Evaluación de planar-Cell-polaridad fenotipos en ciliopatía ratón mutante cóclea

El objetivo general de este protocolo es examinar la cóclea de ratón con mutación ciliar en busca de fenotipos de polaridad de células planas. Estas técnicas permiten un amplio detallado del fenotipo coclear, lo que conducirá a una comprensión más precisa de la implicación ciliar en el establecimiento de la señalización de PCP en vertebrados. La principal ventaja de este protocolo es que, una vez dominado, el epitelio coclear disecado se puede utilizar para una variedad de diferentes tipos de análisis fenotípicos.

Después de preparar los reactivos y el tejido de animales de experimentación, en la etapa de desarrollo E16.5 a p3, use una hoja de bisturí o un pequeño par de tijeras para diseccionar la cabeza a lo largo de la línea media sagital comenzando en la nariz y extendiendo el cotilo. Retire el cerebro de cada mitad del cráneo con un par de pinzas. A continuación, identifique los huesos temporales que contienen los laberintos óseos en desarrollo del oído interno.

Mientras trabajas con la muestra bajo un microscopio de disección, usa un par de pinzas para alejar los laberintos óseos del cráneo pasando las pinzas suavemente por debajo de los laberintos óseos. Después de la disección, use la punta de las pinzas de disección para despejar las ventanas ovaladas y redondas y hacer un pequeño orificio en el ápice de la espiral coclear. A continuación, fije los laberintos óseos en 1,5 mililitros de paraformaldehído al 4% durante cinco minutos en hielo para permitir una fácil eliminación de la membrana tectorial.

Ahora, coloque los laberintos óseos en un plato de disección recubierto de elastómero de silicona negra que contenga PBS para facilitar la disección. Utilice las pinzas número cinco para extraer el cartílago externo, exponiendo el conducto coclear. Comience en la ventana ovalada, inserte la punta inferior de las pinzas en la ventana ovalada y abra suavemente el cartílago, moviéndose lentamente hacia arriba hacia el ápice.

A continuación, utilice un par de pinzas finas para pellizcar la membrana de Reissner en la base del conducto coclear y despéguela con un movimiento ascendente. Visualizar la cara dorsal del conducto coclear, incluyendo el epitelio sensorial. A continuación, utiliza las pinzas número 55 para pellizcar la membrana tectorial en la base de la cóclea y despegarla hacia arriba, hacia el ápice.

La extirpación completa de la membrana tectorial es necesaria para obtener las mejores imágenes con inmunohistoquímica, y es esencial para la microscopía electrónica de barrido. Después de exponer el órgano de Corti, fije aún más el tejido y realice la inmunohistoquímica, o prepárese para la microscopía electrónica de barrido, como se detalla en la parte escrita del protocolo. Una vez que se haya teñido el tejido, coloque la muestra en una placa de elastómero de silicona negra que contenga PBS.

Con pinzas finas, extirpe la región vestibular de la espiral coclear. A continuación, extraiga con mucho cuidado el cartílago subyacente y el mesénquima de la espiral coclear. La espiral coclear restante contiene el surco interno, el órgano de Corti, y el surco externo.

Transfiera la espiral coclear a una gota de PBS colocada en un portaobjetos de microscopio. Absorba el PBS con un pañuelo absorbente o un trozo de papel de filtro y vuelva a colocar suavemente la espiral coclear si el epitelio se ha desplazado y se superpone sobre sí mismo. Agregue una gota de medio de montaje directamente sobre la muestra de cóclea y coloque suavemente un cubreobjetos directamente sobre la muestra, teniendo cuidado de evitar burbujas de aire.

Utilice un microscopio confocal de barrido epifluorescente o láser equipado con objetivos de gran aumento y alta apertura numérica para capturar imágenes de la superficie apical de la célula ciliada coclear. Utilice objetivos inferiores para tomar imágenes superpuestas de la espiral coclear y cuantificar la longitud del conducto coclear. Las siguientes imágenes muestran la tinción inmunofluorescente de la cóclea de tipo postnatal de tipo postnatal del primer día.

La faloidina marca la actina filamentosa en los estereocilios y la actina cortical en la periferia celular. La miosina VIIA es un marcador de las células ciliadas internas y externas. ZO_1 etiqueta las uniones estrechas entre las células, lo que lo convierte en un gran marcador para distinguir los límites de las células.

La alfa-tubulina acetilada se utiliza como marcador del cinecilio en el vértice del haz, como indica la flecha blanca. Los microtúbulos internos también están marcados por alfa-tubulina acetilada, que es particularmente abundante en las células pilares, como lo indican los asteriscos blancos. Esta imagen de conductos cocleares disecados en E18.5, teñidos con tubulina acetilada, demuestra un marcado acortamiento de los conductos cocleares knockout condicionales IFT20 en comparación con el control.

La siguiente imagen es una preparación de montaje completo del giro coclear basal, en un ratón knockout BBS8, en el día cero postnatal. Los haces estereociliares en las cócleas knockout BBS8 están rotados de forma variable, como lo indica la flecha hacia la derecha, o aplanados y mal localizados, como indica la flecha central. Los kinocilios están mal localizados o faltan axonemas, como lo indica la flecha izquierda.

Al preparar el fenotipo coclear para el análisis, es importante recordar que las diferencias en los antecedentes genéticos pueden modificar el fenotipo coclear. Por lo tanto, es importante utilizar controles de compañeros de camada para el análisis. Otros análisis incluyen pruebas audiométricas y cultivo de explantes cocleares, lo que permite el tratamiento con varios activadores o inhibidores de señalización, contribuyendo así a la comprensión mecanicista de los procesos de desarrollo involucrados.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar el tejido coclear para analizar el papel de los componentes ciliares y sus distintos efectos en la señalización de PCP.