Name: El cultivo humanas pluripotentes y células madre neurales en un sistema de cultivo celular cerrado para la investigación básica y preclínica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprende a cultivar células madre pluripotentes y neuronales en un sistema cerrado con control atmosférico constante. Este método garantiza máxima esterilidad y viabilidad celular para investigación preclínica.

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Los autores desean dar las gracias al personal de Biospherix por su ayuda en el aprendizaje del uso del sistema de cultivo celular XVIVO cerrado, especialmente Matt Freeman; el personal de Miles &amp; Kelley Construction Company, Inc., por su trabajo en la creación de la infraestructura de laboratorio, especialmente Russ Hughes; el personal del Hospital de Niños del Condado de Orange departamento de instalaciones y servicios de apoyo a su trabajo en la coordinación de la remodelación de laboratorio, especialmente Adam Lukhard y Devin Hugie; el personal del Hospital de Niños del Condado de Orange departamento de Sistemas de Información por su ayuda en la creación de la infraestructura de gestión de datos y el acceso a distancia, especialmente Viet Tran; Hospital de Niños del Condado de Orange Equipo de Gestión Ejecutiva por su constante apoyo del proyecto, especialmente al Dr. Maria Miñon y Brent Dethlefs. Este trabajo fue financiado por el Hospital de Niños del Condado de Orange y el Instituto Regenerativa de California Medicine a través TR3-05476 subvención a PHS. Todos los autores contribuyeron igualmente a este trabajo.

<ol><li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children%27s+Hospital+of+Orange+County%3A+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.Med%22%5BJournal%5D)">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li>
<li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li>
<li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+HIF1alpha+repress+the+differentiative+effects+of+BMPs+in+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma.</a> Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).</li>
<li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li>
<li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li>
<li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.Rev.Neurother%22%5BJournal%5D)">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Stem+Cell+Res.Ther%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li>
<li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.Res%22%5BJournal%5D)">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li>
<li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Las células cultivadas dentro de los CPF ver ningún cambio en las concentraciones de oxígeno o dióxido de carbono a medida que se mueven de incubadora a la cámara de procesamiento al microscopio cámara y la espalda. Es fundamental que las condiciones en cada cámara se adaptan a la incubadora particular en la que se mantienen las células antes de que las células se retiran de la incubadora. La atmósfera dentro del aparato es continuamente filtra-HEPA y es adaptable con respecto a las concentraciones de oxígeno y dióxido de carbono. Las células pueden ser cultivadas en concentraciones estándar para PSCs o NSCs, 5% y 9%, respectivamente; o concentraciones alternativas pueden ser elegidos para los diferentes tipos de células o para experimentos específicos. Así, el aparato se suministra con fuentes constantes de grado médico de oxígeno, dióxido de carbono, y nitrógeno (Figura 4). Los tres de estos gases son suministrados por los sistemas colectores de gases específicos que aseguran un abastecimiento constante. El aparato también se suministra con una mezcla de gas de calibración que consiste en10% (± 0,01%) de dióxido de carbono en oxígeno. Los sistemas múltiples están alojados fuera de la planta de producción de células y los gases se canalizan en la instalación a través del techo. El gas de calibración se encuentra dentro de la instalación. El aparato se suministra adicionalmente con vacío de la casa, también a través del techo. El uso de un sistema de control electrónico e inalámbrico unidades de transmisión, las presiones de salida de los colectores son monitoreados constantemente. En el caso de que cualquier presión cae fuera del rango, los operadores de las instalaciones de producción de células se llamaron por teléfono de forma automática y notificados de tal manera que la acción apropiada puede ser tomada. Los requisitos de alimentación del aparato se cumplen por seis dedicados 120 V circuitos que descienden desde el techo y conectados a generadores de emergencia del hospital para garantizar un suministro constante. El funcionamiento del aparato se controla mediante software en un equipo basado en PC alimentado a través de un sistema de alimentación ininterrumpida. Estos arreglos de poder y de la computadoragarantizar que el sistema funciona de forma continua, incluso en caso de un fallo del sistema de alimentación pública. El software que controla el aparato cuenta con una interfaz gráfica fácil de usar (Figura 1), que permite el control de las concentraciones de oxígeno y dióxido de carbono, así como las presiones de la temperatura, la humedad, y de cámara. Los valores de todos estos parámetros se registran continuamente para proporcionar un registro actualizado de todos los parámetros del aparato. Estos datos son una copia de seguridad en un servidor remoto todas las noches para proteger su integridad. El ordenador y el software se puede acceder de forma remota por los usuarios administrativos para evaluar y / o cambiar cualquier parámetro. Además, el equipo y el software se puede acceder de forma remota, lo que permite la evaluación interactiva de parámetros del aparato y solución de problemas con los usuarios locales. Una unidad de envío adicional de alarma está conectado al aparato de tal manera que los operadores de instalaciones de producción de células son notificados de cualquier condición de fuera de alcance del aparato. El acceso remoto capabilities permiten conectarse y evaluación de las características específicas de la condición de fuera de rango. El aparato está diseñado como un sistema modular tanto en una macro y micro un sentido. módulos de cultivo de células individuales, tales como incubadoras y cámaras de procesamiento, se pueden personalizar en cuanto a sus dimensiones y requisitos, así como en su diseño con respecto a la otra. Además, la mayoría de las funciones de control de los módulos individuales son en sí mismos modular de tal manera que los controladores individuales de gases atmosféricos, por ejemplo, puede reemplazarse fácilmente sin interrupción significativa al sistema. cámaras de tratamiento especializados, tales como uno para visualización y manipulación de los cultivos celulares al microscopio, se adaptan fácilmente al sistema. Tanto de contraste de fase y microscopio de fluorescencia están en el interior del sistema (Figura 6), de modo que las células se pueden teñir en vivo, y las colonias pueden ser diseccionados en las mismas condiciones atmosféricas como dentro de tél incubadoras. Enrutamiento de cables a través de los ojales selladas en las paredes laterales de la cámara de procesamiento permite a equipos tales como fuentes de alimentación y equipos para mantenerse fuera del aparato, por lo general en un carro (Figura 6). Las cámaras de tratamiento en las instalaciones de producción de células tienen un patrón de flujo de aire diferente que BSC convencionales. En BSC convencionales, el flujo de aire fluye hacia abajo desde una salida de escape central y se divide en dos corrientes separadas, que se recoge a continuación por dos entradas de aire diferentes en la parte de proa y popa del piso del gabinete. Por el contrario, la CPF tiene una sola abertura en la parte delantera del techo. El aire fluye hacia abajo y hacia la parte posterior de la cámara, donde luego se arrastra hacia arriba en una ventilación de entrada. Aunque la CPF es inherentemente muy limpio, este patrón de flujo de aire único significa que los técnicos tienen que ajustar ligeramente su técnica para reducir el riesgo de contaminación. Al igual que con un BSC convencional, un laboratorio trabajador should evitar colocar sus manos aguas arriba de las placas de cultivo de células abiertas y botellas de medios de comunicación. Sin embargo, la dirección que está aguas arriba ha sido alterado de la ACB El laboratorio planta de producción de células en sí es bastante estándar y viene equipado con un congelador -20 °, un congelador a -80ºC, a 4 ° C refrigerador, una centrífuga y un baño de agua. El laboratorio también tiene un fregadero con pedales de control para la operación de manos libres integrada. A fin de que este laboratorio para convertirse en una planta de producción de células clínico funcional, sin embargo, deben aún ser hechas varias modificaciones adicionales. En primer lugar, el aparato en sí mismo debe ser actualizado a tener la capacidad de supervisar los compuestos orgánicos volátiles, partículas, y las concentraciones de dióxido de cloro que se utiliza para la descontaminación. En segundo lugar, una cámara de procesamiento que contiene una máquina de FACS puede estar alojado y conectado al resto del aparato a través de un módulo de memoria intermedia. Esto permitirá la clasificación de células y purificación de trpoblaciones de células ansplantable en las condiciones ambientales adecuadas. Por último, todo el aparato debe ser alojado dentro de una pared blanda de sala limpia. Esto proporciona una Organización Internacional de Normalización clase (ISO) 8 entorno de los 5 aparatos. La alta esterilidad y la naturaleza controlada por ordenador de la ACB lo convierte en un sistema ideal para aplicaciones futuras con terapia basada en células y buenos procesos de fabricación. El riesgo de contaminación es mitigado en gran medida, pero lo más importante, las condiciones de la expansión celular se registran y archivada por el sistema de ordenador de forma automática. Las desviaciones en las concentraciones de gases, la temperatura, la humedad y todos los eventos de acceso en el sistema son rigurosamente documentados. Esto puede ser de gran ayuda en la investigación de problemas de calidad del producto. Sin embargo, todavía hay limitaciones. El uso de cualquier y todos los reactivos y materiales de construcción (por ejemplo, componentes de medios, pipetas, placas) se debe documentar por separado. Añadiritionally, hay una multitud de problemas potenciales (incluyendo muchas formas de error humano) que se vayan surgiendo y que no tienen ninguna relación con las variables documentadas por sistema de monitoreo de la ACB. Por lo tanto, la necesidad de personal altamente capacitado y documentación manual detallado de tareas permanece en su lugar.

Las técnicas estándar de cultivo de células madre sufren de varias limitaciones ambientales que ejercen presiones indebidas sobre las células y las exponen a riesgos inaceptables de contaminación. Entre las tensiones que las células pueden soportar en condiciones estándar de cultivo celular se encuentran cambios precipitados en los niveles de dióxido de carbono y concentraciones de oxígeno3,4. Esto ocurre cuando las células se trasladan de la incubadora a la cabina de bioseguridad y/o al microscopio, lo que puede no ser óptimo para las células. Estudios previos han confirmado las ventajas del cultivo de células madre pluripotentes y neurales en condiciones hipóxicas4,11 y, para obtener los mejores resultados, estas condiciones deben ser continuas. Además, los riesgos de contaminación celular son mayores, ya que el entorno y el personal del laboratorio inciden sobre las células en casi todas las etapas de su cultivo y manipulación. Las salas limpias tradicionales constituyen un método eficaz para disminuir en gran medida los riesgos de contaminación, pero son caras, ocupan un gran espacio y no abordan los factores estresantes relacionados con las concentraciones de dióxido de carbono y oxígeno. 
Una instalación de producción de células que puede abordar tanto los riesgos de contaminación como las concentraciones de gas y que puede calificarse para cumplir con los criterios cGMP9 proporciona células de alta calidad para la investigación en ciencias básicas, así como para aplicaciones clínicas1,6,7. Una instalación de producción de células de este tipo consta, como mínimo, de los siguientes componentes: una cámara de proceso, que actúa como espacio de trabajo calefactado para la alimentación y manipulación de cultivos celulares; una campana de flujo laminar, para la esterilización inicial de reactivos, tubos y herramientas; dos cámaras de amortiguación de esclusas entre la campana y la cámara de proceso; dos incubadoras de cultivos celulares accesibles desde la cámara de proceso; una cámara de microscopio adyacente a la cámara de proceso; y, por último, software informático para establecer y supervisar las condiciones dentro de estos módulos. Con esta infraestructura básica, se pueden realizar una amplia variedad de tareas, como la alimentación estándar y el paso de células madre pluripotentes y células madre neurales multipotentes, así como métodos más especializados como la reprogramación basada en el virus Sendai, los estudios de migración in vitro y la diferenciación de células madre neurales para la caracterización electrofisiológica.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xvivo System</td><td>Biospherix</td><td>hecho a</td><td></td> medida</tr><tr><td>Xvivo Software</td><td>Biospherix</td><td>versión i.o.2.1.2.1</td><td></td></tr><tr><td>O2 Colector</td><td>Amico</td><td>P-M2H-C3-S-U-OXY</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Colector</td><td>Amico</td><td>M2H-C3-D-U-CO2</td><td></td></tr><tr><td>N2 Colector</td><td>Western Innovator</td><td>CTM75-7-2-2-BM</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio con cámara DP21 y fluorescencia</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td><fuerte>Reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>StemPro hESC Suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>A100006-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Hidrolona de sodio tamponada con fosfato</td><td></td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de fibroblastos 2</td><td>R& D Systems</td><td>AFL233</td><td></td></tr><tr><td>Protide de sulfóxido de dimetilo</td><td></td><td>PP1130</td><td></td></tr><tr><td>Basado en Hank's Tampón de disociación celular</td><td>Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico</td><td>R& D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Oct-3/4 Anticuerpo</td><td>Millipore</td><td>AB3209</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Anticuerpo</td><td>Millipore</td><td>MAB4260</td><td></td></tr><tr><td>SSEA4 Anticuerpo</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>BIT-9500 Suero Suplemento</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Consumibles Consumibles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml pipeta serológica</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 ml pipeta serológica</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-102</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipeta serológica</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Pipeta serológica</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Pipeta serológica</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-107</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>placa de 12 pocillos</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Matraz T25</td><td>TPP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>Matraz T-75</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; l puntas de pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>22491130</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l puntas de pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>22491148</td><td></td></tr><tr><td>1.000 puntas de pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>22491156</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000.102</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>BDH</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Sanimaster 4</td><td>Ecolab</td><td>65332960</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bleach Clorox</td><td>A714239</td><td></td></tr></tbody></table>

el cultivo humanas pluripotentes y células madre neurales en un sistema de cultivo celular cerrado para la investigación básica y preclínica

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Este artículo describe cómo utilizar un sistema de cultivo celular cerrado fabricado a medida y disponible comercialmente para la investigación básica y preclínica. Las cabinas de bioseguridad (BSC) y las incubadoras han sido durante mucho tiempo el estándar para el cultivo y la expansión de líneas celulares para la investigación básica y preclínica. Sin embargo, a medida que el enfoque de muchos laboratorios de células madre cambia de la investigación básica a la traducción clínica, se necesitan requisitos adicionales del sistema de cultivo de células. Todos los procesos deben estar bien documentados y tener requisitos excepcionales de esterilidad y reproducibilidad. En las incubadoras tradicionales, las concentraciones de gas y las temperaturas fluctúan ampliamente cada vez que las celdas se retiran para alimentarlas, pasarlas u otras manipulaciones. Tales interrupciones contribuyen a un entorno que no es el estándar para las directrices cGMP y GLP. Estas interrupciones deben minimizarse, especialmente cuando las células se utilizan con fines terapéuticos. La motivación para pasar del sistema estándar de BSC e incubadora a un sistema cerrado es que tales interrupciones pueden ser insignificantes. Los sistemas cerrados proporcionan un espacio de trabajo para alimentar y manipular cultivos celulares y mantenerlos en un entorno controlado donde la temperatura y las concentraciones de gas son constantes. De esta manera, las células madre pluripotentes y multipotentes pueden mantenerse en un estado de salud óptimo desde el momento de su derivación hasta su uso final en la terapia.

Este manuscrito describe con cierto detalle una instalación de producción de células, y los aspectos únicos de cultivo de células dentro de un sistema cerrado. La mayor parte de las instalaciones de producción de células comprende un aparato de medida, cerrado, cultivo celular, que tiene un tamaño reducido y puede alojarse fácilmente dentro de un 6 x 7,5 m 2 habitación (Figura 2). En ningún momento son las células dentro del aparato expuesto a personal de laboratorio o ambiente. El aparato consiste en varios módulos: una cámara de proceso, una campana de flujo laminar, 2 cámaras de esclusa de aire en el almacenamiento en búfer entre la campana y la cámara de proceso, dos incubadoras de cultivo de células, y una cámara de microscopio adyacente a la cámara de proceso (Figura 3). El sistema es controlado por un software que permite a las variables ambientales pueden controlar y monitorizar (Figura 1). El equipo que ejecuta este programa se encuentra en un sistema de alimentación ininterrumpida. Los gases se introducen en THsistema de correo por un conjunto de colectores para oxígeno, nitrógeno y dióxido de carbono (Figura 4). Gases para el dispositivo están alimentados por sistemas múltiples que tienen dos juegos de tanques cada uno - un conjunto activo y un conjunto de reserva. Cuando el conjunto activo se dibuja hacia abajo, el colector cambia automáticamente a los tanques de reserva de reemplazo para fijar y personal. El poder está en un sistema generador de respaldo. Pluripotentes y células madre neurales pueden ser cultivadas en condiciones hipóxicas en esta instalación utilizando protocolos desarrollados anteriormente 9, con las complicaciones añadidas inherentes al equipo novela. Las células madre pluripotentes se pueden derivar usando virus Sendai, usando anticuerpos-pluripotencia específico para identificar colonias totalmente transfectadas, que luego se aislaron y expandieron. (Figura 5A y B), A partir de estos iPSCs, las células madre neuronales y neuronas se pueden derivar usando la inhibición dual SMAD, y su fenotipo USI verificados<html> ng anticuerpos NSC-específicos (Figura 5C y D). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" /> Figura 1. Interfaz gráfica para la instalación de pilas de Producción. (A) La representación gráfica de la ACB es la pantalla predeterminada y coincide con el dibujo CAD se muestra en la Figura 3. Un clic del ratón sobre el Buffer Módulo 1 (2F en la Figura 1) abre su pantalla de control (B), donde se establecen los valores de O2 para que coincida con la cámara de procesamiento (3 en la Figura 3). Del mismo modo, al hacer clic en el Proceso de Sala o Incubadora 1 trae sus respectivas pantallas de control (C y D, respectivamente), donde los valores pueden ser cambiados o monitoreados según corresponda.<html> rget = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" /> Figura 2. El mecanismo de producción de células. (A) El sistema como se ve desde una vista frontal derecha. Tenga en cuenta las conexiones eléctricas y de gas en el techo y el carro con los accesorios de microscopio y el ordenador a la derecha. (B) La campana de flujo laminar con las puertas de acceso a los módulos de tampón visto a la derecha. (C) La cámara de proceso con los dos incubadoras (puertas negras) visto en la parte trasera. (D) Una vista a través del lado derecho del sistema que muestra el microscopio y monitor con las puertas de las cámaras de amortiguamiento visto en la distancia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> t &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" /> Figura 3. Un dibujo de CAD de la Línea de Producción de la célula. Todos los artículos que entran en el dispositivo se limpió primero con alcohol y secado al aire en la campana de flujo laminar (1). Los productos son entonces la transición a la atmósfera apropiada en el módulo de almacenamiento intermedio frontal (2F) antes de ser pasado en el módulo UCPC, o Proceso de cámara (3). Las células se cultivan en las dos incubadoras (4, 5). Tinción de células vivas, la recolección de la colonia, la evaluación de la morfología celular general y análisis de la migración se lleva a cabo en el módulo de la UPC, o cámara del microscopio (6). Por último, los residuos sale del sistema a través del módulo de amortiguación trasera (2R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> &lt;<html> / P&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" /> Figura 4. Fuentes de gases y el poder. (A) El colector de CO 2 es una configuración de 4 x 4, ya que suministra todos los incubadores de laboratorio. (B) El colector de O 2 es una configuración y materiales de construcción solamente la instalación de producción de células 2 x 2. Nitrógeno para el sistema se genera en un vaporizador (C, justo por debajo de la señal de salida) unida a un colector de nitrógeno líquido (a la derecha), que también llena automáticamente cryofreezers (parte inferior izquierda). El colector es una configuración de 2 x 2 que se suministra por dos pares de tanques de nitrógeno líquido 160 L. CO2, O2 y N2 son suministrados desde el techo a través de válvulas de cierre (D). Casa de vacío también se suministra en esta ubicación. Ve justo detrás de las válvulas de cierre de gas de alimentación son un par de cables de alimentación que suministran energía al sistema.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" /> Figura 5. pluripotentes células madre derivadas de la hipoxia con el virus Sendai. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs CMPI (nomenclatura que se encuentran en Stover et al. 9), contraste de fase 10x. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs vivo-manchada de marcado AF-594 Tra-1-60, dilución 1: 100 en los medios de comunicación. Todas las células iPS fueron transducidas en las instalaciones de producción de células en 5% de O2 con el virus Sendai. (C) El contraste de fases de NSC-UH0-2I0-SC68.1-M0S13 N2G6 derivados de IPSC-, que se cultiva en el 5% de O2 en la cámara de diapositivas. Las células fueron fijadas en paraformaldehído al 4% y se tiñeron con el anticuerpo primario anti-nestina humano, y el anticuerpo secundario Alex-488. Todas las barras de escala son en 1001;. M <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí hay un protocolo para cultivar células madre pluripotentes (PSC) y células madre neurales (NSC) en un sistema de cultivo celular cerrado que permite la máxima esterilidad y reproducibilidad, reemplazando el gabinete de bioseguridad y la incubadora tradicionales. Este equipo cumple con las pautas de buenas prácticas clínicas de fabricación (cGMP) y buenas prácticas de laboratorio clínico (cGLP).

El cultivo humanas pluripotentes y células madre neurales en un sistema de cultivo celular cerrado para la investigación básica y preclínica

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

El objetivo general del uso de este equipo es cultivar células madre en condiciones atmosféricas definidas con máxima esterilidad. Lo que vamos a demostrar hoy es el uso de una instalación celular cerrada que permite un control excelente sobre los parámetros del cultivo celular. En nuestro laboratorio, estamos utilizando esta instalación para el cultivo de células madre multipotentes y células madre pluripotentes.La principal ventaja de este método es que las células están expuestas a un entorno constante sin importar su ubicación durante el procesamiento. Ya sea manipulando las células, en el incubador o en el microscopio, su exposición al oxígeno, CO2 y temperaturas permanece constante durante todo el ciclo. La realización del procedimiento será demostrada por Alexander Stover, un científico del personal en mi laboratorio.Para comenzar este procedimiento, haga clic en un módulo para ajustar la concentración de gas. En la nueva ventana que muestra la configuración actual, haga clic en el valor existente del punto de consigna de oxígeno debajo de Consigna e ingrese la concentración de oxígeno requerida para este módulo. A continuación, haga clic en la marca de verificación verde para confirmar el punto de consigna.Repita este procedimiento para el dióxido de carbono e ingrese un valor de consigna de 5 % de dióxido de carbono para todos los módulos, excepto para las cámaras de tampón, que solo son ajustables para oxígeno. Luego, supervise las concentraciones actuales de gases, etiquetadas como Valores de Proceso, para asegurarse de que alcancen los nuevos valores de consigna. Posteriormente, ajuste los valores de consigna de gas de todos los módulos a los valores adecuados.Iguale los niveles de dióxido de carbono y oxígeno en las cámaras que estarán expuestas entre sí. Por ejemplo, ajuste la cámara de proceso a 5% de oxígeno antes de abrir un incubador que cultiva células a 5% de oxígeno. También ajuste la cámara de amortiguación utilizada para añadir elementos a la cámara de proceso a 5% de oxígeno.Posteriormente, establezca la temperatura de la cámara de proceso en 37 grados celsius utilizando la misma pantalla para ajustes de gas. A continuación, fije la temperatura del piso de la cámara de proceso en 37 grados celsius. Haga clic en los bancos del módulo de incubación debajo de cada incubadora y ajuste la temperatura de los bancos a 37 grados celsius.En la cabina de flujo laminar, rocíe todos los materiales que se introducirán al sistema con etanol al 70% y déjelos secar. Limpie suavemente los frascos o placas con células con una gasa estéril saturada con etanol al 70%. A continuación, asegúrese de que tanto la puerta exterior como la interior de la cámara de paso estén firmemente cerradas, abra la puerta exterior e introduzca los elementos antes de cerrarla nuevamente.Utilizando el software, seleccione el módulo de tampón y haga clic en la pestaña Factor de Dilución. Ingrese uno en el cuadro Logaritmo del Factor seguido de hacer clic en iniciar. Una vez que la interfaz gráfica haya dejado de parpadear en Factor de Dilución, abra la puerta interna de la cámara de tampón y transfiera los materiales a la cámara de proceso.Para retirar elementos de la cámara de proceso, primero asegúrese de que la cámara tampón haya pasado por un factor de dilución. Luego, abra la puerta interna, coloque dentro los elementos que se retirarán y ciérrela. A continuación, abra la puerta externa y retire los elementos.Coloque tres placas de Petri en la bandeja de agua en la base de cada incubadora. Llene estas placas con agua estéril y mantenga el nivel de agua en ellas, ya que son fundamentales para mantener el punto de consigna de humedad relativa en la incubadora. En la interfaz gráfica, haga clic en la incubadora.Posteriormente, haga clic en el valor existente de humedad relativa bajo el punto de consigna e introduzca 85 %. A continuación, haga clic en la marca de verificación verde para aceptar este valor. Luego, ajuste las cámaras de amortiguación, la cámara de proceso y una incubadora a los puntos de consigna de gas requeridos para el tipo de células que se van a introducir. Limpie la superficie de la cámara de proceso con gasa estéril y un desinfectante no inflamable, como un producto a base de cloruro de benciloamoniaco.Luego, limpie los guantes y las superficies que se tocan comúnmente, como las manijas de las puertas. Posteriormente, limpie la superficie de la Cabina de Flujo Laminar y la cámara de amortiguación con etanol al 70% y deje que se seque. Después de eso, coloque el frasco o placa de células dentro de la cabina y limpie brevemente su superficie exterior con una gasa estéril saturada con etanol.Luego, coloque el matraz o la placa en la cámara de amortiguador y realice un factor de dilución. Al finalizar, transfiera inmediatamente el matraz o la placa al incubador correspondiente. Dado que el incubador se encuentra en la parte trasera de la cámara de proceso, saque una bandeja hacia la cámara de proceso para colocar las células y evite abrir las puertas del incubador innecesariamente durante períodos prolongados.En este paso, prepare el medio de cultivo celular. Permita que el medio se equilibre con los niveles de dióxido de carbono y oxígeno presentes en el sistema dejando el recipiente del medio ligeramente destapado durante 20 minutos. Posteriormente, retire el medio antiguo de los pocillos.Para células madre pluripotentes, retire casi todo el medio antiguo dejando una pequeña cantidad del medio antiguo restante para prevenir la desecación durante el proceso de alimentación. Para células madre neurales, retire la mitad del medio antiguo. Luego, agregue medio fresco a las placas de cultivo celular y coloque las placas nuevamente en su incubadora designada.Se muestra aquí una imagen de las iPSC. Estas iPSC están teñidas en vivo con Trial 160 marcado con AF594 con una dilución de uno a 100 en medio. Todas las iPSC fueron transducidas en la instalación de producción celular en un 5% de oxígeno con virus Sendai.Y aquí se muestra la imagen de contraste de fase de células madre neurales derivadas de iPSC que se cultivaron en un 5 % de oxígeno en portaobjetos con cámara. Las células se fijaron luego en paraformaldehído al 4 % y se tiñeron con el anticuerpo primario Anti-Human Nestin y el anticuerpo secundario Alexa Fluor 488. Una vez dominado, este conjunto de técnicas puede realizarse en dos horas si se lleva a cabo correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar configurar correctamente las concentraciones de gas antes de comenzar. Tras seguir el procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la reprogramación y la diferenciación para responder preguntas adicionales, como el efecto de la hipoxia sobre la pluripotencia o la multipotencia. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología de células madre exploraran la producción clínica de células para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos pediátricos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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Pases células madre neurales humanas

Un método sencillo y fiable en el aislamiento y cultivo de células madre neurales en humanos descartados tejido cortical fetal se describe. Cultivos derivados de enfermedades neurológicas conocidas humanos pueden ser utilizados para la caracterización de los patológicos procesos celulares y moleculares, así como ofrecer una plataforma para evaluar la eficacia farmacológica.

Generación de las células troncales nerviosas de desechados Humanos tejido cortical fetal

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Una Cultura Modelo Novela de Pluripotentes Stem Cell Propagación de gelatina en Media Placenta acondicionado

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Microcircuito sináptica modelado con 3D Cocultures de astrocitos y neuronas de células madre pluripotentes humanas

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El cultivo humanas pluripotentes y células madre neurales en un sistema de cultivo celular cerrado para la investigación básica y preclínica (Video) | JoVE Journal

El cultivo humanas pluripotentes y células madre neurales en un sistema de cultivo celular cerrado para la investigación básica y preclínica

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