Name: Cuantitativa del fondo de ojo autofluorescencia para la Evaluación de Enfermedades de la Retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Aprende a evaluar niveles de lipofuscina en el epitelio pigmentario retiniano mediante oftalmoscopía láser confocal de barrido. Esta técnica cuantitativa permite el seguimiento reproducible de la salud retiniana en pacientes con degeneración macular relacionada con la edad.

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Nos gustaría dar las gracias a nuestros colaboradores, Francois Delori, Tomas Burke, y Tobias Duncker. Apoyo a la Investigación: NIH / NEI R01 EY015520 (RTS, JPG), y los fondos de libre disposición de Investigación para prevenir la ceguera (RTB).

Ética Declaración: Todos los pacientes incluidos en estos estudios fueron realizados de acuerdo con lo que de revisión institucional aprobado supervisión de la junta de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva York. 1. Selección de pacientes y preparación inicial de la Imagen Nota: Se requieren los siguientes materiales: 0,5% solución oftálmica de tropicamida, 2,5% solución oftálmica fenilefrina, CSLO equipado con dominio espectral tomografía óptica de coherencia (SD-OCT) y la fluorescencia de referencia interna. <ol><li> Antes de la proyección de imagen, configurado de forma adecuada CSLO para la adquisición de datos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Montar una referencia fluorescente interna en el CSLO. Nota: La referencia fluorescente interna, tal como se adquirió desde el fabricante, se encuentra en un anillo de metal y se coloca directamente detrás de la lente de la cámara. Si se utiliza un CSLO de otro fabricante, puede haber una configuración diferente que la que se describe eneste protocolo. <ol><li> Con el fin de insertar la referencia en el CSLO, girar la lente para eliminarlo, desenroscar el anillo del metal de la máquina, y sustituirlo por el nuevo anillo de metal que contiene la referencia. Nota: la referencia fluorescente interna es esencial para la técnica qaf, ya que permite la corrección de la variación en la potencia del láser y el detector de sensibilidad / ganancia. </li></ol></li><li> Tienen los pacientes reclutados para la imagen se someten a un examen del ojo con dilatación de rutina y obtener información básica relativa a la historia ocular pasado y condiciones médicas subyacentes que pueden manifestarse con los hallazgos oculares. </li><li> Dilatar los alumnos con 0,5% de tropicamida y fenilefrina al 2,5%. Paso crítico: Dilatar alumnos de al menos 6 mm. Nota: Esto es esencial para el paso ininterrumpido de la luz, y por lo tanto para la visualización óptima y la medición del fondo de ojo. </li><li> Antes de las imágenes, la posición del paciente correctamente en el CSLO, con la barbilla apoyada en el soporte de la barbilla, la frente coloca contra la forehead resto, y cantos lateral correctamente alineados con los indicadores. </li></ol> 2. El nivel básico de imágenes de fondo de ojo <ol><li> En primer lugar, la imagen del fondo de ojo con la luz de reflectancia en el infrarrojo (IR) próximo (longitud de onda de 820 nm) con el fin de centralizar la cámara sobre la mácula y obtener el enfoque áspera. <ol><li> Con el paciente en la posición correcta, cambiar el ajuste de hardware en el panel de control para el modo de formación de imágenes de infrarrojos, cámara de posición manualmente hasta que el fondo está en el foco completo, y saque una foto </li><li> Ajustar las configuraciones en el panel de control en &quot;IR-OCT&quot;, que utiliza el dominio espectral tomografía de coherencia óptica (SD-OCT), en relación con las imágenes de infrarrojos para evaluar la mácula de la enfermedad subyacente. </li><li> Utilice las guías presentes en la ventana de imagen para orientar correctamente la OCT para la imagen IR del fondo de ojo. Para lograr una óptima calidad SD-OCT, coloque la cámara de tal manera que la imagen de OCT se encuentra en el tercio superior de la ventana de imagen. Adquirir por lo menos una línea horizontal scuna a través de la fóvea y que abarca todo el campo de la imagen. </li></ol></li></ol> 3. La creación de QAF Imaging <ol><li> Utilice la adquisición de imágenes &quot;alta velocidad&quot;. Nota: Esta configuración permite la adquisición de imágenes más rápido, lo que disminuye el riesgo de pérdida de señal debido al movimiento del paciente y la consiguiente obstrucción de la luz por el iris o los párpados. </li><li> Use &quot;La media de 9&quot; marcos. Nota: Esta configuración permite la captura rápida y secuencial de 9 cuadros de imagen, que pueden ser posteriormente &quot;promedio&quot; para reducir el ruido y los artefactos (véase más adelante). </li><li> Utilizar el campo &quot;30 x 30 grados&quot;. Nota: Esto se refiere a los grados de área de la retina capturado en la adquisición de imágenes. </li><li> Antes de las imágenes, que advertir al paciente acerca de la luz azul, ya que esto puede ser alarmante al principio. </li><li> Activar el modo AF y alinear eje de la cámara de tal manera que la pantalla es como máximo de &quot;lleno&quot; con FA fondo de ojo (oscurecimiento mínima de los lados y las esquinas de la imagen). <ol><li> Si los pacientes hAve dificultad para tolerar la luz azul brillante, comienzo de imágenes con la cámara más lejos del ojo y luego llevar la cámara lentamente hacia el paciente hasta que el fondo está a la vista. Paso crítico: si la luz que entra y sale del ojo está obstruido, disminución de la señal dará como resultado. disminución localizada es visible como el oscurecimiento asimétrica de un lado de la imagen o de la esquina. pérdida generalizada de la señal se ve cuando los movimientos oculares solo obstruyen el paso de la luz. </li></ol></li><li> Alinear la cámara de tal manera que la señal de AF está en su nivel más alto en todo el campo. Objetivo de señal máxima en vez de imagen más nítida, sin embargo, que más o menos se correlacionan. Ajuste el enfoque de la cámara moviendo el CSLO para volver a colocar la cámara de forma manual o con la palanca de mando oftalmoscopio. </li><li> Ajustar la sensibilidad / ganancia de tal manera que la FA fondo de ojo es fácilmente visible, pero evitar la sobre-saturación. Durante la adquisición de imágenes, los píxeles de colores visibles tanto en la referencia interna (situado en la parte superior de laimagen) o el fondo de ojo indican sobre-saturación y por lo tanto la pérdida de señal. </li></ol> 4. Adquisición de imágenes Nota: Paso crítico: El objetivo de la adquisición de imágenes debe ser de calidad para obtener 2 pilas de imágenes altas de 9 fotogramas por sesión para controlar la variabilidad entre las imágenes dentro de una sesión. Después de cambiar la posición del paciente y la cámara, obtener una segunda sesión de dos imágenes para la evaluación y el control de la variabilidad. Todas las imágenes en última instancia ser calibradas para la referencia interna (descrito a continuación). <ol><li> Adquirir imágenes sólo después de al menos 20 segundos de &quot;blanqueo&quot; (exposición total de la retina a la luz AF) para minimizar la absorción de la luz por la rodopsina en la retina sensorial 9. <ol><li> Usar este período para optimizar la alineación de la cámara, el enfoque y la sensibilidad. </li></ol></li><li> Tienen los sujetos parpadear antes de cada adquisición de imágenes como una película lagrimal fresca mejora la calidad de la señal. </li><li> Evitar los párpados en el plano de la adquisición. Nota: Puede ser útil manualmente los párpados abiertos para los pacientes más difíciles. Los autores recomiendan que un ayudante realiza esta tarea. </li><li> Optimizar la alineación antes de cada adquisición de imágenes para asegurarse de que la luz no es obstruida por el iris que resulta en una disminución de la señal. Nota: Como mínimo menor movimiento es muy común, los autores recomiendan fina reajuste según sea necesario antes de cada adquisición de imágenes. Orientar y animar al paciente mientras que las imágenes ayuda a movimiento de descenso. Los autores también recomiendan el uso de un pedal de la máquina como el botón &quot;adquisición&quot; con el fin de minimizar la distracción del operador. </li><li> Realizar el procesamiento posterior de las imágenes mediante el cálculo de la &quot;media&quot; de la pila 9-marco para aumentar la relación señal-ruido. Calcular la media de una pila utilizando el software CSLO mediante la selección de la opción para calcular la media. Nota: es posible que las pilas donde algunos cuadros no son de calidad óptima (es decir, han localizada o generalizada disminución de la ISgnal en relación con los marcos óptimas), por lo tanto, inspeccionar cuidadosamente cada pila y anular la selección de marcos subóptimas antes de cálculo de la media. Nota: Las imágenes de medias con proporciones aceptables de señal a ruido se pueden procesar de al menos 3 cuadros. Es normal que los lados y las esquinas de cada imagen tenga la señal más baja que los 20 grados centrales debido a las limitaciones dentro de la propia CSLO. <ol><li> Si el software pregunta si el operador quiere normalizar los niveles de gris (es decir, estirar el histograma) entre 0 y 255, seleccione &quot;No&quot;. Esto mantiene los niveles de gris inalterados para el análisis. </li></ol></li></ol> Análisis 5. Imagen <ol><li> Analizar las imágenes AF como se describió anteriormente usando el software de análisis de imagen desarrollado para la técnica de QAF (IGOR; 9). Una breve descripción de un análisis de imagen típico que utiliza este software se incluye a continuación. <ol><li> Cargar el programa en QAF IGOR e importar imágenes (en formato .bmp) exportados de lasoftware CSLO con relación de aspecto de píxeles de 768 x 768 (parámetro de salida por defecto). </li><li> Seleccione la imagen en el menú desplegable e iniciar el análisis. </li><li> Cambiar la posición de los indicadores de calibración en la imagen de tal manera que las &quot;punto de mira&quot; se superponen a la fóvea y el &quot;soporte&quot; se apoya en el disco óptico (estos indicadores se utilizan para escalar y posicionar las ROI). Cuando se coloca correctamente, el software utilizan peticiones a continuación, rellenar la imagen con regiones de interés circunferenciales en torno a la fóvea (véanse las figuras 1, 2). </li><li> Seleccionar la opción de IGOR para calibrar los niveles de gris globales de cada imagen para esos niveles presentes en la referencia fluorescente interna. Nota: Este paso permite la calibración de los factores relacionados con la máquina, incluyendo el nivel cero electrónico de cada imagen y el factor de calibración de referencia interna de cada máquina, así como los factores relacionados con el paciente, incluyendo la edad, la refracción y la curvatura corneal. Nota: El software de análisis a continuación, muestra el r fijoEGIONES en la imagen resultante y un valor qaf se demuestra dentro de cada región. qaf valores también se introducen automáticamente en un formato de hoja de cálculo en una ventana separada &quot;. </li><li> Generar qaf &quot;mapas de calor&quot; seleccionando la opción dentro de los símbolos del sistema. Todas las imágenes y los datos se pueden exportar desde el software IGOR en una hoja de cálculo de Excel mediante la selección de las opciones apropiadas. </li></ol></li></ol>

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</ol>

STA: sin divulgaciones, JPG: sin divulgaciones, RTS: consultor, Ocata Therapeutics.

distribución lipofuscina RPE anormal, si aumenta o disminuye, es un marcador sensible de la enfermedad de la retina y, en general se asocia con la pérdida de función de la retina sensorial. A continuación, describimos la aplicación de qaf para la evaluación de la lipofuscina RPE. La incorporación de una referencia interna fluorescente para corregir la sensibilidad variable la potencia del láser y el detector 9 junto con nuestra técnica de imagen estandarizada permite la cuantificación fiable de los niveles de...

El epitelio pigmentario de la retina (RPE) es compatible con la función de la retina sensorial a través de numerosos procesos 1. La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) es la causa más importante de ceguera intratable en los países industrializados y se caracteriza por los cambios en el EPR, incluyendo la pérdida de pigmento, pérdida de la función y la atrofia. En AMD y en el envejecimiento normal, el RPE se acumula orgánulos fluorescentes, lisosomas derivados que contienen fragmentos fotorreceptoras fagocitados, se hace referencia como gránulos de lipofuscina. La acumulación de lipofuscina RPE ha sido pensado para indicar la disfunción oxidativa 1, pero estudios recientes han demostrado que la morfología del EPR se mantiene normal en los ojos de edad con altos niveles de lipofuscina 2. Marcadores Sin embargo, los patrones anormales de distribución de lipofuscina, en particular, la pérdida de la lipofuscina, se documentan para AMD y progresión de la DMAE, tanto histológicamente y clínicamente 3,4 proces defectuososcante de la lipofuscina RPE también se ha demostrado que se producen en ciertas degeneraciones retinianas hereditarias. Los pacientes que sufren de la enfermedad de Stargardt (STGD) acumulan lipofuscina en el EPR a una edad temprana, con el tiempo el desarrollo de la pérdida de visión similar a la observada en la DMAE 5. Estos resultados sugirieron que la acumulación de lipofuscina puede ser en sí mismo tóxico y conducir RPE disfunción 6,7. Sin embargo, un estudio de imagen detallada de los sujetos con STGD con el tiempo no confirmó que la acumulación de lipofuscina focal condujo a la pérdida de RPE posterior 8. Por lo tanto, aunque las anomalías de lipofuscina son marcadores de degeneraciones de la retina, un papel para la toxicidad directa de lipofuscina no ha sido demostrado. El RPE es la capa más posterior de la célula de retina, pero genera la mayor parte de la señal fluorescente desde el fondo de ojo. Generación y detección de la autofluorescencia (AF) derivado de la RPE se pueden realizar usando la oftalmoscopia láser confocal de barrido (CSLO), que permite la visualization de la distribución espacial de AF fondo de ojo. Ciertas degeneraciones retinianas demuestran patrones distintivos de fondo de ojo AF, AF y ayudas de formación de imágenes en el diagnóstico y seguimiento de estas condiciones. Aunque las imágenes estándar de la FA es clínicamente importante, AF cuantitativa (QAF) se ha convertido en un medio importante para evaluar la salud del EPR. Nosotros y otros han desarrollado un método estándar que se pueden determinar de forma fiable los niveles qaf en lugares específicos de la retina 9. qaf tiene aplicaciones potenciales en el diagnóstico y seguimiento de las condiciones de la retina, y también puede tener utilidad en el pronóstico y estratificación del riesgo. Además, las capacidades de diagnóstico de qaf También se han descrito para ciertos trastornos de la retina 10-12. Aquí, proporcionamos datos por etapas para llevar a cabo nuestra técnica acompañada de una demostración visual de su aplicación en la evaluación de los ojos sanos y enfermos.

<table><tbody><tr><td>Spectralis HRA + OCT</td><td>Heidelberg Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr>Solución <td></td><td></td><td>oftálmica de tropicamida al 0,5%</td><td>Se puede utilizar cualquier marca</td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> oftálmica de fenilefrina al 2,5% <td>Se puede utilizar cualquier marca</td></tr><tr><td>Referencia fluorescente interna</td><td>Heidelberg Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software IGOR Pro</td><td>WaveMetrics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cuantitativa del fondo de ojo autofluorescencia para la evaluación de enfermedades de la retina

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) se yuxtapone a la retina sensorial suprayacente y apoya la función del sistema visual. Entre las tareas realizadas por el EPR se encuentran la fagocitosis y el procesamiento de segmentos externos de fotorreceptores a través de orgánulos derivados de lisosomas. Estos productos de degradación, almacenados y denominados gránulos de lipofuscina, están compuestos parcialmente por bisretinoides, que tienen amplios espectros de absorción y emisión de fluorescencia que pueden detectarse clínicamente como autofluorescencia del fondo de ojo con oftalmoscopia láser de barrido confocal (cSLO). La acumulación de lipofuscina se asocia con el aumento de la edad, pero también se encuentra en varios patrones tanto en enfermedades degenerativas adquiridas como hereditarias de la retina. Por lo tanto, el estudio de su patrón de acumulación y la correlación de dichos patrones con los cambios en la retina sensorial suprayacente son esenciales para comprender la fisiopatología y la progresión de la enfermedad de la retina. Aquí, describimos una técnica empleada por nuestro laboratorio y otros que utiliza cSLO para cuantificar el nivel de lipofuscina RPE en ojos sanos y enfermos.

Esta técnica se utilizó para estudiar qaf en ambos sanos 13 y estados de enfermedad 10-12. En ojos sanos (Figura 1), AF emitida desde el RPE se distribuye de forma relativamente uniforme a lo largo del fondo de ojo (Figura 1A). intensidad reducida se ve en la región macular central debido al bloqueo de la luz por el pigmento macular, y en los lados y las esquinas de la imagen debido a la óptica del ojo y la cámara. Los vasos se ven ...

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) apoya la retina sensorial a través del reciclaje de los subproductos del ciclo visual, que se acumulan como lipofuscina. Estos productos son autofluorescentes y pueden ser visualizados cualitativamente in vivo. Aquí, describimos un método para obtener imágenes cuantitativas de lipofuscina RPE mediante oftalmoscopia láser de barrido confocal.

Cuantitativa del fondo de ojo autofluorescencia para la Evaluación de Enfermedades de la Retina

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

El objetivo general de la autofluorescencia cuantitativa, o qAF, es evaluar el nivel total de lipofuscina en las células de soporte de la retina, el epitelio pigmentario de la retina, o RPE, en ojos sanos y enfermos. Esta técnica puede ayudar a responder preguntas clave en la biología celular de la retina, como cómo la salud del epitelio pigmentario de la retina interactúa con el desarrollo de la degeneración macular relacionada con la edad, o AMD. La principal ventaja de esta técnica es que permite la determinación de niveles absolutos de autofluorescencia de lipofuscina en el fondo ocular, y por lo tanto un seguimiento cuantitativo y reproducible entre pacientes, entre sesiones de imagenología de pacientes, y en grandes poblaciones de estudio.Antes de la adquisición de imágenes, configure adecuadamente la oftalmoscopia láser de barrido confocal, o CSLO, para la adquisición de datos según las instrucciones del fabricante. Para instalar una referencia fluorescente interna, que se adquiere del fabricante, gire el lente para retirarlo, desenrosque el anillo metálico de la máquina y reemplácelo con el nuevo anillo metálico que contiene la referencia. Es esencial que las pupilas estén dilatadas al menos 6 mm para permitir el paso ininterrumpido de la luz.Con tropicamida al 0,5 % y fenilefrina al 2,5 %, dilate las pupilas del paciente al menos 6 mm, lo cual es esencial para permitir el paso ininterrumpido de la luz con el fin de observar y medir el fondo del ojo. Coloque adecuadamente al paciente en el CSLO con la barbilla apoyada en el reposabarbillas, la frente contra el soporte frontal y los ángulos externos de los ojos alineados correctamente con los indicadores. Para obtener imágenes basales, primero capture el fondo del ojo mediante reflectancia en infrarrojo cercano, o luz IR, con el fin de centrar la cámara sobre la mácula y obtener un enfoque aproximado.Con el paciente correctamente posicionado, cambie la configuración del hardware en el panel de control al modo de imagenología IR, posicione manualmente la cámara hasta que el fondo del ojo esté completamente enfocado y tome una imagen. Ajuste la configuración en el panel de control a IROCT, que utiliza tomografía de coherencia óptica de dominio espectral, o SDOCT, junto con la imagenología IR, para evaluar la mácula en busca de enfermedades subyacentes. Utilice las guías presentes en la ventana de imagenología para orientar correctamente la OCT respecto a la imagen IR del fondo del ojo.Para lograr una calidad óptima de SDOCT, coloque la cámara de manera que la imagen OCT se encuentre en el tercio superior de su ventana de imagen. Adquiera al menos un corte transversal horizontal a través de la fóvea, abarcando todo el campo de imagen. Para configurar la imagen qAF, utilice la adquisición de imágenes de alta velocidad, lo cual disminuye el riesgo de pérdida de señal debido al movimiento del paciente y al bloqueo de la luz por el iris o los párpados.Utilice el promedio de 9 cuadros, que captura rápida y secuencialmente nueve cuadros de imagen que luego se promedian para reducir el ruido y los artefactos. Seleccione un campo de 30 x 30 grados, lo que se refiere a los grados del área retiniana capturada durante la adquisición de la imagen. Después de advertir al paciente sobre la luz azul, active el modo de autofluorescencia (AF) y alinee el eje de la cámara de manera que la pantalla se llene al máximo con la autofluorescencia del fondo de ojo, con oscurecimiento mínimo de los lados y las esquinas de la imagen.Si los pacientes tienen dificultad para tolerar la luz azul intensa, aleje la cámara del ojo para comenzar la adquisición de imágenes y acérquela lentamente al paciente hasta que el fondo del ojo esté completamente visible. Ya sea manualmente o con el joystick del oftalmoscopio, ajuste la alineación de la cámara moviendo el CSLO para reposicionarla de manera que la señal de AF alcance su nivel más alto en todo el campo, en lugar de obtener la imagen más nítida. Durante la adquisición de imágenes, la presencia de píxeles de color en la referencia interna o en el fondo del ojo indica saturación excesiva y, por tanto, pérdida de señal.Exponga completamente la retina a la luz AF durante al menos 20 segundos para minimizar la absorción de luz por la rodopsina en la retina sensorial durante la adquisición de imágenes. Utilice este período para optimizar el alineamiento, enfoque y sensibilidad de la cámara. Pida a los sujetos que parpadeen antes de cada adquisición de imagen, ya que una película lagrimal fresca mejora la calidad de la señal.Evite los párpados en el plano de adquisición y tome la imagen. Es importante generar al menos dos imágenes de alta calidad por sesión de adquisición para el análisis de datos. Realice el procesamiento posterior a la imagen utilizando el software CSLO para calcular la media de la pila de nueve cuadros, con el fin de aumentar la relación señal-ruido.Realice el análisis de la imagen según el protocolo descrito. Como se muestra aquí, en ojos sanos, la autofluorescencia emitida por el epitelio pigmentario de la retina se distribuye de manera relativamente uniforme en todo el fondo del ojo. Se observa una intensidad reducida en la región macular central debido a la absorción de luz por el pigmento macular, y en los lados y esquinas debido a la óptica del ojo y de la cámara.Los vasos deben ser oscuros y estar claramente enfocados. Esta figura representa una presentación correspondiente en mapa de calor de los niveles de qAF de esta figura. Los colores más fríos corresponden a áreas de menor intensidad de AF, mientras que los colores más cálidos corresponden a áreas de mayor intensidad de AF.La intensidad máxima generalmente se observa en el segundo anillo concéntrico de ocho segmentos, y las intensidades medias en esta área se utilizan para la mayoría del análisis de datos. Aquí se muestra un análisis representativo del ojo con DMAE, que demuestra atrofia geográfica, una forma avanzada de DMAE. Esta forma de DMAE provoca áreas localizadas de pérdida del epitelio pigmentario retiniano (EPR), evidenciada por una autofluorescencia marcadamente reducida o ausente, y causa una pérdida progresiva de la visión central.Al intentar este procedimiento, es importante recordar seleccionar cuidadosamente a los pacientes candidatos y obtener imágenes de alta calidad de forma reproducible para maximizar la calidad de los datos. El uso de este procedimiento permite el seguimiento longitudinal de la salud retiniana para determinar la progresión de las degeneraciones retinianas. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la oftalmología siguieran y analizaran las degeneraciones retinianas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la autofluorescencia cuantitativa para evaluar a sus pacientes con degeneraciones retinianas. Gracias por verlo y mucha suerte con sus experimentos.

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