Una nueva estrategia Array-CGH, secuenciación del exoma todo y electroporación en el útero en roedores para identificar los Genes causales de las malformaciones del cerebro

El objetivo general de este procedimiento es identificar nuevos genes candidatos para trastornos por malformación cerebral y confirmar directamente su papel causal in-vivo. Esta estrategia puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología mediante el descubrimiento de vías moleculares asociadas con el desarrollo cerebral y las patologías correlacionadas. La principal ventaja de esta estrategia es que contribuirá al descubrimiento de nuevos genes asociados con trastornos cerebrales y al desarrollo de nuevas herramientas diagnósticas.

Mediante este enfoque, podríamos revelar la contribución crucial del gen C6orf70 en la patogénesis de la heterotopía nodular periventricular, una malformación cerebral causada por una migración neuronal anormal. El procedimiento será demostrado por Fabienne Schaller, una ingeniera de nuestro laboratorio. Prepare una rata preñada E15 para el procedimiento según se describe en el protocolo escrito y de acuerdo con las directrices institucionales y nacionales.

Asegúrese de que el animal esté adecuadamente anestesiado, de que se haya aplicado pomada oftálmica en los ojos y de que el abdomen esté correctamente afeitado y desinfectado. Después, use tijeras afiladas para hacer una incisión vertical de dos centímetros en la piel y el músculo de la línea media del abdomen caudal y exponga cuidadosamente un cuerno uterino desde la cavidad abdominal. Aplique gota a gota solución salina normal precalentada a 37 grados Celsius para mantener hidratados los embriones.

Mantenga el útero húmedo durante todo el procedimiento. Para inyectar el ADN, sostenga suavemente un embrión con una mano, de modo que la cabeza quede fácilmente accesible. Luego, utilizando la otra mano, inserte cuidadosamente una micropipeta de vidrio conectada a un microinyector en el ventrículo lateral izquierdo, que se encuentra a un milímetro de la línea media y a una profundidad de dos a tres milímetros.

Utilice el microinyector para inyectar aproximadamente un microlitro de ADN con verde rápido, lo que permite el monitoreo visual de la inyección. Para electroportar el ADN hacia las células, primero coloque solución salina normal sobre la superficie del electrodo de tres por siete milímetros. Luego, coloque el electrodo positivo en el lado inyectado y el electrodo negativo en el ventrículo derecho no inyectado.

Utilice el pedal controlado con el pie para entregar cinco pulsos eléctricos a intervalos de 950 milisegundos. Tras la electrotransferencia, devuelva el cuerno uterino a la cavidad abdominal y agregue solución salina estéril para permitir que los embriones se posicionen de manera más natural y para compensar la pérdida de líquido intraoperatoria. Cierre la pared muscular con suturas quirúrgicas absorbibles, luego la piel utilizando un punto simple interrumpido.

Proporcione analgesia posoperatoria durante un máximo de 48 horas o según lo indicado por las directrices institucionales. Devuelva la rata a su jaula limpia y monitoree hasta que salga de la anestesia. Después de fijar los cerebros en paraformaldehído al 4 % según se describe en la parte escrita del protocolo, lave con PBS durante 10 minutos.

Mientras se lava, prepare 50 mililitros de agar al 4 % en PBS asegurándose de que la temperatura del agarosa disuelto no supere los 50 grados Celsius. Vierta la agarosa en moldes de inclusión de plástico y luego coloque los cerebros en la agarosa. Coloque los cerebros incluidos a cuatro grados Celsius y deje que la agarosa se polimerice durante al menos una hora.

Después de que el agarosa se haya polimerizado, recorte el exceso de agarosa alrededor del cerebro y luego pegue el cerebro a la placa base del vibrátomo con el eje anterior-posterior del cerebro perpendicular a la hoja. Después de esperar unos minutos para que el pegamento se seque, coloque la placa con el cerebro pegado en la cámara del vibrátomo. Llene el vibrátomo con PBS e inicie el corte de secciones de 100 micrones de grosor.

Después del corte, transfiera las secciones a portaobjetos de microscopio y elimine el exceso de líquido. A continuación, agregue unas gotas de medio de montaje y coloque una cubreobjetos sobre las secciones. Deje secar durante la noche.

Obtenga imágenes de las secciones utilizando un aumento de 10x en un microscopio confocal de barrido láser. Para analizar las imágenes, primero convierta la imagen a 8 bits utilizando un software adecuado para análisis cuantitativo de imágenes. Luego, seleccione una célula fluorescente positiva para GFP representativa y defina manualmente su forma haciendo clic en estimar y utilizando la herramienta de selección a mano alzada para dibujar el borde de la célula.

El software retiene automáticamente el umbral de diámetro e intensidad de la célula. Haga clic en encontrar células para permitir que el software localice las células transfectadas en toda la corteza. Luego, si es necesario, elimine manualmente los falsos positivos.

Divida el grosor completo de la corteza en ocho áreas de interés, normalizadas en secciones individuales, haciendo clic en la herramienta de región, seleccionando ocho franjas regionales, donde las franjas uno y ocho corresponden a la zona ventricular y a la parte superior de la placa cortical, respectivamente. A continuación, haga clic en aplicar para permitir que el software cuente la posición relativa de las células transfectadas con GFP en toda la corteza. Finalmente, haga clic en guardar cuantificación para exportar los datos a un archivo de Excel para su análisis.

El CGH en matriz y la secuenciación del exoma completo identificaron a C6orf70 como un gen candidato para anormalidades en genes del desarrollo. La PCR cuantitativa determinó que este gen, junto con PHF10 y DLL1, se expresa en la corteza cerebral de rata. Las siguientes imágenes muestran secciones coronales representativas de la neocorteza de cerebros de rata E20, 5 días después de la electrotransferencia con un constructo de proteína verde fluorescente solo, o combinado con shRNA dirigido a la secuencia codificante de C6orf70 o con el constructo de desemparejamiento relativamente ineficaz.

Se utilizó la reducción del Filamento A como control de la migración neuronal afectada. La electrotransferencia intraútero con shRNA dirigido contra C6orf70 o el Filamento A indujo la detención de células positivas para GFP dentro de la zona ventricular, tal como indican las flechas blancas, mientras que las células que expresaban GFP solo, o en combinación con el constructo de desemparejamiento, no alteraron la migración neuronal. Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta qué etapa de la génesis cortical se desea analizar, ya sea la proliferación neuronal, la migración o la maduración.

No olvide que aprender a realizar la electroforesis intraútero en el cerebro embrionario de roedores requiere un largo período de entrenamiento, habilidades y práctica regular.