar modelos de ratón manipulados genéticamente

En este artículo se informa de la construcción de células knockout de proteína E asociada al centrómero (CENP-E) utilizando el sistema CRISPR/Cas9 y tres estrategias de cribado basadas en el fenotipo. Hemos utilizado la línea celular knockout CENP-E para establecer un enfoque novedoso para validar la especificidad y toxicidad de los inhibidores de CENP-E, que es útil para el desarrollo de fármacos y la investigación biológica.

Generación de líneas celulares knockout de proteína E CENP-E-/- asociadas al centrómero utilizando el sistema CRISPR/Cas9

El método presentado describe la generación de un knockout génico mediado por CRISPR en la línea H9 de células madre embrionarias humanas (hESC), que expresa de manera estable sgRNAs dirigidos al gen L2HGDH utilizando un sistema de entrega de genes mediado por lentivirales altamente eficiente.

Deleción génica mediada por CRISPR-Cas9 en células madre pluripotentes humanas cultivadas en condiciones libres de alimentadores

Aprende a generar deleciones monoalélicas con CRISPR/Cas9 en células madre embrionarias de ratón para estudiar la regulación de genes por reforzadores. Este método permite analizar la función específica de alelos en genómica funcional.

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La generación de CRISPR / Cas9 mediada monoallelic deleciones para estudiar la función del reforzador en las células madre embrionarias de ratón

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