Método de cuantificación del tumor bioluminiscencia-base para la progresión tumoral Monitoreo y efectos del tratamiento en modelos de ratón linfoma

El objetivo general de este procedimiento de imagen es estandarizar los procedimientos de adquisición de bioluminiscencia y los análisis de imágenes para obtener datos cuantitativos que permitan comparaciones dentro o entre diferentes experimentos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la imagen de bioluminiscencia, como, ¿cómo se pueden cuantificar los datos de imagen de manera reproducible? Las principales ventajas de esta técnica son que es fácil de implementar en cualquier instalación para animales que disponga de un equipo de imagen de bioluminiscencia, y que no requiere cálculos complejos.

Encienda el equipo de imagen y abra el software de adquisición. Haga clic en Inicializar para inicializar la cámara, las platinas y los objetivos. Después de confirmar el nivel adecuado de sedación mediante la ausencia de respuesta al pellizco en la pata, coloque un ratón sobre una almohadilla calefactora y aplique pomada ocular.

Luego, utilice una aguja de 25 gauge para inyectar 100 microlitros de solución recién preparada de sal potásica de D-Luciferina por vía intraperitoneal. En este caso, las células tumorales expresan luciferasa de luciérnaga. Esta proteína oxida la D-Luciferina y produce luz que puede detectarse con el equipo de imagen.

Después de 10 minutos, coloque el ratón en posición prona dentro del equipo de imagen, con la espalda orientada hacia la cámara y en una posición lo más plana posible. Seleccione la función de exposición automática y haga clic en Adquirir para obtener una imagen posterior del animal. Luego, coloque al ratón en posición supina, separando las extremidades anteriores para que no obstruyan el tórax.

Confirme que la casilla de exposición automática aún esté seleccionada y adquiera una imagen anterior del animal. Luego, regrese el ratón a la almohadilla calefactora hasta que se recupere por completo, momento en el cual el animal puede regresarse a su jaula. Para cuantificar la bioluminiscencia, haga clic en Ver en el menú y seleccione la Paleta de herramientas si aún no se muestra.

A continuación, haga clic en la pestaña de la herramienta de región de interés, elija el botón de contorno y seleccione Dibujo Libre. Utilizando la herramienta de Dibujo Libre, siga los bordes del ratón completo o de un área específica en la imagen de vista frontal para marcar la región de interés, haciendo clic con el botón derecho para cerrar el contorno. Seleccione Radiancia en el menú desplegable de Unidades en la parte superior izquierda de la imagen si aún no está seleccionada.

A continuación, lea el valor en el cuadro Flujo total de fotones por segundo para medir el flujo de fotones. Luego, haga clic en el menú Ver y en las mediciones de la región de interés. Después de repetir el análisis para la imagen de la vista posterior, sume los valores de flujo de fotones obtenidos para ambas vistas para obtener el luminoscore.

En este experimento, el tumor fue detectable tan pronto como 10 minutos después de la inyección. Las imágenes por sí solas verifican que las células tumorales están presentes en la ubicación correcta. Sin embargo, la cuantificación de la bioluminiscencia demostró una diferencia clara entre los animales que recibieron inyecciones y los que no.

Curiosamente, la señal obtenida en el modelo subcutáneo fue 100 veces mayor que en el modelo de linfoma intraocular primario, lo cual es consistente con el número de células inyectadas. Aquí, imágenes representativas del crecimiento tumoral en ratones con linfoma intraocular primario, de control y tratados con CpG, demuestran que, tras un periodo suficiente, comienzan a aparecer metástasis en el grupo control. Aunque el tumor primario no pareció ser sensible al tratamiento, se observaron menos metástasis en el grupo tratado con CpG.

De hecho, el análisis cuantitativo de la carga tumoral en cada grupo demuestra que el CpG ralentiza el desarrollo del tumor, produciendo una diferencia estadísticamente significativa en la luminiscencia tumoral entre los grupos tratado y control después de 28 días. En este modelo subcutáneo, se injertaron dos tumores en cada lado del ratón, administrándose el tratamiento in situ en un solo lado el día cero y utilizando el tumor contralateral como control. Luego se definieron dos regiones de interés por ratón, y se midió la relación entre las puntuaciones de luminiscencia en los lados tratado y control.

13 días después de la administración del tratamiento, se observó una disminución significativa en la relación del luminoscore, lo que revela que el tumor tratado ha sido reabsorbido, como queda demostrado adicionalmente por las imágenes de bioluminiscencia correspondientes. Una vez administrado, este análisis puede completarse en dos minutos por animal si se realiza adecuadamente. Tras seguir este procedimiento, se puede realizar otro método, como la localización cualitativa del sitio tumoral, para responder preguntas adicionales sobre los mecanismos de homing celular o de metástasis.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores y el campo de la imagenología de bioluminiscencia exploraran la progresión tumoral en modelos preclínicos de pequeños animales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la imagenología de bioluminiscencia para cuantificar la carga tumoral de manera reproducible. No olvide que trabajar con pequeños animales e instrumentos quirúrgicos puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones, como la esterilización adecuada de los instrumentos, al realizar este procedimiento.