La inducción de la activación inmune materna en ratones en la etapa mitad de la gestación con Viral Mimic poli (I: C)

El objetivo general de este procedimiento es inducir la activación inmune materna, o MIA, en ratones mediante inyección intraperitoneal del análogo viral poly en la etapa embrionaria media de la gestación. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en el campo de la neuroinmunología, como, cómo la disfunción inmunitaria puede provocar perturbaciones en el desarrollo cerebral y el comportamiento. La principal ventaja de esta técnica es que está diseñada específicamente para investigadores interesados en estudiar la MIA como un factor de riesgo ambiental para el autismo y la esquizofrenia.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, ya que pequeñas diferencias en el método de inducción de MIA pueden alterar significativamente la respuesta descendente en la descendencia. Para establecer una pareja de apareamiento sincronizado, comience alojando cinco ratones hembra por jaula uno al lado del otro en jaulas estándar para ratones, con el fin de sincronizar sus ciclos estrales, y utilice una perforación en la oreja para etiquetar a cada animal. De cero a dos horas antes de que comience el ciclo oscuro, aloje a los ratones hembra de dos en dos por jaula, pese y registre el peso corporal de cada ratón individual, y luego agregue un ratón macho por cada jaula con dos ratones hembra.

De cero a cuatro horas después de que finaliza el ciclo oscuro, levante suavemente a cada ratona por la base de la cola, permitiendo que el animal agarre la rejilla de la jaula con las patas delanteras, para determinar la presencia de una masa blanquecina en la abertura vaginal. Si no es evidente un tapón, inserte suavemente una punta de pipeta de 200 microlitros en la abertura vaginal. La resistencia proveniente de la coagulación confirma la formación de un tapón.

Agrupe los ratones con tapón en una nueva jaula, ya que la presencia de un tapón vaginal confirma únicamente que ha ocurrido la cópula. En los días embrionarios 10,5 a 11,5, levante a cada hembra de ratón con tapón por la base de la cola y observe una protuberancia en el abdomen; luego pese a los ratones para verificar el embarazo, y aloje a los animales preñados en jaulas limpias individuales. Pese el polvo de poli(I:C) en un tubo cónico de 50 mililitros.

El día embrionario 12,5, agregue el volumen apropiado de cloruro de sodio al 0,9 % al volumen correspondiente de poli(I:C) en un tubo cónico y cierre la tapa. Gire suavemente la gota de solución salina sobre el polvo hasta que la solución esté clara. Luego centrifugue el tubo y transfiera la solución de poli(I:C) a un tubo de microcentrifugado.

Utilice un espectrofotómetro para medir la relación de 260 a 280 de la solución de poli(I:C). La relación debe estar entre 1,54 y 1,82, según lo descrito por el fabricante. A continuación, pese el primer ratón y cargue una jeringa de insulina de 0,3 mililitros con el volumen calculado correspondiente de la solución de poli(I:C).

Luego, tomando al ratón por la cola, colóquelo sobre la parte superior de la jaula y sosténgalo firmemente por la nuca. A continuación, inserte la aguja, con el bisel hacia arriba, en el centro de los dos pezones superiores a unos 20 grados con respecto al ratón, y administre la solución de poli(I:C). Después, devuelva al ratón a la jaula.

Después de haber inyectado a todos los ratones, coloque las jaulas en una habitación tranquila y con poco tránsito para evitar otros efectos de confusión, y pese a los ratones a la mañana siguiente. Al menos tres días antes de las pruebas conductuales, cambie el lecho de la jaula de los descendientes adultos de ocho a doce semanas de edad con activación inmune materna o MIA. Treinta minutos antes de la prueba, acostumbre a los ratones a la sala de pruebas.

Para una prueba de inhibición del preimpulso, sujete a los ratones en cilindros de plexiglás colocados sobre un sensor piezoeléctrico. Acostumbre al ratón a la cámara de inhibición del preimpulso durante cinco minutos, con seis ensayos de ruido blanco de 120 decibeles. Luego exponga a los ratones a mezclas aleatorias de sonido, según se indica en la tabla, y compare los resultados con la respuesta de sobresalto basal, para determinar la inhibición del preimpulso en los animales con IAM.

Para una prueba de campo abierto, coloque un ratón en la esquina de un área cuadrada abierta, con una zona central definida de 17 por 17 centímetros, y registre la trayectoria del ratón durante 10 minutos mediante una cámara montada en el techo. Luego, cuantifique las entradas en la zona central y el tiempo pasado en la zona central. Para la prueba de enterramiento de canicas, acostumbre a un ratón a una jaula de prueba con cama de pino abeto comprimida de cinco centímetros de profundidad y limpia durante 10 minutos, luego devuelva al ratón a su jaula de alojamiento y coloque suavemente 20 canicas de vidrio azul marino de 1,5 centímetros de diámetro en una cuadrícula de cuatro por cinco en la jaula de prueba.

Ahora regrese al ratón a la jaula de prueba durante 10 minutos, luego coloque nuevamente al animal en su jaula de alojamiento y cuente el número de canicas que fueron enterradas durante el período de prueba. La inyección de Poly(I:C) en el día embrionario 12,5 puede provocar una respuesta inflamatoria aguda en el eje materno-placentario-fetal y precipitar un efecto crónico sobre el desarrollo cerebral y los fenotipos conductuales. De hecho, el poli(I:C) induce una mayor expresión del gen Il6 en el bazo materno, la placenta y el cerebro fetal, tres horas después de la inyección.

Generalmente, cuando se comparan con crías adultas tratadas con solución salina, las crías adultas expuestas a la MIA presentan menos entradas a la zona central y una duración más corta en la zona central durante la prueba del campo abierto. Los animales inyectados con poli(I:C) también muestran comportamientos de enterramiento más frecuentes en la prueba de enterramiento de canicas y una inhibición del prepulso más baja. La pérdida de células de Purkinje en el lóbulo siete del cerebelo es otra característica distintiva de las crías expuestas a la MIA, observándose un menor número de células de Purkinje positivas para calbindina en el lóbulo siete del cerebelo de estos animales en comparación con los controles inyectados con solución salina.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar no molestar a las ratonas preñadas después de la inducción de la IAM. Posteriormente, se pueden inducir factores adicionales, como estrés o infección posnatal, para estudiar interacciones ambientales adicionales.