Name: Monitoreo en tiempo real de intracelular del ácido biliar Dinámica El uso de un sensor de ácido biliar basada FRET-codificados genéticamente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-04T15:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprende a visualizar el transporte de ácidos biliares en células vivas mediante un sensor FRET codificado genéticamente. Esta técnica permite monitorear dinámicas metabólicas con alta resolución espacial y temporal sin necesidad de marcaje.

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Este trabajo fue financiado por las subvenciones iniciales del ERC (ERC-2011-StG 280255 y ERC-2013-StG 337479) y por la Organización Holandesa para la Investigación y el Desarrollo en Salud (Vidi 91713319).

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Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí se presenta un protocolo detallado para el uso de un nuevo codificado genéticamente sensor de ácido biliar capaz de monitorizar la dinámica espacio-temporales de transporte de ácidos biliares en las células vivas. Este biosensor consta de proteínas fluorescentes azul cerúleo y citrino que se fusionan a FXR LBD-, formando de este modo un sensor de ácido biliar basado en FRET (BAS). El sensor de Bile Acid es relativamente simple y conveniente en uso al tener experiencia básica con cultivo...

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) es ampliamente utilizado para obtener una mejor comprensión de las funciones celulares en las células vivas con una alta resolución temporal y espacial 1. En FRET, la energía de un fluoróforo donante excitado se transfiere a un fluoróforo aceptor. Eficiencia de FRET es fuertemente dependiente de la distancia entre el donante y el fluoróforo aceptor y su orientación y por lo tanto es una lectura sensible de los cambios conformacionales que afectan a los dos fluoróforos. Este fenómeno se explota para generar biosensores basados ​​en FRET para la obtención de imágenes de moléculas pequeñas. Los cambios en su concentración pueden ser monitoreados a medida que aumenta / disminuye en la proporción de intensidad de emisión del aceptor con respecto al fluoróforo donante 2. Por ejemplo, biosensores calcio basados ​​en FRET permiten la detección rápida y estable de las concentraciones de calcio libres en las células 3 viviente. Otras ventajas de biosensores basados ​​en FRET se Imaging en células vivas individuales, theredera no invasividad, de su capacidad para dirigirse a diferentes tipos de células y 4 compartimentos celulares. Muchos aspectos de la dinámica de ácidos biliares intracelular son aún poco conocidos. Por ejemplo, se sabe poco sobre el mecanismo de regulación subyacente de transporte de ácidos biliares conjugada y no conjugada. Técnicas existentes para supervisar este transporte hacen principalmente el uso de reporteros basados ​​en luciferasa, ácidos biliares radiomarcados, o análogos de ácidos biliares fluorescentes. Esto último requiere la modificación de los ácidos biliares, posiblemente afecte a sus propiedades. Periodistas basados ​​en luciferasa tienen mala resolución de tiempo. Además, estas técnicas resultan en la pérdida de la muestra y no son aplicables para formación de imágenes en las células individuales. Por lo tanto, sería beneficioso utilizar métodos que permiten imágenes de células única en vivo de la actividad de transporte utilizando biosensores FRET, especialmente ya que incluye la ventaja de la detección radiométrica 5, 6. Mientras que las variantes de CFForma P / YFP usa más frecuentemente pares FRET, nuevas estrategias que utilizan Morange y mCherry que portan mutaciones auto-asociación inductores han dado lugar a una expansión de la caja de herramientas FRET con nuevos sensores, incluyendo un sensor de ácido biliar desplazada al rojo 7. Hemos creado previamente una FRET bilis sensor ácido genéticamente codificado (BAS), que consiste en un fluoróforo donante (cerúleo) y un fluoróforo aceptor (citrino) que se fusiona con el dominio de unión a ligando de receptor X farnesoide (FXR) (FXR-LBD) y un péptido que contiene un motivo LXXLL 8. Este péptido se asocia con el FXR LBD-ácido de una manera dependiente de la bilis. Tras la activación de FXR, la distancia entre citrino y cerúleo alterará debido a un cambio conformacional. En líneas celulares de mamíferos, FXR activación resulta en un aumento claramente detectable en la proporción de citrino / cerúleo, mientras que el sensor purificada trabaja en la dirección opuesta y conduce a una relación de FRET disminuido tras la activación de FXR. Este sensor (CytoBAS)permite el monitoreo de la dinámica de ácidos biliares citosólicas. Mediante la adición carboxilo-terminal de motivos dirigidos subcelulares, el constructo de BAS puede ser dirigido al núcleo (NucleoBAS) y peroxisomas (PeroxiBAS), lo que permite mediciones de las concentraciones de ácidos biliares en diferentes compartimentos celulares. Aunque la adición del motivo focalización peroxisomal no perjudica su capacidad de respuesta a los ácidos biliares, de células permeables FXR ligandos no indujo cambios en cualquier traste PeroxiBAS dentro de los peroxisomas 8. Como la naturaleza de esta discrepancia no se conoce, el protocolo a continuación se centra en CytoBAS y NucleoBAS. El uso de este sensor FRET codificados genéticamente se demostró recientemente en las células que contienen los transportadores de ácidos biliares hepáticos Na + polipéptido / taurocolato de co-transporte (PNCT) y orgánica alfa transportador de soluto / beta (OSTαβ) 8. PNCT es el importador de ácido biliar hepática principal e OSTαβ es una bilis intestinal basolateraltransportador de ácido que puede funcionar tanto como un importador y exportador depende del gradiente de concentración de ácidos biliares electroquímica 9, 10. Los datos recientes muestran que al transporte de ácidos biliares por PNCT y / o OSTαβ, las respuestas sólidas y rápidas en relación de FRET como un resultado de la interacción ligando-FXR-LBD se pueden observar. A continuación, describimos protocolos detallados para los métodos para medir la FRET como el análisis microscópico y confocal de células activadas por fluorescencia (FACS), destacamos pasos críticos, abordamos los problemas potenciales y discutir métodos alternativos. El uso de este sensor FRET codificado genéticamente, la interacción de ácidos biliares con FXR-LBD se puede cuantificar y monitoreada directamente en las células vivas y proporciona un método rápido y simple de visualizar transporte de ácidos biliares y la dinámica en tiempo real. Plásmidos de expresión de mamíferos que codifican CytoBAS NucleoBAS y están disponibles comercialmente. Por lo tanto, este biosensor puede contribuir aún más a lala comprensión de los transportadores de ácidos biliares o compuestos que activan el FXR y proporcionan una visión más profunda de la biología de los ácidos biliares y la señalización.

<table><tbody><tr><td>CytoBAS&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>62860</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBAS&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>62861</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagles media (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td>Glucosa alta sin L-glutamina</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (pluma/estreptococo)</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200mM)</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>102-70</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (10x)</td><td>Matraz</td> de cultivo celular Lonza <td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>T-25</td><td>VWR international</td><td>392-0253</td><td>Matraz</td>de</tr><tr><td>cultivo celular T-175</td> recubierto de laminina <td>VWR international</td><td>392-0238</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td> recubierta de laminina <td>VWR international</td><td>734-0229</td> Plato de 10 cm <td>recubierto de poli-L-lisina y laminina</td></tr><tr><td></td><td>VWR international</td><td>392-0243</td><td>Recubierto de laminina</td></tr><tr><td>Dietilaminoetilo (DEAE) - Dextrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9885</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina (PEI)&nbsp;</td><td>Brunschwig</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>G418 (genética) 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10131-027</td><td></td></tr><tr><td>Higromicina B, 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10687-010</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de clonación (6 x 8 mm)</td><td>Bellco</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Leibovitz medio de cultivo</td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>Rojo sin fenol</td></tr><tr><td>Tubo de poliestireno de fondo redondo (5 ml) Tubo Facs</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>Sin tapón, no estéril</td></tr><tr><td>Falcon 2.063 tubos (5 ml)</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td>Tapón a presión, estéril</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Cubreobjetos de 8 pocillos Thermo</td><td>scientific</td><td>155409</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>Filtrado con carbón vegetal FBS</td><td>Life technologies</td><td>12676011</td><td></td></tr><tr><td>GW4064</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5172</td><td></td></tr><tr><td>TCDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6260</td><td></td></tr><tr><td>CDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9377</td><td></td></tr><tr><td>Otros productos químicos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoreo en tiempo real de intracelular del ácido biliar dinámica el uso de un sensor de ácido biliar basada fret-codificados genéticamente

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

La transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) se ha convertido en una poderosa herramienta para monitorear el plegamiento, la interacción y la localización de proteínas en células individuales. Los biosensores basados en el principio de FRET han permitido la visualización en tiempo real de eventos de señalización subcelular en células vivas con alta resolución temporal y espacial. Aquí, describimos la aplicación de un sensor de ácidos biliares (BAS) codificado genéticamente que consta de dos fluoróforos fusionados con el dominio de unión del ligando del receptor X FARNESOIDE (FFR-LBD), formando así un sensor de ácidos biliares que puede ser activado por un gran número de especies de ácidos biliares y otros ligandos FXR (sintéticos). Este sensor se puede dirigir a diferentes compartimentos celulares, incluido el núcleo (NucleoBAS) y el citosol (CytoBAS) para medir las concentraciones de ácidos biliares localmente. Permite cuantificar de forma rápida y sencilla la entrada de ácidos biliares celulares, el flujo y la distribución subcelular de ácidos biliares endógenos sin necesidad de marcaje con marcadores fluorescentes o radionúcleos. Además, los sensores BAS FRET pueden ser útiles para monitorizar la unión de ligandos FXR. Finalmente, demostramos que este biosensor FRET se puede combinar con imágenes de otros fluoróforos espectralmente distintos. Esto permite el análisis combinado de la dinámica de los ácidos biliares intracelulares y i) la localización y/o abundancia de proteínas de interés, o ii) la señalización intracelular en una sola célula.

El sensor FRET-BAS presentado se basa en el dominio de FXR (LBD-FXR) de unión al ligando unido a dos fluoróforos citrino y cerúleo) y un motivo LXXLL. Este sensor permite investigaciones de transporte de ácidos biliares en las células con alta resolución espacial y temporal (Figura 1 A) viviente. Las mutaciones en cerúleo y citrino se aplicaron a promover la formación del complejo intramolecular (Figura 1</strong...

Proporcionamos un protocolo detallado para estudiar la dinámica de los ácidos biliares en células vivas utilizando un sensor BAS FRET codificado genéticamente. Este sensor de ácidos biliares representa una herramienta única para estudiar (regular el) transporte de ácidos biliares y la activación de FXR en una amplia gama de tipos de células.

Monitoreo en tiempo real de intracelular del ácido biliar Dinámica El uso de un sensor de ácido biliar basada FRET-codificados genéticamente

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar un sensor de ácidos biliares FRET codificado genéticamente para visualizar fácilmente el transporte y la dinámica de los ácidos biliares con una alta resolución espacial y temporal. Este sensor puede responder a preguntas metabólicas clave, como la relación de la bilis y la dinámica con la glucosa, los lípidos y el metabolismo energético. La principal ventaja de esta técnica es que el transporte de ácidos biliares ahora se puede monitorear directamente a células vivas individuales sin la necesidad de etiquetar los ácidos biliares.Este método puede proporcionar información sobre el transporte y la dinámica de las células y los ácidos biliares. También se puede utilizar para visualizar los efectos o la activación de células vivas individuales, o para combinar imágenes de la localización de proteínas y el transporte de ácidos biliares. El sensor de ácidos biliares codificado genéticamente, en adelante, el sensor, consta de un fluoróforo cerúleo donante y un fluoróforo de citrino exceptuado.Los dos fluoróforos están unidos por el dominio de unión al ligando del receptor nuclear de ácidos biliares FXR, fusionado con un cofactor FXR, el péptido. Dos cambios de aminoácidos modificados en los dos fluoróforos promueven las interacciones intermoleculares entre el cerúleo y el citrino. Se utilizan dos construcciones diferentes que llevan el sensor.En una construcción, el sensor contiene la señal de localización nuclear c-terminal y, por lo tanto, se acumula en el núcleo. En la otra construcción, el sensor carece de cualquier secuencia de orientación y, por lo tanto, se localiza en el citoplasma. El siguiente protocolo de vídeo se centra en cómo obtener imágenes del sensor en células vivas.El protocolo de texto cubre cómo diseñar celdas que expresan el sensor y cómo analizarlas más a fondo mediante hechos. En preparación para la obtención de imágenes de las células, coloque las células que expresan el sensor a la densidad deseada en un portaobjetos estéril de ocho pocillos con cubierta de fondo deslizante en un medio de cultivo completo. Cuando las células hayan crecido a 60 t0 70 por ciento de confluencia, proceda con el experimento.Lave las células que están adheridas al portaobjetos de la cámara una vez con 200 microlitros de 1x PBS o Leibovitz L-15 Culture Medium. A continuación, aspire la solución y sustitúyala por 300 microlitros de medio de cultivo Leibovitz L-15 para que no sea necesario controlar el CO2. Si se utiliza DMEM con rojo de fenol, en lugar de Leibovitz L-15, planee realizar un seguimiento del PH durante la recopilación de datos, ya que el sensor es sensible al PH. A continuación, prepare diluciones de los compuestos que se utilizarán en el experimento a concentrados de 3x a 5x, incluidos GW4064 y TCDCA.Prepárese para agregar alícuotas de 50 a 100 microlitros durante la toma de imágenes, de modo que las soluciones se mezclen rápidamente en la cámara de portaobjetos. Ahora, inicie el software de imágenes de un microscopio confocal y encienda el láser. El microscopio debe estar equipado con un objetivo de aceite de 63x, una cámara de incubación de 37 grados Celsius y un láser violeta de 405 nanómetros.A continuación, ajuste la configuración del microscopio. Establezca el modo de adquisición en XYT para obtener imágenes de lapso de tiempo de un solo plano focal. Establezca la velocidad de adquisición de imágenes en intervalos de 20 segundos, de modo que se puedan agregar compuestos durante los descansos.Además, asegúrese de establecer el rango espectral para la detección de una misión. Enfoque en las células mediante la transiluminación. A continuación, en el control de software, dibuje círculos para definir las regiones de interés.Seleccione celdas con intensidades de florescencia similares y tamaño y forma normales. No se acerque demasiado a los perímetros de la celda. Luego, comience a tomar medidas.Tome nota de su valor y continúe tomando medidas hasta que la floración cerúlea y citrina se haya estabilizado. Una vez que se haya logrado la estabilidad de la florescencia, agregue de 50 a 100 microlitros de ácidos biliares u otros compuestos en los puntos de tiempo elegidos durante la medición. Evite el borde de la cámara al pipetear y agregue el líquido lentamente.La correcta ejecución de este paso es fundamental para el experimento. Nuevamente, deje que la florescencia se estabilice antes de continuar. Termine el experimento agregando cuidadosamente 100 microlitros de GW4064 para una concentración de cinco a 10 micromolares.Continúe grabando hasta que la florescencia se haya estabilizado una vez más. A continuación, guarde el experimento y exporte los datos como un archivo avi. Abra los archivos avi guardados en la imagen J seleccionando complementos, pilas, entrelazador de pilas.A continuación, haga clic en editar, seleccionar y agregar al administrador para abrir la ventana del administrador de RLI. Luego, cambie la opción mostrar todo. Con la herramienta de selección ovalada, dibuja algunos ROI que cubran celdas específicas.No se acerque a los perímetros de las celdas porque es probable que las células sufran alguna deriva focal o migración. Además, dibuje un círculo en un área fuera de las celdas para determinar la señal de fondo. También se puede utilizar un área dentro de una celda que no exprese el sensor.Ahora, seleccione un ROI y haga clic en complementos, y luego en el perfilador de proporción. Aparecerán tres pantallas. RAW, relación y perfil de relación.La ventana RAW muestra el aumento de la intensidad del citrino como una línea azul, y una disminución del cerúleo como una línea roja, si hay FRET. La ventana de proporción muestra información sobre la proporción de citrino a cerúleo, que aumentará con un aumento en FRET. La ventana de perfil de relación muestra los valores para las mediciones de intensidad de fluorescencia en ambos canales.Si se utilizan archivos de configuración específicos del microscopio, el orden de los canales puede aparecer invertido. Ahora, copie los datos de la ventana de perfil de relación a una hoja de cálculo para el análisis estadístico. A continuación, proceda a hacer lo mismo con todos los demás ROI seleccionados, así como con el ROI en segundo plano.Se realizó un experimento FRET basado en la intensidad cuantitativa de células vivas en células U2OS que expresan el sensor y que carecen de transportadores endógenos de ácidos biliares. Las células fueron tratadas con TCDCA. Esto no dio lugar a ningún cambio en FRET.Cuando las células fueron tratadas con GW4064, la proporción promedio de citrino a cerúleo aumentó notablemente. Para demostrar que el sensor puede combinarse con otras proteínas, se diseñaron células U2OS que coexpresan el sensor con NTCP y OST alfa-beta. Mostraron un claro aumento en la relación citrino/cerúleo tras la adición a TCDCA y GW4064.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar la dinámica de los ácidos biliares utilizando el sensor de ácidos biliares. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una hora. Este procedimiento puede ampliarse fácilmente para incluir más información de imagen, como la localización subcelular de la proteína de interés.Siempre y cuando la longitud de onda de esta proteína sea diferente a la del sensor. Para evitar el fotoblanqueo, es importante mantener el sensor que expresa las células en la oscuridad tanto como sea posible.

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