Name: Ex Vivo Optogenética Disección de circuitos del miedo en rodajas de cerebro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprende optogenética ex vivo para estudiar propiedades sinápticas de proyecciones neuronales en circuitos del miedo usando rodajas de cerebro. Este método permite analizar conectividad local y de largo alcance con precisión.

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Agradecemos a Cora Hübner y Andrea Gall por su ayuda en la adquisición de algunos de los resultados representativos. Este trabajo ha contado con el apoyo del Centro Werner Reichardt de Neurociencia Integrativa (CIN) de la Universidad de Tubinga, una Iniciativa de Excelencia financiada por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) en el marco de la Iniciativa de Excelencia (EXC 307), y por fondos de la Fundación Benéfica Hertie.

declaración de la ética: Todos los procedimientos experimentales fueron de acuerdo con la directiva de la UE sobre el uso de animales en la investigación y fueron aprobados por el Cuidado de Animales local y el empleo Comisión (Regierungspräsidium Tübingen, estado de Baden-Württemberg, Alemania) responsable de la Universidad de Tübingen. 1. Procedimiento de inyección estereotáctica <ol><li> Preparar herramientas estériles (tijeras, bisturí, pinzas, taladros, agujas, material de sutura) utilizando un esterilizador. Organizar herramientas estériles y otras soluciones necesarias y suministros quirúrgicos como el canje de algodón estéril, desinfectante, solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS, pH 7,4), y H 2 O 2 en un paño quirúrgico estéril. </li><li> Tire micropipetas de vidrio para inyecciones (Figura 1A, inserción) utilizando un 3 mm de ancho filamento caja en un microelectrodo horizontal extractor de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Nota: Para las inyecciones profundas, la forma cónica del electrodo debe ser lo suficientementelargo para llegar a la mayoría de las ventrales coordenadas (aproximadamente 5 mm;. para las coordenadas, véase 1.10). </li><li> Premezcla 1 l de solución de virus y 0,2 l de solución de verde rápido 0,1% en PBS estéril (para una mejor visibilidad de la solución en la pipeta de vidrio). Llenar pipetas de vidrio con mezcla de solución de virus y verde rápido usando una pipeta de microlitro con una punta fina (Figura 1A, recuadro). Nota: El trabajo con vectores virales adeno-asociados recombinantes (rAAV) se considera nivel de bioseguridad 1 (BSL 1) de trabajo y debe ser realizado en un laboratorio BSL 1. rAAVs utilizados en este estudio (Figura 1C) fueron: 1) mPFC: rAAV-hsyn-ChR2 (H134R) -eYFP (serotipo 2/9) 16; 2) MGM / PIN: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (serotipo 2/9) 23; 3) mpITC / BLA: rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R)-YFP (serotipo 2/1) 23 </li><li> Anestesiar a un ratón utilizando una pequeña máquina de anestesia para animales (isoflurano: 3% de oxígeno para la inducción). Nota: Los ratones utilizados en este estudio fueron 4 -7 semanas de edad y de las siguientes cepas y genotipos: tipo salvaje C57Bl6 / J (experimento en las figuras 2A y 3A-D); GAD67-GFP 24 (experimento en las Figuras 2B y 3E-H); Tac2 Cre-25 (experimento en las figuras 2C y 3I-J). </li><li> Afeitarse la cabeza entre las orejas y los ojos. Aplicar desinfectante (de povidona-iodo basada) a la cabeza afeitada usando hisopos de algodón. </li><li> Aplique un ungüento para los ojos para evitar el secado de los ojos durante la anestesia. Por vía subcutánea inyectar ratón con analgésicos (, solución basada en meloxicam 0,1 ml de 5 mg / ml). </li><li> Coloque el ratón en el marco estereotáxico (Figura 1A) y mantener la anestesia a través de una máscara de anestesia de gas (isoflurano: 2% en oxígeno para el mantenimiento). Comprobar la profundidad de anestesia utilizando reflejo de retirada del miembro antes de continuar. Nota: Mantener condiciones estériles, así como sea posible durante todo el procedimiento quirúrgico; llevar mascarilla desechable, ir quirúrgicawn y guantes. </li><li> Hacer incisión en la piel en la parte superior de la cabeza con unas tijeras. Tire con cuidado de la piel a un lado el uso de fórceps romos, fijar con abrazaderas para exponer la superficie del cráneo, y el cráneo limpio con H 2 O 2. </li><li> Marcar los puntos de inyección en el cráneo utilizando un fino agujeros de perforación y marcadores permanentes de punta para ambos hemisferios (Figura 1B). Coordenadas para inyecciones en este estudio son (de bregma (mm)): mPFC: 1.9 anterior, lateral ± 0,3, 2,1 ventral; MGM / PIN: 3.0 posterior, lateral ± 1,8, 3,8 ventral; mpITC / BLA: 1,45 posterior, lateral ± 3,35, y 4,75 ventral. </li><li> Montar la pipeta de vidrio lleno en marco estereotáctico conectado a un dispositivo de inyección a presión y llevar la pipeta a la posición Bregma. </li><li> Rompa la punta de la pipeta de vidrio usando pinzas finas recta de punta. Haga esto con cuidado para evitar la formación de aerosoles de solución de virus. Asegúrese de que la punta de la pipeta es abierta mediante la aplicación de un par de pulsos de presión y la observación de extrusión de gotas de virusolución de s. </li><li> Ir a las coordenadas deseadas de inyección e inyectar la mitad del contenido de la pipeta (~ 0,5 l) usando los siguientes ajustes en el dispositivo de inyección a presión: Presión: 20 psi, la duración del pulso promedio: 30 ms, número medio de pulsos: 50. </li><li> Deja pipeta en el lugar durante ~ 1 min antes lentamente (1 mm / min) retraer él. Nota: Asegúrese de que la pipeta no está bloqueado antes de repetir el procedimiento con la misma pipeta en otro hemisferio. En el caso de la punta bloqueado, limpie o romper la punta y la posición de la pipeta cero al bregma nuevo. </li><li> cráneo limpia con PBS (pH 7,4), quitar las abrazaderas, tire suavemente de la piel juntos, y suturar la incisión con suturas botón individual (3 - 4 nudos). Aplicar desinfectante (de povidona-iodo basados) alrededor de la herida. </li><li> Detener la anestesia y no deje desatendida del ratón hasta que esté completamente despierto. Mantenga alojamiento individual o volver a la compañía de otros animales sólo cuando se recuperó por completo. Después de la operación, seguirá de cerca el estado de salud, y administer analgésico si es necesario. Siga los procedimientos de acuerdo a las normas formuladas por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo local. </li></ol> 2. Preparación de cortes agudos <ol><li> Preparar ACSF, solución de corte, herramientas (tijeras, bisturí, pinzas, espátula, pipeta Pasteur) y bloques de agar. Nota: 1 L de artificial de fluido cerebro-espinal (ACSF) se requiere por experimento, y se prepara mediante la disolución de los productos químicos en H bidestilada 2 O como publicó anteriormente 16,23. Solución de corte se prepara completándolo 200 ml de ACSF con 0,87 ml de H MgSO4 solución madre 2. </li><li> ACSF oxigenar y solución de corte durante todo el experimento con un 95% de O2 y 5% de CO2. </li><li> Profundamente anestesiar ratón usando una pequeña máquina de anestesia en animales utilizando isoflurano (3% en oxígeno). Comprobar la profundidad de anestesia utilizando reflejo de retirada del miembro antes de continuar. </li><li> Decapitar ratón usando tijeras grandes y desconectar inmediatamentela cabeza de corte en una solución enfriada con hielo. </li><li> cráneo abierto por una sola incisión en la línea media del caudal a rostral y empuje suavemente trozos de cráneo a los lados con unas pinzas. Eliminar rápidamente el cerebro levantando suavemente hacia afuera del cráneo usando una pequeña espátula redondeada. Cortar el cerebelo con el escalpelo. Coloque cerebro en solución de corte enfriado con hielo. </li><li> Para los sitios de inyección mPFC: cortar parte anterior del cerebro (que contiene el córtex prefrontal medial) utilizando un bisturí y poner en solución de corte en frío con hielo hasta el corte. </li><li> Retire el exceso de solución de corte con un papel de filtro y la cola de la parte posterior del cerebro en el escenario vibratome. </li><li> Para rebanadas amígdala inclinados, pegar el cerebro en un bloque de agar (4%) de corte en un ángulo de 35 ° (Figura 1D, medio). Para rebanadas coronales amígdala, sitios de inyección de MGM / PIN y sitios de inyección mPFC, pegar el cerebro directamente en el escenario (Figura 1D, izquierda y derecha). Colocar un bloque de agar adicional detrás del cerebro para la estabilidad, mientras que rebanar. </li><li> Place etapa en la cámara de corte con solución de corte oxigenada enfriada en hielo que se mantiene a 4 ° C utilizando una unidad de refrigeración. Preparar rodajas agudas de la amígdala (320 micras) con una cuchilla de zafiro. Coloque las rebanadas en una cámara de interfaz suministrado con ACSF oxigenada a temperatura ambiente. </li><li> Después de la preparación de las rebanadas de la amígdala agudas, coloque la cámara de interfaz en un baño de agua a 36 ° C para recuperar las rebanadas de 35 - 45 min. Posteriormente, el retorno de la cámara de interfaz a RT. Para la grabación de estos cortes, continúe con el paso 3.2. </li><li> Durante el inicio de la etapa 2.10, cortar rodajas de los sitios de inyección como se ha descrito antes para los sectores de la amígdala agudas (pasos 2.8 a 2.9). No se requiere la recuperación de las rebanadas en el baño de agua aquí. Opcional: Para estimar rápidamente la ubicación del sitio de la inyección, observe las rebanadas en un estereoscopio equipado con una lámpara fluorescente y juego de filtros adecuados. </li><li> Fijar las rebanadas contienen sitios de inyección para el análisis post-hoc intercalando ellos entre dos papeles de filtro y submerging en 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS solución de O / N. Para el análisis de los sitios de inyección de proceder con el paso 4.1. </li></ol> 3. Visualización y estimulación de fibras presinápticas <ol><li> Preparar microscopio parche para la activación optogenético de fibras y células: <ol><li> Centre el diodo emisor de luz montada (LED) en la vía de suministro de luz. </li><li> Medir la intensidad de la luz LED en el plano focal posterior y en la salida de cada objetivo con un medidor de potencia de la elección de la longitud de onda apropiada de 470 nm. </li><li> Calcular la intensidad de la luz en mW / mm 2 y crear una curva de calibración (intensidad del LED (%) frente a la salida de luz (mW / mm 2)) para cada objetivo para los valores medidos para 470 nm longitud de onda. </li></ol></li><li> Recuperar una rebanada amígdala aguda de la cámara de interfaz y lugar en la cámara de corte montado en el microscopio vertical equipado con una lámpara fluorescente. Tenga cuidado de colocar el trozo de tal manera que el SLICe superficie que mira hacia arriba en la cámara de interfaz también se coloca hacia arriba en la cámara de grabación. Perfundir rebanada con ASCF fresca, oxigenada, a razón de 1-2 ml / min a una temperatura de ~ 31 ° C. </li><li> Observe fibras presinápticas en el corte utilizando la lámpara fluorescente en combinación con los conjuntos de filtro para la proteína fluorescente específico expresado. Utilice objetivo 5x para obtener una visión general (Figura 1E), y 60x objetivo para la evaluación de la densidad de las fibras dentro del área objetivo. Nota: Para GFP y YFP, el uso conjunto de filtros &quot;verde&quot; (excitación 472/20, Divisor de rayos 495, 490 Emisión LP) para mCherry uso conjunto de filtros &quot;rojo&quot; (excitación 560/40, Divisor de rayos 585, emisión 630/70) como se especifica en la tabla de materiales / equipos. </li><li> Abra o restringir la abertura en la vía de luz del microscopio como se desee para el experimento (Figura 2D). </li><li> Para obtener una grabación de parches, llenar un parche pipeta con solución interna y Mount In soporte del electrodo. Aplicar presión positiva a la pipeta de parche y baje lentamente que por primera vez en la solución del baño y luego bajo control visual en el sector mediante el micromanipulador. <ol><li> Acercarse a la neurona de interés con la pipeta parche desde el lado y la parte superior. Liberar la presión positiva cuando la pipeta está en la superficie de la célula (hoyuelo visible en la superficie celular) y obtener una &quot;gigaseal&quot; mediante la aplicación de presión negativa. </li><li> Aplicar más de succión para romper el parche de membrana para obtener células enteras de grabación. Posteriormente, estimular fibras marcadas con el LED conectado con la longitud de onda apropiada para la activación de Chr (470 nm) durante la grabación de las respuestas eléctricas de la célula. </li><li> Para la estimulación sináptica comenzar con una baja intensidad de LED y aumentar hasta que se alcanza la amplitud de la corriente sináptica deseada. Disparar el LED mediante la configuración de las salidas digitales en el software de adquisición de datos para controlar el tiempo y el pulso largo (ejemplos de la figura3). Nota: otro software y / o generadoras de TTL dispositivos se pueden utilizar para desencadenar LED. </li></ol></li><li> Repita la estimulación con la abertura abierta o restringida (etapa 3.4) en la vía de luz del microscopio como se desee para la próxima célula registrada y / o en presencia de fármacos específicos. </li><li> Después de grabar, arreglar las rebanadas para el análisis post-hoc intercalando ellos entre dos papeles de filtro y sumergiéndolas en el 4% PFA O / N. </li><li> Analizar datos electrofisiológicos. Nota: El uso de software adecuado para visualizar los datos de barrido registrados para cada línea estimulación individual. Al analizar los efectos de las drogas, usar rutinas de detección de picos para obtener curso temporal del efecto del fármaco sobre amplitudes de corriente sinápticas para todos los barridos individuales. Determinar cuando el efecto del fármaco alcanza el estado de equilibrio. Para preparar las respuestas medios representativos de las cifras, utilizar el software en un promedio de ≥10 barridos individuales por condición experimental (véase la figura 3B-D, FH, J panel derecho). Nota: varios paquetes de software alternativos pueden ser utilizados para el análisis de datos. </li></ol> 4. Análisis post-hoc de los puntos de inyección <ol><li> Lavar rebanadas de sitios de inyección (de la etapa 2.12) y el registro de los sitios (si se desea la re-formación de imágenes, de la etapa 3.7) tres veces en PBS. Esto se hace mediante la sustitución de varias veces la solución con PBS fresco en un agitador giratorio tres veces durante 10 min. </li><li> Preparar solución al 2% de agar-agar en PBS, y dejar que se enfríe a ~ 65 ° C. Coloque las rebanadas planas en la parte inferior de una pequeña placa de Petri de 30 mm de diámetro, incrustar en rodajas agar-agar y dejar enfriar hasta que solidifique. </li><li> Pegar un bloque de agar con el sector o sectores incorporado a la etapa de un vibratome y colocar etapa en la cámara de corte con PBS. </li><li> Resección rebanadas a 70 micras de espesor incrustado. Opcional: Después de la resección, las rebanadas se pueden teñir, es decir, con NeuroTrace para revelar citoarquitectura (Figura 3A, C), y / o btinción de inmunofluorescencia y de YFP o mCherry para aumentar la señal de la proteína de fusión Chr. </li><li> rebanadas de montaje en portaobjetos y cubreobjetos con medio de montaje. Sitios de inyección de la imagen y, si se desea, también cortes de imagen que contienen fibras en las áreas de proyección utilizando un microscopio de fluorescencia o un microscopio confocal de escaneo láser (Figura 2A-C). </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Este protocolo describe un método para la ex vivo investigación optogenético de los circuitos neuronales y la conectividad local que se pueden implementar fácilmente en la mayoría, si no todas, las verticales rebanada de grabación de patch-clamp configuraciones, equipándolos con un ~ 470 nm LED en el puerto de luz de epifluorescencia. Una ventaja importante de la estimulación optogenética de proyecciones axonales en rebanadas es que permite la activación y la investigación de las propiedades de las conexiones q...

herramientas precisas para la visualización y la activación simultánea de conexiones específicas entre las áreas del cerebro y los tipos específicos de neuronas son cada vez más importante en la comprensión de la conectividad funcional subyacentes de la función cerebral y la enfermedad estados sanos. Idealmente, esto implica la investigación de las propiedades fisiológicas precisas sinápticas con la que se comunican las neuronas identificadas. Esto es particularmente cierto para las conexiones entre las áreas del cerebro que no pueden ser preservados en una sola rebanada cerebral agudo. En el pasado, esto se ha conseguido en gran parte en experimentos separados. Por un lado, los trazadores inyectados neuronales in vivo se han empleado en combinación con la luz posterior o el análisis con microscopio electrónico de socios de pre y postsinápticos. Por otro lado, cuando tractos de fibras de la región de origen se conservan y accesible en la preparación rebanada, la estimulación eléctrica se ha utilizado para evaluar los mecanismos de comunicación sinápticas con las células en la región de destino. Con el advenimiento de la optogenética, la expresión selectiva de cationes-canales de luz-gated, como Channelrhodopsins (CHRS) fusionado a las proteínas fluorescentes, ahora permite la activación de las neuronas y sus trayectorias axonales permitiendo al mismo tiempo su visualización y post-hoc análisis anatómico 1- 4. Debido a que los axones CHR-expresan pueden ser estimulados incluso cuando separado de somata matriz 5, es posible en rodajas de cerebro a: 1) evaluar las aportaciones de las regiones del cerebro que no eran accesibles con la estimulación eléctrica convencional, ya tractos de fibras no son separables o la trayectoria específica no se sabe; 2) identificar inequívocamente la región de origen de los insumos específicos que fueron postuladas pero no del todo comprendidas; y 3) investigar la conectividad funcional entre los tipos de células definidos, tanto a nivel local y en las proyecciones de largo alcance. Debido a una serie de ventajas, este mapeo optogenético de circuitos en cortes de cerebro se ha convertido en ampliaLy utilizado en los últimos años, y una variedad de vectores virales para la expresión de CHRS fluorescentemente etiquetado están fácilmente disponibles de proveedores comerciales. Algunas de las ventajas clave de activación optogenético sobre la estimulación eléctrica convencional hay daño al tejido debido a la colocación de electrodos de estimulación, la especificidad de la estimulación de la fibra debido a la estimulación eléctrica también puede reclutar fibras de paso o de otras células cercanas, y una estimulación igualmente rápida y temporalmente precisa. Además, la inyección estereotáxica de vectores virales fácilmente puede dirigirse a áreas específicas del cerebro 6 y expresión específica condicional o de tipo celular se puede lograr utilizando la expresión de Cre-dependiente y / o promotores específicos 7. A continuación, se aplica esta técnica para el mapeo de largo alcance y los circuitos locales en el sistema del miedo. La amígdala es una región clave para la adquisición y expresión de miedo, y el almacenamiento de miedo y recuerdos emocionales 8,9. Aparte lado a otrom la amígdala, la corteza prefrontal medial (córtex prefrontal medial) y el hipocampo (HC), estructuras que están conectados recíprocamente a la amígdala, están implicados en los aspectos de la adquisición, consolidación y recuperación de miedo y extinción de recuerdos 10,11. Actividad en las subdivisiones de la mPFC parece desempeñar un doble papel en el control tanto de alta como de baja temor estados 12,13. Esto podría ser debido en parte mediado por conexiones directas desde el córtex prefrontal medial a la amígdala que controlaría la actividad de la amígdala y de salida. Por lo tanto, en los últimos años, varios estudios comenzaron en experimentos ex vivo rebanada para investigar las interacciones sinápticas entre los aferentes mPFC y células diana específicas en la amígdala 14-17. Durante el aprendizaje miedo, la información sensorial sobre los estímulos condicionado e incondicionado alcanza la amígdala a través de las proyecciones de las regiones talámicas y corticales específicas. La plasticidad de estas entradas de las neuronas en la parte lateral (LA) del Basolamígdala ateral (BLA) es un importante mecanismo que subyace en el condicionamiento del miedo 9,18. La evidencia creciente sugiere que los procesos paralelos de plástico en la amígdala implican elementos inhibidores para controlar la memoria del miedo 19. Un grupo de neuronas inhibidoras agrupados son los paracapsular intercalado células mediales GABAérgicas (mpITCs), pero su conectividad y función precisa se ​​entiende de manera incompleta 20-22. Aquí, la cartografía circuito optogenético se utiliza para evaluar la conectividad aferentes y eferentes de estas células y su impacto en las neuronas diana en la amígdala, lo que demuestra que mpITCs reciben información sensorial directa de estaciones de relevo talámicas y corticales 23. La expresión específica de la CDH en mpITCs o neuronas BLA permite representar las interacciones locales, revelando que mpITCs inhiben, sino que también están mutuamente activa, BLA neuronas principales, colocándolos en nuevos circuitos inhibitorios de alimentación directa y retroalimentación que controlan eficazmente la actividad BLA23.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Surgery</td></tr><tr><td>Stereotactic frame</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>puede ser reemplazado por otro marco estereotáctico para ratones</td></tr><tr><td>Steretoxic frame</td><td>adaptador de ratón Stoelting, USA</td><td>51625</td><td>puede ser reemplazado por otro marco estereotáctico para ratones</td></tr><tr><td>Máscara de anestesia de gas para ratones</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>ya no está disponible, reemplazado por el artículo no. 51609M</td></tr><tr><td>Dispositivo de inyección a presión, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, EE. UU.</td><td>T25-2-900</td><td>se pueden utilizar otros dispositivos de inyección a presión (por ejemplo, Picospritzer)</td></tr><tr><td>Kwik Fill capilares de vidrio</td><td>World Precision Instruments, Alemania</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de anestesia, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Alemania</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura de CC y almohadilla térmica</td><td>FHC, EE. UU.</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas horizontales modelo P-1000</td><td>Sutter Instruments, EE. UU.</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de herramientas quirúrgicas, Esterilizador 75</td><td>Melag, Alemania</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotipo 2/9)</td><td>Penn Vector Core, EE. UU</td>. <td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotipo 2/9)&nbsp;</td><td>Penn Vector Core, EE. UU.</td><td>AV-9-20938M</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotipo 2/1)&nbsp;</td><td>Penn Vector Core, EE. UU.</td><td>AV-1-20298P</td><td></td></tr><tr><td>fast green</td><td>Roth, Alemania</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>Anestésico de isoflurano, Isofurano CP (1 ml/ml)</td><td>CP Pharma, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiséptico, Betadine (providona-yodo)</td><td>Productos de purdura, EE. UU</td>. <td>BSOL32</td><td>puede ser reemplazado por otro</td></tr><tr><td>analgésico desinfectante, Metacam Solución (5 mg/ml meloxicam)</td><td>Boehringer Ingelheim, Alemania</td><td></td><td>puede ser reemplazado por otros analgésicos</td></tr><tr><td>Bepanthen ungüento para los ojos</td><td>Bayer, Alemania</td><td>0191</td><td>puede ser reemplazado por otro ungüento para los ojos</td></tr><tr><td>Taladro NM3000 (SNKG1341 y SNIH1681)</td><td>Nouvag, Suiza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox Aguja de sutura</td><td>Herramientas de ciencia fina, Alemania</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de seda trenzada</td><td>Herramientas de ciencia fina, Alemania</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Grabaciones, estimulación lumínica y análisis</líquido cefalorraquídeo artificial fuerte/fuerte></td></tr><tr><td>para</td> <td>la composición ver referencias #16 y #23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>soluciones de parche interno</td><td>para la composición ver referencias #16 y #23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagnesioSulfato Heptahidrato</td><td>Roth, Alemania</td><td>P027.1</td><td>preparar una solución madre de 2M en </td></tr><tr><td>cortadora de agua, Microm HM650V</td><td>Fisher Scientific, Alemania</td><td>920120</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de enfriamiento para cortadora de tejidos, CU65</td><td>Fisher Scientific, Alemania</td><td>770180</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de zafiro</td><td>Delaware Diamond Knives</td><td></td><td>pedido personalizado, consulte con la empresa</td></tr><tr><td>Estereoscopio, SZX2-RFA16</td><td>Olympus, Japón</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lámpara fluorescente Xcite (XI120Q-1492)</td><td>Lumen Dynamics Group, Canadá</td><td>2012-12699</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de parche, BX51WI</td><td>Olympus, Japón</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de parche Multiclamp 700B&nbsp;</td><td>Molecular Devices, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitdata 1440A</td><td>Molecular Devices, EE. UU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>. Software PClamp, versión 10</td><td>Molecular Devices, EE. UU</td><td></td>. <td>utilizado para controlar la adquisición de datos y la estimulación</td></tr><tr><td>Control de temperatura del baño, TC05</td><td>Luigs & Neumann, Alemania</td><td>200-100 500 0145</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador de tres ejes Mini 25</td><td>Luigs & Neumann, Alemania</td><td>210-100 000 0010</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de micromanipulador SM7</td><td>Luigs & Neumann, Alemania</td><td>200-100 900 7311</td><td></td></tr><tr><td>capilares de vidrio para pipetas de parche</td><td>World Precision Instruments, Alemania</td><td>GB150F-8P Papel</td><td></td></tr><tr><td>de filtro de nitrato de celulosa para cámara de interfaz&nbsp;</td><td>Satorius Stedim Biotech, Alemania</td><td>13006--50----ACN</td><td></td></tr><tr><td>Unidad LED, CoolLED pE</td><td>CoolLED, Reino Unido</td><td>244-1400</td><td>CoolLED o USL 70/470 y los adaptadores apropiados son dos opciones alternativas para la estimulación LED</td></tr><tr><td>CoolLED 100 Dual Adapt</td><td>CoolLED, UK</td><td>pE-ADAPTOR-50E</td><td>CoolLED o USL 70/470 y los adaptadores apropiados son dos opciones alternativas para la estimulación LED</td></tr><tr><td>Unidad LED, USL 70/470</td><td>Rapp La optoelectrónica</td><td>L70-000</td><td>CoolLED o USL 70/470 y los adaptadores adecuados son dos opciones alternativas para la estimulación LED</td></tr><tr><td>El adaptador de doble puerto</td><td>Rapp Optoelectronic</td><td>consulte con la empresa</td><td>CoolLED o USL 70/470 y los adaptadores adecuados son dos opciones alternativas para la estimulación LED</td></tr><tr><td>Juego de filtros rojo (excitación)</td><td>AHF, Alemania</td><td>F49-560</td><td>Los filtros se pueden comprar como juego F46-008</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (divisor de haz)</td><td>AHF, Alemania</td><td>F48-585</td><td>Los filtros se pueden comprar como conjunto F46-008</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (emisión)</td><td>AHF, Alemania</td><td>F47-630</td><td>Los filtros se pueden comprar como juego F46-008</td></tr><tr><td>Juego de filtros verde (excitación)</td><td>AHF, Alemania</td><td>F39-472</td><td>Alternativas: juego de filtros F36-149 o F46-002 (con emisión de paso de banda)</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (divisor de haz)</td><td>AHF, Alemania</td><td>F43-495W</td><td>Alternativas: conjunto de filtros F36-149 o F46-002 (con emisión de paso de banda)</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (emisión)</td><td>AHF, Alemania</td><td>F76-490</td><td>Alternativas: conjunto de filtros F36-149 o F46-002 (con emisión de paso de banda)</td></tr><tr><td>LaserCheck, medidor de potencia portátil</td><td>Coherent, EE. UU</td>. <td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>IgorPro Software, versión 6</td><td>Wavemetrics, EE. UU</td><td></td><td>. para el análisis de datos de electrofisiología, también se pueden utilizar otros paquetes de software alternativos...</td></tr><tr><td>Conjunto de macros Neuromatic para IgorPro</td><td>http://www.neuromatic.thinkrandom.com</td><td></td><td>para el análisis de datos de electrofisiología, también se pueden utilizar otros paquetes de software alternativos...</td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>Análisis post hoc de inyecciones y proyecciones</polvo</td></tr> <tr><td>de paraformaldehído (PFA)</td><td>>Roth, Alemania</td><td>0335.2</td><td></td></tr><tr><td>Tinción de Nissl fluorescente azul Neurotrace 435/455</td><td>Invitrogen</td><td>N-21479</td><td></td></tr><tr><td>agar-agar para incrustar y reseccionar</td><td>Roth, Alemania</td><td>5210.3</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 30 x 10 mm para incrustar</td><td>SPL Life </td><td></td> Ciencias Se <td>pueden utilizar alternativas</td></tr><tr><td>Portaobjetos, Super Frost</td><td>R. Langenbrinck, Alemania</td><td>se</td><td>pueden utilizar alternativas 61303802 se pueden utilizar</td></tr><tr><td>cubreobjetos</td><td>R. Langenbrinck, Alemania</td> Se <td>pueden utilizar alternativas</td><td>3000302</td></tr><tr><td>medio de montaje Vecta Shield</td><td>Vector Laboratories, EE. UU.</td> Se <td>pueden utilizar medios de montaje alternativos</td><td>H-1000</td></tr><tr><td>Filtro de nitrato de celulosa para aplanar rodajas para fijación</td><td>Satorius Stedim Biotech, Alemania</td><td>11406--25------N</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de barrido láser confocal LSM 710</td><td>Zeiss, Alemania</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo optogenética disección de circuitos del miedo en rodajas de cerebro

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

enfoques Optogenética son ampliamente utilizados para estudiar la función de las poblaciones neuronales y los circuitos mediante la combinación de la expresión específica de proteínas activadas por la luz y la posterior manipulación de la actividad neural por la luz. Channelrhodopsins (CHRS) son cationes canales de luz cerrada y cuando se fusiona a una proteína fluorescente su expresión permite la visualización y la activación simultánea de los tipos de células específicas y sus proyecciones axonales en áreas definidas del cerebro. Via inyección estereotáctica de vectores virales, proteínas de fusión CHR pueden ser constitutivamente o condicionalmente expresan en células específicas de una región del cerebro definido, y sus proyecciones axonales posteriormente se pueden estudiar anatómica y funcionalmente a través de la activación ex vivo optogenético en rodajas de cerebro. Esto es de particular importancia cuando el objetivo de comprender las propiedades sinápticas de conexiones que no pueden ser tratados con los enfoques convencionales de estimulación eléctrica, o en la identificación de nuevos affealquiler y conectividad eferentes que fue previamente poco conocida. Aquí, algunos ejemplos ilustran cómo esta técnica se puede aplicar a investigar estas preguntas a la aclaración de los circuitos relacionados con el miedo en la amígdala. La amígdala es una región clave para la adquisición y expresión de miedo, y el almacenamiento de miedo y recuerdos emocionales. Muchas líneas de evidencia sugieren que la corteza prefrontal medial (córtex prefrontal medial) participa en diferentes aspectos de la adquisición del miedo y la extinción, pero su conectividad preciso con la amígdala está empezando a ser entendido. En primer lugar, se muestra cómo la activación ex vivo optogenético se puede utilizar para estudiar aspectos de la comunicación sináptica entre los aferentes mPFC y células diana en la amígdala basolateral (BLA). Además, se ilustra cómo este enfoque ex vivo optogenético se puede aplicar para evaluar nuevos patrones de conectividad utilizando un grupo de neuronas GABAérgicas en la amígdala, el clúster paracapsular intercalado celular (mpITC), como un ejemplo.

En esta sección se muestra el flujo de trabajo de un enfoque optogenético ex vivo y los resultados representativos de diferentes estrategias experimentales para investigar las propiedades fisiológicas de las proyecciones sensoriales y moduladores de largo alcance a BLA y neuronas mpITC así como las propiedades de conectividad local entre mpITC y BLA. Después de la inyección estereotáctica del vector viral seleccionado...

enfoques Optogenética son ampliamente utilizados para manipular la actividad neuronal y evaluar las consecuencias para la función cerebral. Aquí, una técnica que se describe después de la expresión in vivo del activador óptico canalrodopsina, permite el análisis ex vivo de las propiedades sinápticas de largo alcance específico y conexiones neuronales locales en los circuitos relacionados con el miedo.

Ex Vivo Optogenética Disección de circuitos del miedo en rodajas de cerebro

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

El objetivo general de este experimento es investigar las propiedades funcionales y sinápticas de las proyecciones neuronales y los microcircuitos mediante optogenética ex vivo. Esto incluye la expresión de la rrodopsina del canal y su activación en proyecciones específicas combinadas con grabaciones mediante parche en configuración de celda completa. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre las propiedades sinápticas de la conectividad local y de largo alcance dentro y entre áreas cerebrales.Esto se ilustra aquí mediante la investigación de los circuitos neuronales que sustentan el comportamiento de miedo. La principal ventaja de esta técnica es que permite estudiar circuitos y sinapsis que no son accesibles con técnicas convencionales de estimulación eléctrica. Por lo general, las personas nuevas en este método deberán superar el desafío de realizar todos los pasos requeridos de manera óptima.Esto incluye la localización estereotáxica para inyecciones virales, la identificación del tiempo óptimo de expresión de la rodopsina de canales, la preparación de cortes cerebrales de buena calidad, y la activación luminosa estable y las grabaciones. Antes de comenzar esta

ex-vivo-optogenetic-dissection-of-fear-circuits-in-brain-slices

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

El video muestra la generación de cortes de amígdala inclinados a partir del cerebro de un ratón. El cerebro se coloca en ángulo en la etapa de muestra de vibratomo para obtener cortes que contienen la amígdala y los axones de la corteza prefrontal medial que forman conexiones sinápticas con la amígdala. Los trozos de cerebro se mantienen a la temperatura fisiológica para preservar el tejido para futuros experimentos.

Generación de cortes de amígdala inclinados a partir de un cerebro de ratón

Este video muestra la preparación de finos cortes coronales del cerebro de un cerebro murino, exponiendo las regiones de la amígdala ricas en conexiones sinápticas de la corteza prefrontal medial. A continuación, los trozos se recuperan en líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado para mantener la viabilidad neuronal.

Generación de un corte coronal del cerebro que expone las regiones de la amígdala desde el cerebro de un ratón

Este video describe un método para obtener imágenes y registrar simultáneamente la actividad eléctrica de cortes de cerebro transgénicos que contienen proteínas fluorescentes específicas de neuronas. El procedimiento consiste en mantener el corte de cerebro en una cámara de perfusión con líquido cefalorraquídeo artificial aireado, utilizar una fuente de luz para excitar las células marcadas con fluorescencia y registrar las señales eléctricas con una sonda multicanal y una pinza de parche.

Monitorización óptica y electrofisiológica simultánea de células neuronales en cortes de cerebro

Este video muestra un procedimiento para analizar la conectividad sináptica entre la corteza prefrontal medial (mPFC) y las neuronas de la amígdala utilizando cortes de cerebro de amígdala aguda de ratones. Las neuronas mPFC de estos ratones expresan canalrodopsina fusionada con una proteína fluorescente. Las canalrodopsinas facilitan la entrada de iones y la generación de potencial de acción en las neuronas mPFC tras la activación de la luz. En consecuencia, las neuronas mPFC liberan...

Visualización y mapeo de vías neuronales en un corte de cerebro de amígdala

Describimos un método para caracterizar la topografía funcional y las propiedades sinápticas de los circuitos del prosencéfalo utilizando un enfoque optogenético para fotoestimular poblaciones neuronales in vitro.

Fotoestimulación de barrido láser de circuitos del prosencéfalo optogenéticamente dirigidos

Este protocolo describe un conjunto de métodos para identificar la conectividad funcional específica de tipo celular de entradas de largo alcance de regiones cerebrales distantes utilizando estimulaciones optogenéticas en rebanadas cerebrales ex vivo.

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Con la manipulación optogenética de poblaciones neuronales específicas o regiones cerebrales, el comportamiento se puede modificar con alta resolución temporal y espacial en animales en movimiento libre. Mediante el uso de diferentes herramientas optogenéticas en combinación con fibras ópticas implantadas crónicamente, se puede realizar una variedad de modulaciones neuronales y pruebas de comportamiento.

Manipulación optogenética de la actividad neuronal para modular el comportamiento en ratones que se mueven libremente

Los cortes cerebrales ex vivo se pueden usar para estudiar los efectos de los anestésicos volátiles en las respuestas evocadas a las entradas aferentes. La optogenética se emplea para activar independientemente las aferentes talamocorticales y corticocorticales al neocórtex no primario, y las respuestas sinápticas y de red se modulan con isoflurano.

Activación optogenética de vías aferentes en cortes cerebrales y modulación de respuestas por anestésicos volátiles

Este protocolo demuestra un método sencillo y robusto para estudiar el crecimiento del axón in situ y la dinámica del cono de crecimiento. Describe cómo preparar cortes cerebrales agudos fisiológicamente relevantes ex vivo y proporciona una tubería de análisis fácil de usar.

In situ Visualización del crecimiento de axones y la dinámica de los conos de crecimiento en cultivos agudos de cortes cerebrales embrionarios ex vivo

Aquí presentamos un protocolo que describe la transducción viral de regiones cerebrales discretas con construcciones optogenéticas para permitir la caracterización electrofisiológica específica de la sinapsis en cortes cerebrales agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogación optogenética de la transmisión sináptica de largo alcance y la plasticidad de la corteza prefrontal medial a la corteza entorrinal lateral

El paradigma del miedo observacional evalúa la congelación vicaria en roedores como modelo de empatía afectiva. Este procedimiento consiste en exponer a los roedores observadores a demostradores conespecíficos que reciben descargas aversivas en los pies para provocar respuestas empáticas de congelación. Mediante el empleo de ensayos observacionales del miedo, los investigadores pueden investigar los mecanismos neuronales que subyacen a la empatía afectiva.

El miedo observacional como modelo de empatía afectiva en ratones

Aprende optogenética ex vivo para estudiar propiedades sinápticas de proyecciones neuronales en circuitos del miedo usando rodajas de cerebro. Este método permite analizar conectividad local y de largo alcance con precisión.

Ex Vivo Optogenética Disección de circuitos del miedo en rodajas de cerebro

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