Una nueva estrategia Array-CGH, secuenciación del exoma todo y electroporación en el útero en roedores para identificar los Genes causales de las malformaciones del cerebro

El objetivo general de este procedimiento es identificar nuevos genes candidatos para los trastornos de malformación cerebral y confirmar directamente su papel causal in vivo. Esta estrategia puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología mediante el descubrimiento de vías moleculares asociadas con el desarrollo del cerebro y patologías correlacionadas. La principal ventaja de esta estrategia es que ayudará a descubrir nuevos genes asociados a trastornos cerebrales y a desarrollar nuevas herramientas diagnósticas.

Con este enfoque podríamos revelar la contribución crucial del gen C6orf70 en la patogénesis de la heterotopía nodular periventricular, una malformación cerebral causada por una migración neuronal anormal. Fabienne Schaller, ingeniera de nuestro laboratorio, demostrará el procedimiento. Prepare una rata preñada E15 para el procedimiento como se describe en el protocolo escrito y de acuerdo con las pautas institucionales y nacionales.

Asegúrese de que el animal esté debidamente anestesiado, que se aplique ungüento oftálmico en los ojos y que el abdomen esté debidamente afeitado y desinfectado. Después de usar tijeras afiladas para hacer una incisión vertical de dos centímetros en la piel y el músculo de la línea media del abdomen caudal, exponga cuidadosamente un cuerno uterino de la cavidad abdominal. Aplique una solución salina normal precalentada a 37 grados centígrados gota a gota para hidratar los embriones.

Mantenga el útero húmedo durante todo el procedimiento. Para inyectar ADN, sostenga suavemente un embrión en una mano con la cabeza fácilmente accesible. Luego, con la otra mano, inserte con cuidado un capilar de vidrio conectado a un microinyector en el ventrículo lateral izquierdo que se encuentra a un milímetro de la línea media y a una profundidad de dos a tres milímetros.

Utilice el microinyector para inyectar aproximadamente un microlitro de ADN con verde rápido para permitir el seguimiento visual de la inyección. Para electroporar el ADN en las células, primero se deja caer una solución salina normal sobre la superficie del electrodo de tres por siete milímetros. A continuación, coloque el electrodo positivo en el lado inyectado y el electrodo negativo en el ventrículo derecho no inyectado.

Utilice el pedal controlado por el pie para emitir cinco pulsos eléctricos a intervalos de 950 milisegundos. Después de la electroporación, regrese el cuerno uterino a la cavidad abdominal y agregue solución salina estéril para permitir que los embriones se posicionen de manera más natural y para tener en cuenta la pérdida de líquido intraoperatorio. Cierre la pared muscular con suturas quirúrgicas reabsorbibles, luego la piel con un simple punto interrumpido.

Proporcionar analgesia postoperatoria hasta por 48 horas o según lo indiquen las guías institucionales. Regrese a la rata a su jaula limpia y vigílela hasta que emerja de la anestesia. Después de fijar los cerebros en paraformaldehído al 4% como se describe en la parte escrita del protocolo, lávese en PBS durante 10 minutos.

Durante el lavado, prepare 50 mililitros de agar al 4% en PBS asegurándose de que la temperatura de la agarosa disuelta no supere los 50 grados centígrados. Vierta la agarosa en moldes de plástico para incrustar y luego coloque los sesos en la agarosa. Coloque los cerebros incrustados a cuatro grados centígrados y deje que la agarosa se polimerice durante al menos una hora.

Después de que la agarosa se haya polimerizado, recorte el exceso de agarosa de alrededor del cerebro, pegue el cerebro a la placa base del vibratomo con el acceso anteroposterior del cerebro perpendicular a la hoja. Después de esperar unos minutos a que se seque el pegamento, coloque la placa con el cerebro pegado en la cámara del vibráomo. Llene el vibratomo con PBS y comience a cortar secciones de 100 micras de grosor.

Después de seccionar, transfiera las secciones a portaobjetos de microscopio y elimine el exceso de líquido. A continuación, añada unas gotas de medio de montaje y coloque un cubreobjetos encima de las secciones. Deje secar durante la noche.

Obtenga imágenes de las secciones con un aumento de 10x en un microscopio confocal de barrido láser. Para analizar las imágenes, primero convierta la imagen en 8 bits utilizando el software adecuado para el análisis cuantitativo de imágenes. A continuación, seleccione una celda fluorescente positiva GFP representativa y defina manualmente su forma haciendo clic en estimar y utilizando la herramienta de selección a mano alzada para dibujar el borde de la celda.

El software retiene automáticamente el diámetro y el umbral de intensidad de la célula. Haga clic en buscar células para permitir que el software localice las células transfectadas en toda la corteza. A continuación, si es necesario, elimine manualmente los falsos positivos.

Divida todo el grosor de la corteza en ocho áreas de interés, normalizadas en secciones individuales, haciendo clic en la herramienta de región, seleccionando ocho franjas de región, donde las franjas uno y ocho corresponden a la zona ventricular y a la parte superior de la placa cortical respectivamente. A continuación, haga clic en aplicar para permitir que el software cuente la posición relativa de las células transfectadas con GFP en toda la corteza. Finalmente, haga clic en guardar cuantificación para exportar los datos en un archivo de Excel para su análisis.

La secuenciación de matrices CGH y del exoma completo identificó a C6orf70 como un gen candidato para anomalías genéticas del desarrollo. La PCR cuantitativa determinó que este gen, junto con PHF10 y DLL1, se expresan en la corteza cerebral de rata. Las siguientes imágenes muestran secciones coronales neocorticales representativas de cerebros de ratas E20 5 días después de la electroporación con una construcción de proteína fluorescente verde sola o combinada con shRNA dirigido a la secuencia codificante C6orf70 o con la construcción de desajuste relativamente ineficaz.

El filamento A knock down se utilizó como control de la migración neuronal alterada. La electroporación en el útero con shRNA dirigido al C6orf70 o al filamento A indujo la detención de las células GFP positivas dentro de la zona ventricular, como indican las flechas blancas, mientras que las células que expresan GFP solas, o en combinación con la construcción de desajuste, no alteraron la migración neuronal. Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta qué estado de la génesis cortical desea analizar, ya sea proliferación neuronal, migración o maduración.

No olvide que aprender a realizar la electroporación en el útero en el cerebro embrionario de roedores requiere un largo período de entrenamiento, habilidades y práctica regular.