Propiedades Electroactivos Polymer Nanopartículas Exponer fototérmica

El objetivo general de este protocolo es preparar nanopartículas de polímeros conductores que exhiban propiedades fototérmicas y evaluar su citotoxicidad. Las nanopartículas de polímeros conductores son agentes ideales para la terapia fototérmica porque absorben la luz en el rango del infrarrojo cercano y la convierten en calor para matar las células cancerosas. La principal ventaja de los agentes de fototerapia polimérica es que se pueden adaptar para ajustar sus propiedades de absorción mediante la compatibilidad y la capacidad de dirigirse al tumor para permitir una terapia oncológica localizada no invasiva y eficaz.

Los polímeros que estamos utilizando para la terapia fototérmica también se pueden utilizar para aplicaciones de energía alternativa, sensores y electrocrómicos. Las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque la reacción es sensible a la humedad. Es esencial una buena comprensión de las técnicas de síntesis sin aire.

La demostración visual de los ensayos de cultivo celular es fundamental, ya que las técnicas estériles son difíciles de dominar. Todos los ensayos de juego multirrol requieren precisión y consistencia para lograr resultados adecuados. A un matraz de tres cuellos y fondo redondo asegure un tabique, un condensador equipado con un adaptador de control de entrada y un adaptador de control de salida de gas.

Conecte el adaptador de salida de gas a un burbujeador. A continuación, conecte el adaptador de entrada a una línea Shlenk de argón con tubería de PVC de paredes gruesas. Comience el flujo de argón en el matraz de reacción y deje que el gas fluya durante varios minutos.

Después de encender la aspiradora, use un mechero Bunsen para secar la reacción con llama y luego purgue el aparato con argón. Repita esto dos veces más para lograr un ambiente sin aire. Use una jeringa para agregar un punto cero siete gramos de EDOT al aparato a través del tabique.

Agregue 20 mililitros de tetrahidrofurano en el matraz y revuelva. Prepare un baño de acetona de hielo seco en un matraz Dewar de forma baja y enfríe el matraz EDOT durante 15 minutos a menos 78 grados centígrados. A continuación, caiga a 11 milimoles de n-butillitio en hexanos mientras se mantiene una temperatura de menos 78 grados centígrados.

Después de completar la adición, revuelva durante una hora más. Se debe tener mucho cuidado al manipular reactivos de organolitio. Estas soluciones son excepcionalmente peligrosas y solo deben ser manipuladas por alguien que haya sido ampliamente capacitado en su uso.

Retire el baño de acetona con hielo seco. E inmediatamente comience una adición gota a gota de 14 punto 13 mililitros de una solución de cloruro de zinc molar, revolviendo durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, agregue cuatro milimoles de un cuatro Dialkoxy, dos cinco Dibromobenceno y 80 micromoles de paladio tetrakis trifenilfosfina a la reacción.

Comience a refluir la reacción a 75 grados centígrados con un baño de aceite. Cada día, use una jeringa para tomar una pequeña muestra de la mezcla de reacción. Precipite la muestra en dos mililitros de un molar de ácido clorhídrico y use dos mililitros de diclorometano para extraer el material.

Localice el extracto en una cromatografía de capa fina de sílice, o placa TLC, junto con soluciones prefabricadas de EDOT purificado y el correspondiente cuatro Dialkoxy dos cinco Dibromobenceno. Use una solución de 60 a 40 de acetato de etilo y hexanos para revelar la placa en una cámara de vidrio. Una vez completada la reacción, en tres a cinco días, enfríe la reacción a temperatura ambiente.

Agregue 10 mililitros de un molar de ácido clorhídrico seguido de 20 mililitros de diclorometano para apagar la reacción. Transfiera el trabajo de reacción a un embudo separador y aísle la capa orgánica. Lave los orgánicos con agua desionizada hasta que los lavados con agua ya no sean ácidos.

A continuación, seque los compuestos orgánicos con más de 15 gramos de sulfato de magnesio. Después de filtrar el sólido, elimine el solvente usando un evaporador rotativo para producir un sólido amarillo anaranjado. En un vaso de vidrio, prepare un mililitro del dos por ciento en peso por volumen PSS-co-MA en agua y agregue una pequeña barra para revolver.

Prepare una solución de 16 miligramos por mililitro de monómero en cloroformo y transfiera 100 microlitros a un tubo microcentrífugo. Disuelva 30 miligramos de ácido dodecilbenceno sulfónico en el tubo de microcentrífuga y luego use un mezclador de vórtice automático durante 30 a 60 minutos para homogeneizar la solución. A continuación, agregue la fase orgánica homogeneizada en alícuotas de 10 microlitros a la solución de PSS-co-MA al dos por ciento cada 60 segundos.

Después de completar la adición, diluya la solución con dos mililitros de agua y retire la barra revolvente. Coloque la emulsión en un baño de hielo y luego use una sonda para sonicar la inclusión con dos intervalos de 10 segundos a una amplitud del 30 por ciento. Retire el vial del baño de hielo y vuelva a colocar la barra agitadora para continuar mezclando la emulsión.

A continuación, agregue tres coma ocho microlitros de una solución acuosa de cloruro de hierro de cien miligramos por mililitro a la emulsión de monómero y revuelva durante una hora para obtener nanopartículas de polímero estabilizadas con PSS-co-MA. Transfiera la suspensión de nanopartículas a un tubo de centrífuga de siete mililitros y centrifugue la suspensión a 75, 600 veces G durante tres minutos. Finalmente, recupere el sobrenadante y dialice en agua durante 24 horas utilizando un tubo de diálisis de corte de peso molecular de 100 kilodalton.

Cultivo: SCOV: tres células de cáncer de ovario en DMEM, suplementadas con un 10 por ciento de suero fetal bovino a 37 grados centígrados y un cinco por ciento de dióxido de carbono en matraces T 75. Después de disociar y contar las células utilizando protocolos estándar, alimente las células a una densidad de 5.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos. Incubar las células durante 24 horas a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono.

Inmediatamente antes de su uso, diluya la suspensión de nanopartículas en un medio de crecimiento completo a una concentración de un miligramo por mililitro. Filtre la suspensión de nanopartículas a través de un filtro estéril de punto cero de dos micrómetros. A continuación, diluya la suspensión hasta las concentraciones de exposición deseadas con un medio de crecimiento completo suplementado con estreptomicina de penicilina al uno por ciento.

Retire suavemente el medio de cada pocillo y reemplácelo con 100 microlitros de la suspensión de nanopartículas a varias concentraciones de exposición. Después de incubar las células, retire con cuidado la solución y luego reemplace el medio con 100 microlitros de solución cero cera coma filtrada estéril de cinco miligramos por mililitro de MTT. Incube las células durante dos a cuatro horas en la incubadora.

A continuación, examine las células al microscopio para comprobar la formación de cristales de formazano. Retire con cuidado la solución de MTT y reemplácela con 100 microlitros de dimetilsulfóxido. Coloque el plato en una coctelera y mezcle durante varios minutos.

Finalmente, mida los absorbentes de cada pocillo a 590 nanómetros y 700 nanómetros. Estos valores corresponden a los absorbentes máximos del producto Formazano y a una línea de base, respectivamente. Los monómeros resultantes se pueden caracterizar mediante espectroscopía de RMN de hidrógeno y carbono 13.

Las reacciones de acoplamiento de Negishi unen el anillo de fenilo al EDOT, lo que hace que el pico del protón de fenilo cambie de siete coma uno PPM a siete coma ocho PPM. El protón theyenel también se desplaza hacia arriba en el campo a seis punto cinco PPM. Los cuatro protones en los carbonos del puente de etilendioxi se dividen en dos conjuntos de múltiplos a cuatro coma tres PPM.

El espectro de RMN del carbono 13 exhibe picos en uno 70, uno 45, uno 40 y un 13 para los carbonos de thyenel, y un 50, un 20 y un 12 para los carbonos de fenileno. La compatibilidad cital de las nanopartículas poliméricas se determina mediante un ensayo de viabilidad de células MTT. Dentro del rango de concentración de nanopartículas de cero coma dos tres a 56 microgramos por mililitro, las nanopartículas no disminuyen la viabilidad celular a menos del 90 por ciento del control.

Por lo general, una reducción en la viabilidad celular de menos del 20 por ciento es aceptable. Una vez dominado, se tarda aproximadamente una semana en sintetizar el monómero, otra semana en purificarlo y menos de un día en preparar y purificar las nanopartículas. El estudio de citotoxicidad puede completarse en dos días y medio desde la siembra de las células hasta la conclusión del ensayo.

Al intentar realizar estudios celulares in vitro, es fundamental seguir las técnicas asépticas adecuadas. Se pueden realizar estudios adicionales como ensayos de muertos vivos, estudios de microscopía y biodistribución in vivo, y estudios de ovulación fototérmica con las nanopartículas preparadas a través de estos protocolos para comprender mejor su potencial como agentes fototérmicos para la terapia del cáncer.