Name: La inducción de la activación inmune materna en ratones en la etapa mitad de la gestación con Viral Mimic poli (I: C) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprende a inducir activación inmune materna en ratones mediante inyección intraperitoneal de poli(I:C) en etapa media de gestación. Este protocolo permite estudiar trastornos del neurodesarrollo como autismo y esquizofrenia.

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Nos gustaría honrar al difunto Dr. Paul H. Patterson por sus contribuciones al progreso del modelo de MIA, el autismo, la esquizofrenia y la investigación. Reconocemos Sarkis K. Mazmanian por su gran apoyo en este protocolo; Ruben M. Bayon, Yvette García-Flores, Karen C. Lencioni, y Leslie A. Neumann por la asistencia administrativa; Ali Khoshnan y Jan C. Ko por la asistencia en el rodaje; Elaine Y. Hsiao y Natalia Malkova por sus consejos sobre la inducción MIA; Jeffrey S. Cochrane, Joaquín Gutiérrez, F. Lee Kwan, Jaime Rodríguez, Lorena C. Sandoval, y Natalie A. Verduzco por su cría de animales experto. Este trabajo fue apoyado por el NIH Premio Conte Centro (NIH 5P50MH086383-04, a Paul H. Patterson); Autism Speaks (# 7670, de Paul H. Patterson); Fundación Simons (# 322839, en Sarkis K. Mazmanian); NIH Formación Grant (NIH / NRSA T32GM07616 a K.-HC); Caltech Verano Pregrado Becas de Investigación (SURF) (a ZY); Amgen Académicos Programa de Caltech (a ZY); y fr beca posdoctoralConsejo Nacional de Ciencia om, Taiwán (NSC 101-2917-I-564-039, de W.-LW).

Todos los protocolos se realizaron bajo la aprobación del California Institute of Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional Tecnología (IACUC). 1. Preparación de pares de temporizado de apareamiento <ol><li> Use por lo menos 6 presas para los experimentos de comportamiento y 3 para el análisis de la expresión génica. NOTA: Utilice el doble del número de ratones hembras estimados, ya que sólo alrededor del 50% de los ratones se conecta desde la cronometrada de apareamiento. </li><li> Utilice ratones femenino sin embarazo antes y en 8-16 semanas de edad. NOTA: Los ratones hembra que tiene la exposición sexual antes de los ratones machos, pero no han estado embarazadas son aceptables. </li><li> Casa los ratones hembra juntos y coloque las jaulas junto a la otra con el fin de sincronizar su ciclo estral. Utilice una jaula de ratones estándar con una altura de más de 5,5 pulgadas y un piso interior 75 pulgada cuadrada para permitir la vivienda de 5 ratones adultos. Etiqueta de cada ratón hembra usando un punzón oreja. </li></ol> 2. La creación de temporizado-matING Par <ol><li> Configurar el cronometrado de apareamiento 0-2 horas antes de que comience el ciclo de oscuridad. Coloque dos ratones hembra en cada jaula. Sacar los ratones y pesarlos individualmente. Anotar el peso corporal de cada ratón hembra. </li><li> Coloque un ratón macho en cada jaula con los dos ratones hembra. Utilice el apareamiento trío para minimizar el efecto de confusión paterna. </li></ol> 3. Comprobar tapón vaginal (E0.5) <ol><li> Compruebe la hembra ratones 0-4 horas después de que termine el ciclo de oscuridad. Levante con cuidado el ratón hembra de la base de la cola y permitir que el ratón para coger la rejilla de alambre, la parte superior de la jaula, o el borde de la jaula. </li><li> La búsqueda de signos de tapón vaginal: tapón vaginal es una masa blanquecina visible en la abertura vaginal. Si el enchufe no es evidente, introduzca suavemente una punta de pipeta de 200 l en la abertura vaginal. La resistencia de la coagulación confirma la formación del tapón vaginal. Compruebe el tapón vaginal una vez al día. NOTA: tapón vaginal sólo es una indicación de que se ha producido la copulación, y por lo tanto no guarantee el embarazo. tapón vaginal puede ser difícil de identificar en ciertas cepas de ratones. Busque la ayuda de un cuidador ratones con experiencia para aumentar la precisión de la identificación de enchufe. </li><li> Mover los ratones conectados a una nueva jaula y el grupo de vivienda para ellos. Definir el día de la aparición tapón vaginal como embrionarias 0,5 días (E0.5). </li></ol> 4. En E10.5-11.5, verificar si está embarazada <ol><li> levante suavemente la base de la cola y permitir que el ratón para coger la rejilla de alambre, la parte superior de la jaula, o el borde de la jaula. Observe el área del abdomen para verificar si hay signos de embarazo, por ejemplo, una protuberancia en el abdomen (Figura 1). NOTA: El signo de embarazo es siempre más evidente que en E11.5 en E10.5. </li><li> Pesar los ratones para verificar el embarazo. El ratón embarazadas generalmente pesa alrededor de 20% más pesado en E10.5 y un 30% más pesado en E12.5 en comparación con un ratón que no está embarazada (Figura 2). Sola casa los ratones embarazadas en jaulas limpias. </li></ol> 5. 20 mg /kg de poli (I: C) Preparación <ol><li> Use por lo menos 6 presas por grupo para los experimentos de comportamiento y 3 por grupo para el análisis de la expresión génica. Preparar la cantidad correspondiente de poli (I: C) solución. </li><li> Pesar el poli (I: C) en polvo en un tubo cónico de 50 ml para hacer una concentración final de 40 mg / ml. Con el fin de minimizar y estandarizar el estrés causado por el volumen de inyección, inyectar 5 l de poli (I: C) solución para cada gramo de peso corporal de ratón (5 l / g, o 5 ml / kg). Para inducir la MIA, inyectamos 20 mg de poli (I: C) por kg. NOTA: La concentración de poli (I: C) solución necesaria es (20 mg / kg) / (5 ml / kg) = 4 mg / ml. Puesto que el poli (I: C) polvo contiene 10% de poli (I: C), tenemos que hacer una concentración final de (4 mg / ml) /0.1= 40 mg / ml de poli (I: C) solución. PRECAUCIÓN: El poli (I: C) en polvo es muy ligero. Tenga cuidado de no perder ninguna de polvo durante la transferencia de la espátula para el tubo cónico. </li><li> Añadir el volumen correspondiente de cloruro de sodio 0,9% (solución salina) en la bañera cónicae y cerrar la tapa. Disolver el polvo rodando suavemente la gota de solución salina sobre el poli (I: C) en polvo hasta que la solución es clara. Centrifugar el tubo cónico a 800 xg durante 1 min (Figura 3C). Filtrar el poli (I: C) solución por 0,22 micras filtro. Transferir el poli (I: C) solución a un tubo de 1,5 o 2 ml de microcentrífuga. Opcional: Utilice un espectrofotómetro para medir la relación 260/280 de la poli (I: C) solución. Asegúrese de que la relación es de entre 1,54 a 1,82 (Figura 3) como se describe por el fabricante. NOTA: La solución salina utilizado para disolver el poli (I: C) en polvo y servir como control de la inyección debe ser de grado estéril y farmacéutica. </li></ol> 6. Saline o poli (I: C) Inyección en E12.5 <ol><li> Pesar el ratón sobre la escala y ponerlo de nuevo en la jaula. Utilice la siguiente fórmula para calcular el volumen de la inyección tanto para la solución salina y poli (I: C) ratones: el peso corporal (g) multiplicado por 5 = volumen de inyección deseado (l). Use un Insul 0,3 mlen la jeringa para extraer el volumen calculado de solución salina o 20 mg / kg de poli (I: C) solución, por ejemplo, 150 ml para un ratón de 30 g. </li><li> recoger suavemente hacia arriba el ratón por la base de la cola y colocarlo en la parte superior de la jaula. Manejar el ratón con cuidado para evitar confusión efectos inducidos por el estrés. Insertar la aguja, bisel hacia arriba, aproximadamente a 20 ° en relación con el ratón en el centro de sus dos pezones superior (Figura 4), ​​e inyectar la solución salina o poli (I: C) solución. NOTA: La aguja debe ser reemplazado para cada ratón después de la inyección. </li><li> Coloque el ratón de nuevo a su jaula. Colocar las jaulas en una habitación tranquila tráfico, baja para evitar los efectos de confusión de otros. </li></ol> 7. El día de poli (I: C) Inyección (E13.5) <ol><li> Compruebe los ratones inyectados a la mañana siguiente. Utilice una escala para medir el peso corporal. NOTA: El poli (I: C) inyectado ratones embarazadas por lo general ganan menos peso que los ratones solución salina inyectada en el día después injexión. </li><li> No moleste a los ratones hasta que nacen las crías. </li></ol> 8. Captador de la MIA Offspring <ol><li> Con el fin de minimizar los efectos de confusión de la inducción MIA, sigue las instrucciones que figuran a continuación para medir el uso de MIA descendencia. <ol><li> Excluir las camadas de nacimiento prematuro o tardío, o si el tamaño de la camada es menor que 5. </li><li> La eutanasia de los cachorros excesivas de CO2 si el tamaño de la camada es mayor que 10. </li></ol></li></ol> 9. Opcional: Examine la respuesta inflamatoria aguda Después de MIA <ol><li> Sacrificar el embarazo los ratones 3 horas después de la solución salina o poli (I: C) de inyección utilizando el método descrito en el protocolo aprobado por comité de cuidado de los animales de la institución. NOTA: La dislocación cervical a menudo se prefiere ya que minimiza el efecto de las drogas de CO 2 / eutanasia en la presa y el embrión. </li><li> Se recoge el bazo de los ratones gestantes adultas y aislar la placenta y el feto sujetadoren menos del microscopio estereoscópico. <ol><li> Para la recolección de bazo, poner el ratón sobre la placa de disección y rociar 70% de etanol en la zona abdominal de los ratones embarazadas. Use un par de tijeras estériles para hacer un corte vertical en el centro de la zona abdominal por debajo de la caja torácica a través de la piel. </li><li> El bazo se encuentra en el cuadrante abdominal superior, izquierda. El uso de fórceps para aislar el bazo. Enrollar el bazo de limpiaparabrisas tarea delicada para eliminar el tejido graso alrededor del órgano. Recoger aproximadamente 50 mg de tejido esplénico y colocarlos individualmente en tubos Eppendorf con 500 l de ARN estabilizar tampón o TRIzol para evitar la degradación de ácidos nucleicos. Almacenar las muestras a -80 ° C congelador hasta su uso. </li><li> Para la recolección de la placenta, tire suavemente de los cuernos uterinos del cuerpo. Coloque los cuernos uterinos en una placa de Petri llena de solución salina de fosfato tamponada esterilizada en autoclave (PBS) y dejar el plato en hielo. Use dos pinzas para rasgar la pared uterina y exponer el saco amniótico. <ol><li>Con cuidado, usar las pinzas para abrir el saco amniótico sin dañar la placenta y el feto. Separar la placenta del feto y cortar el cordón umbilical tan cerca de la placenta como sea posible. Eliminar los restos saco amniótico de la placenta. Coloque la placenta individualmente en tubos Eppendorf con 500 l de ARN estabilizan tampón o TRIzol. Conservar la muestra a -80 ° C congelador hasta su uso. </li></ol></li><li> Para la recolección de cerebro fetal, almacenar el feto en el ARN a estabilizar tampón de la etapa 9.2.2 hasta la disección. Se burlan de la membrana pial desde el ventrículo del cerebro utilizando delicados # 5 fórceps bajo el microscopio estereoscópico. Retirar con cuidado toda la membrana del cerebro del feto. Coloque los cerebros fetales individualmente en tubos Eppendorf con 500 l de ARN estabilizan tampón o TRIzol. Conservar la muestra a -80 ° C congelador hasta su uso. </li></ol></li><li> Extraer el ARN a partir del tejido y convertir el ARN en ADNc. Analizar la expresión del gen IL-6 en el ADNc de real-time PCR. </li><li> Extraer el ARN de los tejidos siguiendo el protocolo fabricación de TRIzol. Si los tejidos se almacenan en tampón de estabilización de ARN. Descongelar la muestra y centrifugar la memoria intermedia. Transferir el tejido de punta a otra Eppendorf con 500 l TRIzol y continuar la extracción de RNA. </li><li> Use un espectrofotómetro para medir la concentración, 260/280 y 260/230 relación del ARN. Asegúrese de que las relaciones son por encima de 2,0. </li><li> Eliminar la contaminación de ADN por tratado el ARN con ADNasa I. Mix RNA 1 g, tampón de reacción de 1 l 10X, 1 l de DNasa libre de RNasa, y agua libre de nucleasa a un volumen final de 10 l. Incubar la mezcla maestra a 37 ° C durante 30 min. Añadir 1 l de solución de parada DNasa para terminar la reacción. Incubar la mezcla a 65 ° C durante 10 min. </li><li> Transcripción inversa del ARN en ADNc. Utilice reacciones de 20 l, y de hasta 1 g de ARN total por reacción. Mezclar 4 l de tampón de transcripción (RT) de la mezcla de reacción 5x revertir, 1 l reverse transcriptasa, 11 l plantilla de ARN después del tratamiento con DNasa I y 4 l de nucleasa libre de H2O para obtener una solución final de 20 microlitros. Programar las condiciones termociclador para RT. Una condición genérico incluye: Paso 1: 25 ° C durante 5 min; Paso 2: 42 ° C durante 30 min; Paso 3: 85 ° C durante 5 min; Paso 4: mantener a 4 ° C. Diluir el cDNA 5 veces. Para el almacenamiento a corto plazo, almacenar el ADNc a 4 ° C. Para el almacenamiento a largo plazo, congelar el cDNA a -20 ° C. </li><li> Analizar la expresión del gen IL6 en el ADNc mediante PCR en tiempo real y normalizar la expresión del gen IL6 a ß-actina de la expresión génica. <ol><li> Hacer una mezcla maestra para la IL-6 y la detección de β-actina. Utilice 25 l de reacción, la mezcla maestra para cada gen incluye 12,5 l SYBR Green Mix, 0,5 l de cebador directo 10 M, 0,5 l de 10 mM cebador inverso y 6,5 l de nucleasa libre de H 2 O. </li><li> Coloca 5 l 5x ADNc diluida unat el fondo del pozo de placa de reacción óptica de 96 pocillos. Pipetear 20 l de mezcla maestra a cada pocillo para hacer un 25 l final de mezcla de PCR. Por triplicado cada gen para cada muestra. Sellar la placa con película adhesiva óptica. Centrifugar la placa a 800 xg durante 3 min a 4 ° C Utilice el programa estándar de PCR en tiempo real: Paso 1: 50 ° C durante 2 min; Paso 2: 95 ° C durante 10 min; Paso 3: 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y la temperatura de 60 ° C durante 1 min. Añadir un paso adicional para la curva de disociación. </li></ol></li></ol> 10. Examine las anormalidades de comportamiento en Offspring MIA adulto (Opcional): <ol><li> Llevar a cabo las pruebas de comportamiento en las edades de 8-12 semanas. Cambiar la ropa de cama jaula de al menos 3 días antes de la prueba. Aclimatarse a los ratones a la sala de pruebas de comportamiento al menos 30 minutos antes de la prueba. </li><li> Para la inhibición prepulso (PPI), restringir los ratones en cilindros de plexiglás con un sensor piezoeléctrico por debajo de ella. Aclimatarse a los ratones a la PPIcámara de 5 min. Exponer a los ratones con 6 ensayos de 120 dB de ruido blanco (sobresalto). </li><li> A continuación, exponer a los ratones con mezclas aleatorias de 14 ensayos de ruido de fondo, 14 ensayos de sobresalto, 14 ensayos de prepulso 5 dB (5 dB mayor que el ruido de fondo) + sobresalto (PPI5), y 14 ensayos de prepulso 15 dB (15 dB más altos de ruido de fondo + de sobresalto (PPI15). </li><li> Promediar la respuesta de sobresalto durante los 6 primeros ensayos de 120 ensayos dB. Promediar la respuesta de sobresalto para los otros estímulos individuales. Convertir el valor a la inhibición prepulso por (sobresalto - PPI5 o PPI15) / sobresalto. </li><li> Para la prueba de campo abierto, coloque el puntero del ratón en la esquina de un espacio cuadrado abierto (50 x 50 x 50 cm 3). Registrar la trayectoria del ratón durante 10 min a través de una cámara montada techo. Definir el centro de la arena como la zona central (17 x 17 cm 2). Cuantificar la distancia recorrida, las entradas de la zona central, y el tiempo transcurrido en la zona central de forma manual o mediante software de análisis automático basado en imágenes. </li&gt; <li> Para la prueba de enterramiento de esferas, ambientar el ratón a una jaula de ensayo con, limpio, ropa de cama de pino Aspen profundidad de 5 cm comprimido durante 10 minutos. Vuelva a colocar el puntero del ratón a su homecage. Con cuidado, coloque 20 de color azul marino de 1,5 cm de diámetro canicas de vidrio en la moda de 4 x 5 arreglo. Coloque el ratón de nuevo a la jaula de ensayo con mármoles durante 10 minutos. Contar los mármoles que ha sido enterrados en la duración del ensayo de 10 min. </li></ol> 11. Examine el cerebelosa Neuropatología en la descendencia MIA Adultos (Opcional): <ol><li> La eutanasia a la solución salina y MIA hijos adultos por anestesia. Perfundir el ratón con 50 ml de PBS y posteriormente 50 ml de paraformaldehído al 4% a través del sistema cardiovascular. </li><li> Retire cuidadosamente el cerebro y Postfix el cerebro en 4% de paraformaldehído durante la noche a 4 DO. Enjuague el cerebro con PBS tres veces y almacenar el cerebro en PBS con azida de sodio 0,02% en una nevera C 4 ° hasta su uso. NOTA: El cerebro se fijaron posteriormente se puede almacenar en PBS con 0,02% de SODazida io en la nevera hasta por un mes. </li><li> Sección del cerebro en 50 micras rodajas finas sagittally usando vibratome. Recoger las secciones del cerebro usando un pincel suave. Terminar la actividad de peroxidasa endógena por incubación de las secciones en peróxido de hidrógeno 0,6% durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Incubar las secciones de anticuerpo anti-calbindin diluida en el tampón de bloqueo (suero de cabra al 10% con azida de sodio 0,1% de Triton X-100 y 0,02% en PBS) durante la noche a temperatura ambiente. A continuación incubar las secciones en correspondiente anticuerpo secundario biotinilado diluido en tampón de bloqueo durante 2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Se incuban las secciones en DH avidina - tampón complejo H peroxidasa biotinilada para detectar la biotina durante 1 hora a temperatura ambiente. Desarrollar las secciones mediante el uso de sustrato de peroxidasa para visualizar el antígeno. Se lavan las secciones con PBS tres veces entre los pasos. Montar las secciones en portaobjetos de microscopio. Imagen de las secciones bajo el microscopio. </li></ol&gt;

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<li>Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+transformations+of+neurodevelopmental+sequences+across+mammalian+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species.</a> J Neurosci. 33 (17), 7368-7383 (2013).</li>
<li>Abazyan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+interaction+of+mutant+DISC1+and+immune+activation+produces+adult+psychopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Prenatal interaction of mutant DISC1 and immune activation produces adult psychopathology.</a> Biol Psychiatry. 68 (12), 1172-1181 (2010).</li>
<li>Meyer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+behavioral+and+pharmacological+dysfunctions+following+disruption+of+the+fetal+brain+balance+between+pro-inflammatory+and+IL-10-mediated+anti-inflammatory+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Adult behavioral and pharmacological dysfunctions following disruption of the fetal brain balance between pro-inflammatory and IL-10-mediated anti-inflammatory signaling.</a> Mol Psychiatry. 13 (2), 208-221 (2008).</li>
<li>Vuillermot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+immune+activation+interacts+with+genetic+Nurr1+deficiency+in+the+development+of+attentional+impairments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prenatal immune activation interacts with genetic Nurr1 deficiency in the development of attentional impairments.</a> J Neurosci. 32 (2), 436-451 (2012).</li>
<li>Bechard, A., Nicholson, A., Mason, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Litter+size+predicts+adult+stereotypic+behavior+in+female+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Litter size predicts adult stereotypic behavior in female laboratory mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (4), 407-411 (2012).</li>
<li>Harvey, L., Boksa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stereological+comparison+of+GAD67+and+reelin+expression+in+the+hippocampal+stratum+oriens+of+offspring+from+two+mouse+models+of+maternal+inflammation+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">A stereological comparison of GAD67 and reelin expression in the hippocampal stratum oriens of offspring from two mouse models of maternal inflammation during pregnancy.</a> Neuropharmacology. 62 (4), 1767-1776 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

MIA inducción en diferentes ventanas de tiempo perturba diferentes eventos de desarrollo cerebral en roedores, y por lo tanto conduce a diferentes alteraciones del comportamiento y neuropatologías en la descendencia. Aquí, se describe un protocolo para inducir MIA en ratones con poli (I: C) de inyección en E12.5. Este método de inducción MIA conduce a comportamiento, neurológicos, inmunológicos y alteraciones gastrointestinales asociados con el autismo y la esquizofrenia en la descendencia 8,10,11,16. Es impo...

El concepto de la activación inmune materna (MIA) se origina a partir de los estudios epidemiológicos sobre la asociación de la infección materna con el autismo y la esquizofrenia 1. Debido a la ausencia de patógenos virales de replicación detectables en la placenta o el cerebro del feto después de la infección viral de la madre 2,3, el efecto de la infección en la descendencia es la hipótesis de que es causada por la activación del sistema inmune materno en lugar de los propios patógenos . Para dilucidar la relación causa-efecto entre MIA y los trastornos psiquiátricos, la inyección de sintetizado químicamente, virales imitan doble poliinosínico ARN de cadena: ácido policitidílico (poli (I: C)) en roedores embarazadas ha sido ampliamente utilizado como modelo animal para el MIA 4,5. Poli (I: C) es reconocida por los receptores Toll-like 3 (TLR3), y la administración sistémica de poli (I: C) induce la respuesta inflamatoria aguda de tipo vírico. Uno de los mecanismos por los que el poli (I: C) produces anomalías conductuales y neuropatologías en la descendencia es al causar un desequilibrio de las citocinas inflamatorias favor y en contra en el eje materno-fetal de la placenta-6. Varios grupos han adoptado el modelo de MIA de entender la etiología de los trastornos psiquiátricos 7, y debido a la diversidad de intereses entre grupos de investigación, varios puntos de tiempo de la activación inmune se han utilizado para conseguir diferentes perturbaciones en el desarrollo del cerebro y los comportamientos 7. El laboratorio de Paul H. Patterson en el Instituto de Tecnología de California adopta la estrategia de inyección de poli (I: C) en ratones embarazadas en embriones de 12,5 días (E12.5), que ha demostrado con éxito que MIA es capaz de inducir comportamiento, neurológicos, y cambios inmunológicos en la descendencia que están asociados con el autismo y la esquizofrenia 8-11. Nuestros trabajos anteriores muestran que MIA descendencia mostrar anormalidades de comportamiento (por ejemplo, impairmen socialest, déficit de comunicación, comportamiento repetitivo, un comportamiento similar a la ansiedad, y la inhibición latente déficit 8,10,12), la desregulación inmune y citocinas desequilibrio 8,13,14, alteración de la expresión de genes del cerebro fetal al 15, la pérdida de células de Purkinje en el lóbulo VII del cerebelo 11, alteración de las propiedades sinápticas en el hipocampo 9, la interacción gen x ambiente 13, la alteración de la permeabilidad del intestino, y la composición de la microbiota intestinal 16. Además, las estrategias terapéuticas y profilácticas también se desarrollan a partir de este 13,16,17 sistema modelo. Mediante la inducción de MIA en E12.5, otros han demostrado que MIA produce la activación microglial fetal y alteración del desarrollo colinérgica en el cerebro anterior basal 18, la interacción cepa específica 19, cerebro sinaptosomales cerebral anomalías ultraestructurales, cerebrales mitocondriales respiratorias abnormalties hiperfunción cadena, regulación a la baja de moléculas sinaptosomales cerebrales 17 ,comportamientos de tipo depresivo, deterioro en la cognición y del hipocampo potenciación a largo plazo (LTP), y el déficit de la neurogénesis del hipocampo adulto 20. Aquí, se proporciona un método detallado de cómo inducir MIA en E12.5 por poli (I: C), así como paradigmas de cómo aplicar este modelo para estudiar la etiología de autismo y la esquizofrenia. Es importante señalar que MIA es un factor de riesgo para una variedad de trastornos 4, y sus resultados son extremadamente sensibles a la hora y el método de inducción, así como la cría de las presas embarazadas. Como tal, incluso pequeñas incongruencias entre los laboratorios a menudo resultan en una baja reproducibilidad y / o diferentes fenotipos en la descendencia. Nuestro método está diseñado específicamente para los interesados ​​en el estudio de MIA como un factor de riesgo ambiental para el autismo y la esquizofrenia, y la descripción detallada proporcionada ayudará a los investigadores a mejorar la reproducibilidad de sus datos.

<table><tbody><tr><td>Poliinosínico&ndash; ácido policitidílico sal de potasio</td><td>SIGMA</td><td>P9582</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio al 0,9% INJ. USP</td><td>HOSPIRA</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>MONOJECT jerinaje de insulina 3/10 ml 29 G x 1/2"</td><td>COVIDIEN</td><td>8881600145</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubos cónicos con tapón de rosca</td><td>USA SCIENTIFIC</td><td>1500-1211</td><td></td></tr><tr><td>espectrofotómetro Nanodrop 1000</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td> opcional <td>Wild Heerbrugg</td><td>M5A</td><td>Opcional</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5 Tamaño de la punta de acero inoxidable .10 X .06 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td>Opcional</td></tr><tr><td>Reactivo de estabilización de ARN RNAlater</td><td>Qiagen</td><td>76104</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo TRIzol</td> opcional <td>Life Technologies</td><td>15596-026&nbsp;</td><td>opcional</td></tr><tr><td>RQ1 DNasa libre de arnasa</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td>Kit de</td></tr><tr><td>síntesis de ADNc iScript</td> opcional <td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla maestra verde universal SYBR FastStart opcional con ROX&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4913922001</td><td>Opcional</td></tr><tr><td>PCR en tiempo real</td><td>ABI</td><td>7300</td><td>Opcional</td></tr><tr><td>Imprimación: Il6 forward</td><td>Life Technologies</td><td>TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC</td><td>Imprimación opcional</td></tr><tr><td>: Il6 Reverse</td><td>Life Technologies</td><td>TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC</td><td>Opcional</td></tr><tr><td>Imprimación: beta-actina forward</td><td>Life Technologies</td><td>AGAGGGAAATCGTGCGTGAC</td><td>Opcional</td></tr><tr><td>Imprimación: beta-actina Reverse</td><td>Life Technologies</td><td>CAATAGTGATGACCTGGCCGT</td><td>Placa</td></tr><tr><td>de reacción óptica MicroAmp opcional de 96 pocillos</td><td>Life Technologies</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>Opcional Película adhesiva óptica MicroAmp&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4311971</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>EthoVision</td><td>Noldus</td><td>EthoVision</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>SR-LAB aparato (PPI)</td><td>San Diego Instruments&nbsp;</td><td>SR-LAB</td><td>Mármoles</td></tr><tr><td></td><td>Optionl PENN-PLAX</td><td>Piedras preciosas azules mármoles</td> Solución <td></td></tr><tr><td>salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)</td><td>Life Technologies</td><td>21600-069</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>MACRON</td><td>2621-59</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Solución de peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma</td><td>18312</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-calbindina de conejo</td><td>Abcam</td><td>ab11426</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Biotinlyated cabra anti-conejo IgGantibody</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000</td><td>Opcional</td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4000</td><td>Optionl</td></tr></tbody></table>

la inducción de la activación inmune materna en ratones en la etapa mitad de la gestación con viral mimic poli (i: c)

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

El modelo de activación inmunitaria materna (MIA) es cada vez más apreciado como modelo de roedores para el factor de riesgo ambiental de diversos trastornos psiquiátricos. Numerosos estudios han demostrado que el modelo MIA es capaz de mostrar una validez facial, de constructo y predictiva que son relevantes para el autismo y la esquizofrenia. Para modelar la MIA, los investigadores a menudo utilizan el imitador viral poliinosínico:ácido policitidílico (poli(I:C)) para activar el sistema inmunitario en roedores embarazadas. En general, las crías de la madre activada por el sistema inmunitario presentan anomalías de comportamiento y alteraciones fisiológicas asociadas con el autismo y la esquizofrenia. Sin embargo, la inyección de poli(I:C) con diferentes dosis y en diferentes momentos podría conducir a diferentes resultados al perturbar el desarrollo del cerebro en diferentes etapas. Aquí proporcionamos un método detallado de inducción de MIA mediante inyección intraperitoneal (I.P.) de 20 mg/kg de poli(I:C) a los 12,5 días embrionarios (E12.5) de gestación media. Se ha demostrado que este método induce una respuesta inflamatoria aguda en el eje materno-placentario-fetal, lo que en última instancia da lugar a las perturbaciones cerebrales y los fenotipos conductuales asociados con el autismo y la esquizofrenia.

<html> La inyección de 20 mg / kg de poli (I: C) en E12.5 podría evocar una respuesta inflamatoria aguda en el eje-materno-fetal de la placenta y precipitar un efecto crónico para el desarrollo del cerebro y fenotipos conductuales 12,13. Los niveles elevados de una citoquina proinflamatoria, interleuquina (IL) -6, es un indicador fiable de la respuesta inflamatoria aguda después de MIA. El tiempo máximo para la expresión del gen IL-6 en la placenta y el cerebro fetal e...

La activación inmunitaria materna (MIA) es un modelo para un factor de riesgo ambiental de autismo y esquizofrenia. El objetivo de este artículo es proporcionar un procedimiento paso a paso de cómo inducir MIA en ratones preñados con el fin de mejorar la reproducibilidad de este modelo.

La inducción de la activación inmune materna en ratones en la etapa mitad de la gestación con Viral Mimic poli (I: C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric ...

El objetivo general de este procedimiento es inducir la activación inmune materna, o MIA, en ratones mediante inyección intraperitoneal del análogo viral poly en la etapa embrionaria media de la gestación. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en el campo de la neuroinmunología, como, cómo la disfunción inmunitaria puede provocar perturbaciones en el desarrollo cerebral y el comportamiento. La principal ventaja de esta técnica es que está diseñada específicamente para investigadores interesados en estudiar la MIA como un factor de riesgo ambiental para el autismo y la esquizofrenia.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, ya que pequeñas diferencias en el método de inducción de MIA pueden alterar significativamente la respuesta descendente en la descendencia. Para establecer una pareja de apareamiento sincronizado, comience alojando cinco ratones hembra por jaula uno al lado del otro en jaulas estándar para ratones, con el fin de sincronizar sus ciclos estrales, y utilice una perforación en la oreja para etiquetar a cada animal. De cero a dos horas antes de que comience el ciclo oscuro, aloje a los ratones hembra de dos en dos por jaula, pese y registre el peso corporal de cada ratón individual, y luego agregue un ratón macho por cada jaula con dos ratones hembra.De cero a cuatro horas después de que finaliza el ciclo oscuro, levante suavemente a cada ratona por la base de la cola, permitiendo que el animal agarre la rejilla de la jaula con las patas delanteras, para determinar la presencia de una masa blanquecina en la abertura vaginal. Si no es evidente un tapón, inserte suavemente una punta de pipeta de 200 microlitros en la abertura vaginal. La resistencia proveniente de la coagulación confirma la formación de un tapón.Agrupe los ratones con tapón en una nueva jaula, ya que la presencia de un tapón vaginal confirma únicamente que ha ocurrido la cópula. En los días embrionarios 10,5 a 11,5, levante a cada hembra de ratón con tapón por la base de la cola y observe una protuberancia en el abdomen; luego pese a los ratones para verificar el embarazo, y aloje a los animales preñados en jaulas limpias individuales. Pese el polvo de poli(I:C) en un tubo cónico de 50 mililitros.El día embrionario 12,5, agregue el volumen apropiado de cloruro de sodio al 0,9 % al volumen correspondiente de poli(I:C) en un tubo cónico y cierre la tapa. Gire suavemente la gota de solución salina sobre el polvo hasta que la solución esté clara. Luego centrifugue el tubo y transfiera la solución de poli(I:C) a un tubo de microcentrifugado.Utilice un espectrofotómetro para medir la relación de 260 a 280 de la solución de poli(I:C). La relación debe estar entre 1,54 y 1,82, según lo descrito por el fabricante. A continuación, pese el primer ratón y cargue una jeringa de insulina de 0,3 mililitros con el volumen calculado correspondiente de la solución de poli(I:C).Luego, tomando al ratón por la cola, colóquelo sobre la parte superior de la jaula y sosténgalo firmemente por la nuca. A continuación, inserte la aguja, con el bisel hacia arriba, en el centro de los dos pezones superiores a unos 20 grados con respecto al ratón, y administre la solución de poli(I:C). Después, devuelva al ratón a la jaula.Después de haber inyectado a todos los ratones, coloque las jaulas en una habitación tranquila y con poco tránsito para evitar otros efectos de confusión, y pese a los ratones a la mañana siguiente. Al menos tres días antes de las pruebas conductuales, cambie el lecho de la jaula de los descendientes adultos de ocho a doce semanas de edad con activación inmune materna o MIA. Treinta minutos antes de la prueba, acostumbre a los ratones a la sala de pruebas.Para una prueba de inhibición del preimpulso, sujete a los ratones en cilindros de plexiglás colocados sobre un sensor piezoeléctrico. Acostumbre al ratón a la cámara de inhibición del preimpulso durante cinco minutos, con seis ensayos de ruido blanco de 120 decibeles. Luego exponga a los ratones a mezclas aleatorias de sonido, según se indica en la tabla, y compare los resultados con la respuesta de sobresalto basal, para determinar la inhibición del preimpulso en los animales con IAM.Para una prueba de campo abierto, coloque un ratón en la esquina de un área cuadrada abierta, con una zona central definida de 17 por 17 centímetros, y registre la trayectoria del ratón durante 10 minutos mediante una cámara montada en el techo. Luego, cuantifique las entradas en la zona central y el tiempo pasado en la zona central. Para la prueba de enterramiento de canicas, acostumbre a un ratón a una jaula de prueba con cama de pino abeto comprimida de cinco centímetros de profundidad y limpia durante 10 minutos, luego devuelva al ratón a su jaula de alojamiento y coloque suavemente 20 canicas de vidrio azul marino de 1,5 centímetros de diámetro en una cuadrícula de cuatro por cinco en la jaula de prueba.Ahora regrese al ratón a la jaula de prueba durante 10 minutos, luego coloque nuevamente al animal en su jaula de alojamiento y cuente el número de canicas que fueron enterradas durante el período de prueba. La inyección de Poly(I:C) en el día embrionario 12,5 puede provocar una respuesta inflamatoria aguda en el eje materno-placentario-fetal y precipitar un efecto crónico sobre el desarrollo cerebral y los fenotipos conductuales. De hecho, el poli(I:C) induce una mayor expresión del gen Il6 en el bazo materno, la placenta y el cerebro fetal, tres horas después de la inyección.Generalmente, cuando se comparan con crías adultas tratadas con solución salina, las crías adultas expuestas a la MIA presentan menos entradas a la zona central y una duración más corta en la zona central durante la prueba del campo abierto. Los animales inyectados con poli(I:C) también muestran comportamientos de enterramiento más frecuentes en la prueba de enterramiento de canicas y una inhibición del prepulso más baja. La pérdida de células de Purkinje en el lóbulo siete del cerebelo es otra característica distintiva de las crías expuestas a la MIA, observándose un menor número de células de Purkinje positivas para calbindina en el lóbulo siete del cerebelo de estos animales en comparación con los controles inyectados con solución salina.Al realizar este procedimiento, es importante recordar no molestar a las ratonas preñadas después de la inducción de la IAM. Posteriormente, se pueden inducir factores adicionales, como estrés o infección posnatal, para estudiar interacciones ambientales adicionales.

induction-maternal-immune-activation-mice-at-mid-gestation-stage-with

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Lutz, D., et al. Evaluación de los parámetros de neuroplasticidad ultraestructural después de la transducción intrauterina del cerebro y la médula espinal del ratón en desarrollo. J. Vis. Exp. (2019).Este video demuestra la transducción viral mediante inyección en el útero en embriones de ratón. Se prepara una rata preñada para la cirugía y se hace una incisión en la línea media para exponer los cuernos uterinos. Se inyecta una mezcla de un virus que contiene el gen deseado y un tinte...

Transducción viral en el útero en un ratón

El citomegalovirus (HCMV) La infección humana de los recién nacidos representa una causa importante de retraso mental, pero los eventos moleculares que conducen a la patogénesis inducida por virus son aún poco conocidos. Para investigar la dinámica de la infección en el cerebro, adaptamos todo...

El uso de<em&gt; En vivo</em&gt; Imágenes para controlar la progresión de la infección por citomegalovirus Experimental del ratón en neonatos

Desarrollamos un modelo de coleamnionitis para simular la exposición fetal a la inflamación materna (FEMI) sin complicaciones de organismos vivos para examinar los efectos del FEMI en el desarrollo del tracto intestinal de la descendencia. Esto permite el estudio de causas mecanicistas para el desarrollo de lesiones intestinales después de la coleamnionitis.

Un modelo murino de exposición fetal a la inflamación materna para estudiar los efectos de la coleamnionitis aguda en el desarrollo intestinal neonatal

La infección materna es un factor de riesgo para los trastornos del desarrollo neurológico. Los modelos de ratón de activación inmune materna (MIA) pueden dilucidar el impacto de la infección en el desarrollo y la función del cerebro. Aquí, se proporcionan pautas generales y un procedimiento para producir crías confiablemente resistentes y susceptibles expuestas a MIA.

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El parto prematuro (parto &lt; 37 semanas) es un problema de salud mundial urgente con opciones de prevención y tratamiento subóptimas. Presentamos un modelo de ratón de parto prematuro inducido por infección bacteriana vaginal ascendente y describimos cómo analizar la morbilidad y mortalidad neonatal resultante.

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Aprende a inducir activación inmune materna en ratones mediante inyección intraperitoneal de poli(I:C) en etapa media de gestación. Este protocolo permite estudiar trastornos del neurodesarrollo como autismo y esquizofrenia.

La inducción de la activación inmune materna en ratones en la etapa mitad de la gestación con Viral Mimic poli (I: C)

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