Name: A Magnetic Microbead Oclusión Modelo para inducir hipertensión ocular dependiente de glaucoma en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Aprende a inducir hipertensión ocular en ratones mediante la inyección de microesferas magnéticas en la cámara anterior. Este método reproduce fielmente el glaucoma y permite estudiar los cambios patológicos tempranos antes de la muerte de células ganglionares retinianas.

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Los autores desean agradecer a los Dres. David Calkins (Universidad de Vanderbilt) y James Morgan (Universidad de Cardiff) por compartir su experiencia y por sus útiles consejos para desarrollar este procedimiento. Este estudio fue apoyado por subvenciones de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (A.D.P.). Y.A.I. y N.B. son beneficiarios de becas postdoctorales del Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS). N.B. ha sido galardonado con una beca H.H. Jasper del Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central (GRSNC). A.D.P. es una FRQS Nacional de Chercheur Boursier.

El siguiente procedimiento se llevó a cabo de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de los Animales para el Uso de Animales Experimentales y de la Declaración para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y Visual de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO). 1. Preparación de la microaguja para anterior intracameral Inyección <ol><li> Con un extractor, generar una microaguja a partir de un capilar de vidrio de borosilicato </li><li> Bajo el microscopio, utilizar una hoja afilada cuidadosamente para crear una abertura en la punta de la microaguja. La apertura resultante debe tener una forma elíptica con un diámetro mayor y eje menor de aproximadamente 190 micras y 70 micras, respectivamente. Medir el área de la abertura de microagujas preparado por primeras imágenes que adquieren con una regla colocada bajo el microscopio seguido por la cuantificación usando software de análisis de imágenes. </li><li> En el sistema de biselado micropipeta, coloque la microaguja en un 20 degree ángulo respecto a la placa de biselado de manera que la abertura de microagujas está en contacto con la placa. Bevel durante aproximadamente 10 min hasta que los bordes son plana y lisa. Añadir unas cuantas gotas de agua destilada para ayudar en el proceso. </li><li> Girar la microaguja para biselar los dos bordes que rodean la abertura hasta que la punta está afilada. </li><li> Limpiar toda la suciedad y el agua de la abertura de la punta de microagujas usando un plumero de aerosol. </li><li> Examine cuidadosamente la microaguja acabada con un microscopio. microagujas de descarte con fracturas para reducir al mínimo el riesgo de que se rompa durante la cirugía de microagujas. </li><li> Esterilizar la microaguja enjuagando primero con etanol, luego con solución salina equilibrada estéril (BSS). </li></ol> 2. Preparación de la solución Microbead Magnética Nota: Las microperlas magnéticas utilizadas en este estudio se recubren con grupos epoxi. Para evitar los efectos adversos, tales como la aglutinación de las perlas y las interacciones moleculares deseados, estos grupos epoxi debeprimero ser retirado de las microperlas antes de proceder con la cirugía de la inyección. <ol><li> La eliminación de los grupos epoxi de perlas magnéticas <ol><li> Preparar una solución de hidróxido de sodio 0,02 M (NaOH, MW 39.997 g / mol) en 10x tampón Tris (MW 121.14 g / mol). </li><li> Vórtice suavemente el stock de solución microbead magnética (4,5 m de diámetro, 4 x 10 8 perlas / ml) hasta que las perlas se suspendieron de manera uniforme en la solución. </li><li> pipetear rápidamente 1 ml de solución de perlas magnéticas en 50 ml de NaOH 0,02 M en tampón 10x Tris. </li><li> Rotar durante 24 horas a RT para eliminar los grupos epoxi de las perlas. </li><li> Recoger las perlas asegurando un imán a la parte inferior del tubo. Oriente el tubo horizontalmente para asegurar que todos los granos son atraídos por el imán. Gire durante 4 horas adicionales a temperatura ambiente. </li><li> Con una micropipeta, retirar con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento de perlas. </li><li> vórtice suavemente el sedimento en 50 ml de 10x Tris tampón hasta que las cuentas están bien suspendidos. </li><li> Repita los pasos 2.1.4 a 2.1.6. </li></ol></li><li> La concentración y la resuspensión de las microperlas magnéticas en solución salina equilibrada estéril </li></ol> Nota: Es necesario concentrar el stock de solución de perlas magnéticas en solución salina equilibrada estéril (BSS) para alcanzar una concentración final de 1,6 x 10 6 perlas / l de modo que 2,4 x 10 6 perlas pueden ser inyectados en la cámara anterior en una volumen final de 1,5 l, que es apropiado para el ojo pequeño ratón. <ol><li> Lavar las perlas en 5 ml de agua ultra pura de grado de laboratorio mediante agitación suave durante 2 min. </li><li> Recoger las perlas por atraer a la parte inferior del tubo con un imán. </li><li> Con una micropipeta, retirar con cuidado el agua sin alterar el sedimento de perlas. </li><li> Repita los pasos 2.2.1 a 2.2.3 tres veces más. </li><li> En una campana de flujo laminar, lavar las perlas con 500 l de NBS por pipetting arriba y hacia abajo. Realice los pasos restantes de esta sección en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. </li><li> Recoger las perlas por atraer a la parte inferior del tubo con un imán. </li><li> Con una micropipeta, retirar con cuidado el BSS sin perturbar el sedimento de perlas. </li><li> Repita los pasos 2.2.5 a 2.2.7 tres veces más. </li><li> Volver a suspender pipeteando las cuentas arriba y hacia abajo en 250 l de BSS. </li><li> Asegúrese de que la solución de bolas está bien homogeneizada. Entonces, rápidamente alícuota de 25 l de la suspensión en recipientes estériles de tubos de 0,5 ml. La concentración final de la solución madre de perlas es de 1,6 x 10 6 perlas / l. </li><li> Almacenar a 4 ° C. </li></ol> 3. La inducción de la hipertensión ocular Nota: La sección 3 es una operación de dos personas. En el caso de que una acción específica debe ser realizada por una persona específica, se identifica a la persona adecuada. En general, la Persona 1 maneja el ratón bajo el microscopio, mientras que la Persona 2 es responsable para manipular la bomba microjeringa. La duración total del procedimiento quirúrgico debe ser inferior a 10 min (pasos 3.9 a 3.17). <ol><li> Realizar procedimientos en ratones C57BL / 6 adultos. Los ratones domésticos en un entorno estándar con acceso a comida y agua ad libitum. En este papel, utilice la hembra C57BL / 6 ratones de entre 3 y 4,5 meses de edad. Sin embargo, este protocolo se puede adaptar a los machos y ratones de diferentes edades, así como otras cepas de ratón, incluyendo ratones transgénicos y knockout. </li><li> Medir la PIO basal en ratones despiertos antes de la inyección de anestesia y microbead utilizando un tonómetro de rebote calibrado. Aplicar una gota de clorhidrato de proparacaína en la córnea. <ol><li> frenar suavemente el ratón mediante la celebración de la piel entre las orejas. Coloque el ratón en la mesa de trabajo de modo que el animal está cómodo y los ojos son accesibles. Mantenga el tonómetro perpendicular a la superficie de la córnea y tomar al menos tres series de diez lecturas consecutivas por cada ojo para obtener unala media de la PIO. Se prefiere la medición de la PIO en ratones despiertos para eludir los efectos relacionados con la anestesia en la PIO. Alternativamente, se puede medir IOP en ratones anestesiada después de la etapa 3.4. </li></ol></li><li> Preparar una mezcla de anestesia cóctel stock ratón compuesta de 20 mg / ml de ketamina, 2 mg / ml de xilazina y 0,4 mg / ml de acepromazina. </li><li> Inducir la anestesia en el ratón mediante la administración intraperitoneal de la mezcla de cóctel (1 l / g de peso corporal). El uso de un cóctel anestésico inyectable se prefiere sobre los anestésicos de gas (por ejemplo, isoflurano), ya que permite flexibilidad al manipular la cabeza de ratón como el animal no está conectado a una máscara de inhalación. Además, el periodo de recuperación más largo requerido con un anestésico inyectable se asegura de que las microperlas se depositan en el ángulo iridocorneal sin desplazar de nuevo en la cámara anterior. </li><li> Administrar 0,05 mg por kg de peso corporal por vía subcutánea de buprenorfina. </li><li> Tratar el ojo con una ey tropicamidae soltar para inducir dilatación de la pupila. Debido al tamaño pequeño de la cámara anterior murino, el alumno debe ser dilatado para visualizar fácilmente el posicionamiento y el avance de la microaguja durante la inyección. </li><li> Aplicar la pomada tópica en el ojo contralateral (no operada) para evitar la desecación de la córnea durante el procedimiento. </li><li> Adjuntar una microaguja limpia para el conjunto de inyección de la bomba microjeringa. Vuelva a colocar la microaguja después de cada operación para evitar la contaminación cruzada de los animales. </li><li> Persona 1: Transferir el ratón anestesiado a la plataforma operativa. Bajo el microscopio, asegúrese de que la pupila está completamente dilatado y que los músculos oculares están relajados de modo que no hay movimiento del ojo. La ausencia de movimientos oculares asegura la estabilidad durante la inyección. limpie con cuidado el colirio de tropicamida del ojo utilizando hisopos absorbentes. </li><li> Persona 2: Mezclar la solución microbead magnética pipeta hacia arriba y hacia abajo. </li><li> El uso de la bomba microjeringa, cargar inmediatamente el microneedle (preparado en el apartado 1) con 1,5 l de la solución homogeneizada microbead magnética (2,4 x 10 6 bolas). Asegurarse de que las burbujas de aire están ausentes en la punta de la microaguja. Una vez cargado el microagujas, realice los pasos 3.12 a 3.13 lo más rápido posible para que la solución microbead magnética permanece en una suspensión homogénea. </li><li> Coloque la microaguja cargado en un ángulo de 45 °, colocado en sentido anterior con relación al limbo. Persona 1: apoyar el ojo con unas pinzas de plástico. Asegúrese de que el ángulo entre la microaguja y las pinzas de plástico es de aproximadamente 90 °. </li><li> Persona 2: Con la microaguja cargado, perfore suavemente la córnea de modo que la punta de la microaguja penetra en la cámara anterior. Asegúrese de que la microaguja cargado se mantiene en un ángulo de 45 ° con relación al limbo durante la punción. Evitar cualquier contacto con la lente o el iris. Asegúrese de que la microaguja no entra en la cámara posterior. Persona 1: continúan apoyando el ojoutilizando pinzas de plástico. </li><li> Persona 1: Sin mover la cabeza de ratón, coloque el imán al lado del ojo, frente a la punta de microagujas, para atraer a las perlas magnéticas en la cámara anterior y minimizar el contacto de las perlas con la superficie interior de la córnea. Persona 2: El uso de la bomba Inyectar 1,5 l de la solución de perlas magnéticas en la cámara anterior. La solución de microperlas se inyecta durante un periodo de 15 a 30 seg. Persona 1: Continúe sujetando el imán opuesto a la punta de microagujas durante toda la duración de la inyección. </li><li> Persona 2: Una vez que se ha inyectado el volumen total de cuentas, retirar lentamente la microaguja del ojo. Persona 1: Para evitar el reflujo de las microperlas, siguen atrayendo a las perlas magnéticas hacia la cámara anterior manteniendo el imán al lado del ojo de un adicional de 30 a 60 seg. </li><li> Persona 1: Usando el imán, atrae a las cuentas del ángulo iridocorneal. Asegúrese de que los granos forman un anillo uniformemente distribuidaalrededor de la circunferencia de la cámara anterior. Durante este paso, evitar atraer perlas a la córnea, ya que tienen una tendencia a pegarse a la superficie interior de la córnea tras el contacto. </li><li> Se trata el ojo operado con un colirio antibiótico para minimizar el riesgo de infección. </li><li> Deje que el ratón para recuperarse de una almohadilla de calor hasta que esté completamente despierto (~ 3 a 4 horas). Coloque el ratón de modo que el ojo operado esté orientado hacia arriba. Este posicionamiento evitará la acumulación de las perlas inyectados a la superficie interior de la córnea por fuerza de gravedad. Además, esta posición disminuirá el potencial de infección como el ojo operado no estará en contacto con la ropa de cama y / o de otros materiales que pueden estar presentes en la jaula. En el caso de que un animal muestra ningún signo de sufrimiento, administrar dosis adicionales de buprenorfina, según sea necesario. </li><li> Permitir a los ratones para recuperarse del procedimiento durante al menos 2 días antes de tomar mediciones de la PIO. Medir la PIO como se describe en 3.2. monitor IOP al menos una vez a la semana o con mayor frecuencia, según sea necesario, y, al mismo momento del día para minimizar las fluctuaciones relacionadas con circadianos. </li><li> Para mediciones de la PIO, utilizar el ojo contralateral desde el ratón operado como un control interno. Como alternativa, se emplean mediciones de controles intactos, que no son operados o ratones con operación simulada como ingenuos. </li></ol> 4. Evaluación de la célula retiniana de Soma y Axon Supervivencia <ol><li> Perfundir ratones sometidos a la hipertensión ocular por inyección intracardiaca de la solución de 0,1 M de tampón de fosfato (PBS), seguido inmediatamente por el frío de hielo 4% de paraformaldehído (PFA). </li><li> Perfundir ratones intactos, no operados como se describe en 4.1 y utilizarlos como controles no lesionados. No se recomienda el uso de los ojos contralaterales de ratones operados para evaluar la supervivencia de CGR, porque los cambios en los ojos contralaterales después de la lesión se ha informado de 15,16 y pueden confundir la interpretación de los datos. Por otra parte, el uso de los ojos con operación simulada inyectados con 1.5 L de BSS como controles. </li><li> El uso de micro tijeras, corte con cuidado el tejido conectivo alrededor del ojo para aislarlo de la cuenca del ojo. Separar el nervio óptico del ojo mediante la reducción en el nivel de la cabeza del nervio óptico. </li><li> Usando una aguja G 30, hacer un agujero en la córnea para permitir la penetración de la solución de fijación en el ojo. Coloque el ojo en 4% PFA y se incuba durante 1 hora a 4 ° C para la fijación adicional. </li><li> Coloque el nervio óptico en una solución que contiene 2% PFA y 2,5% de glutaraldehído en cacodilato de sodio 0,1 M (MW: 214 g / mol) y se incuba O / N a 4 ° C para la fijación adicional. </li></ol> 5. Las retinas La cuantificación de las CGR Soma densidad sobre el Flat-montados Nota: El siguiente procedimiento es una adaptación de un protocolo por el Nadal-Nicolas et al 17 y describe la cuantificación de la CGR utilizando un anticuerpo contra el homeobox / POU dominio de la proteína 3A-específica del cerebro (Brn3a) en montajes planos de la retina.. met alternativaSAO para CGR etiquetado también se puede utilizar incluyendo inmunohistoquímica con un anticuerpo contra la proteína de unión al ARN con empalme múltiple (RBPMS) o el etiquetado retrógrada con Fluorogold o DiI. <ol><li> Bajo un microscopio de disección, retirar la parte anterior del ojo mediante una incisión a lo largo de todo el limbo hasta la córnea se separa fácilmente. Retire la córnea y el cristalino. separar cuidadosamente la retina del ojo, mediante cortes a lo largo de la ora serrata y el nervio óptico. </li><li> Preparar un montaje plana de la retina al hacer cuatro pequeñas incisiones equidistantes de la periferia de la retina hacia el nervio óptico para delimitar claramente los cuatro cuadrantes de la retina. El uso de un cepillo pequeño, retire con cuidado vítreo restante de la retina. La extirpación de tanto humor vítreo como sea posible es crucial para obtener una señal de inmunohistoquímica limpia y fuerte. </li><li> transferir cuidadosamente la retina a una placa de cultivo de fondo de 48 pocillos plana que contiene 0,5% de Triton X-100 en PBS de manera que la retina esde libre flotación. Asegúrese de que la capa de células ganglionares está orientado hacia arriba. </li><li> Coloque la placa de cultivo a -70 ° C durante 15 min. Después de descongelar las retinas, más permeabilizar por lavado dos veces en fresco 2% de Triton X-100 en PBS. </li><li> Diluir el anticuerpo Brn3a a 0,3 a 0,5 g / ml con PBS que contenía 2% de Triton X-100 y 2% de suero normal de burro. Incubar la retina en la solución de anticuerpo primario Brn3a agitando suavemente O / N a 4 ° C. Las retinas deben estar completamente inmersos en 150 a 200 l de solución en todo momento. </li><li> Diluir el anti-anticuerpo secundario de cabra IgG de burro a 2 mg / ml con PBS que contenía 2% de Triton X-100 y se incuba la retina en esta solución durante 2 horas a RT con agitación suave. La retina debe estar completamente sumergido en la solución de anticuerpo en todo momento. Cubrir la placa de cultivo con papel de aluminio para el resto de pasos para evitar photobleaching. </li><li> Usando un cepillo, transferir cuidadosamente la retina a un portaobjetos de modo que el tejido se encuentra tan plano como possible. Deje secar al aire durante 10 minutos. Montar utilizando medio de montaje anti-fade. </li><li> Examinar los montajes planos de la retina bajo un microscopio de fluorescencia. Cuantificar el número de CGR Brn3a positivos en tres áreas que no se solapan por cuadrante retiniano como se describe. 18 </li></ol> 6. Cuantificación de las CGR axones en el nervio óptico Secciones representativas <ol><li> Recoger el nervio óptico desde el paso 4.5 y se incuban en un 2% tetróxido de osmio (OsO4, MW 254.23 g / mol) durante 2 horas. Precaución: Debido a su alta toxicidad, tetróxido de osmio debe ser manejado en una campana extractora con traje de laboratorio adecuada. </li><li> Deshidratar el nervio óptico sumergiéndolo en concentraciones de etanol creciente (50%, 70%, 90%, 95% y 100%) durante 15 minutos cada uno. </li><li> Mezclar la resina epoxi usando la siguiente receta: 15.72 ml Insertar-812, 6,45 ml dodecenilo anhídrido succínico, 7,83 ml de anhídrido nádico de metilo, 0,45 ml DMP-30. </li><li> Secuencialmente incubar el nervio óptico en soluciones compuestasde las siguientes proporciones de resina epoxi a óxido de propileno (MW 58,08 g / mol): 0: 1, 1: 1, 0,75: 0,25, y 1: 0. Se incuba el nervio óptico en cada solución a TA durante una O / N período. </li><li> Incubar nervios ópticos embebidos en resina 100% epoxi (último paso de 6,4) a 60 ° C durante una 48 h adicionales. </li><li> Generar secciones transversales del nervio óptico semi-delgadas (0,75 m) utilizando un microtomo. </li><li> Teñir secciones transversales del nervio óptico con 1% de azul de toluidina. </li><li> Cuantificar los axones de CGR en cinco áreas no superpuestas de cada sección del nervio óptico como se ha descrito 19. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La técnica de video presentado aquí proporciona instrucciones detalladas paso a paso sobre cómo realizar la inyección intracameral de microperlas magnéticas para inducir de manera eficaz y reproducible aumento de la PIO en ratones. Este procedimiento resulta en aumento de la PIO sostenida que no requiere inyecciones adicionales y promueve detectable soma RGC y la pérdida de axones dentro de las primeras 3 semanas de la hipertensión ocular induction.Elevated PIO es un factor de riesgo para desarrollar glaucoma en los seres humanos. Por lo tanto, este es un valioso modelo de glaucoma hipertensión dependiente ocular murino que tiene el potencial para una amplia gama de aplicaciones. Un inconveniente común asociado con la inyección de microperlas en la cámara anterior se refiere a talón de reflujo a través del sitio de la inyección cuando se retira la aguja, que a menudo resulta en solamente una obstrucción parcial del flujo de salida acuoso y aumento de la variabilidad. Para abordar esta cuestión, se llevaron a cabo varias modificaciones importantes. abetos<html> t, la cuidadosa preparación de una, de microagujas de vidrio limpio y afilado con un bisel facetado es esencial para la inyección con éxito de las microperlas. Una microaguja adecuadamente preparado permite la penetración controlada y suave de la córnea con una mínima aplicación de presión a la superficie ocular delicada. La pequeña punción corneal evita el reflujo de microperlas. Además, la multa de microagujas reduce el riesgo de las estructuras cercanas perjudiciales tales como el iris y el cristalino, lo que podría dar lugar a la inflamación no relacionados con la enfermedad. En segundo lugar, la aplicación de un imán de mano a las zonas oculares estratégicos durante y después de la inyección es otro aspecto crítico de esta técnica. Durante la inyección, el imán se utiliza para dibujar las microperlas magnéticas para la cámara de prevención de reflujo anterior de las microperlas cuando se retira la microaguja. Después de la inyección, el imán se utiliza para dirigir las microperlas al ángulo iridocorneal de bloquear la salida del humor acuoso. tienda &quot;&gt; Otro problema frecuente en los modelos de oclusión de microesferas es que las inyecciones repetidas de talón a menudo son necesarias para lograr un desarrollo sostenido elevación de la PIO 10,11. Esto podría ser el resultado de microperlas desalojando a partir del ángulo iridocorneal con el tiempo. La combinación de un imán de mano, como se describió anteriormente, y el posicionamiento del ratón después de la operación mejora en gran medida el resultado. el uso de los anestésicos inyectables, que permiten flexibilidad para mover la cabeza durante el procedimiento y requiere un periodo de recuperación más largo después de la operación, se ve favorecida. la colocación de la ratón con el ojo operado hacia arriba durante un par de horas después de la cirugía contribuye a la solución de microperlas en el ángulo iridocorneal y disminuye el riesgo de desalojar de nuevo en la cámara anterior. Asegurarse de que el número de cuentas inyectadas es relativamente consistente es un paso fundamental para minimizar las variaciones entre animales. Dado que las microperlas se depositan en el bottom del tubo, es necesario para homogeneizar completamente la solución de microperlas y retirar el volumen apropiado en la microaguja en una manera oportuna. La inyección de un menor número de granos en la cámara anterior podría resultar en la obstrucción incompleta de las estructuras de drenaje acuosas humor, que es probable que resulte en pobres o variable elevación de la PIO. Es de destacar que, aunque el fin último de la inyección microbead es elevar la PIO, se debe tener cuidado cuando las mediciones de la PIO de los ratones despiertos son más altos que los valores máximos reportados en este estudio (~ 25 mm Hg). Extremadamente altas IOP aumentan el riesgo de daño isquémico y también pueden causar dolor al animal. La elevación de la PIO debe ser considerada como uno de los muchos factores para evaluar el éxito de la cirugía. Como tal, el resultado del procedimiento debe ser calibrada en función de varios parámetros, incluyendo la elevación de la PIO, RGC muerte soma, y ​​la pérdida de axón. Aunque el protocolo descrito aquí resulta en la mayoría de las microperlas de éxitoLy sedimentación en el ángulo, una limitación potencial de este modelo es que los granos que permanecen flotando en la cámara anterior podrían interferir con la imagen de la retina en vivo a través de la córnea, así como ensayos electrofisiológicos y de comportamiento que requieren el paso eficaz de la luz. Otro aspecto importante a considerar cuando se utiliza este modelo de oclusión microbead es que el grado de elevación de la PIO y la posterior degeneración de RGC varía con la edad y los antecedentes genéticos del ratón operado [4]. Por lo tanto, tendrá que ser determinado para cada línea específica de ratón transgénico y / o rango de edad el grado de elevación de la PIO y la línea de tiempo de la degeneración de las CGR. Una característica de este modelo es que los resultados de la PIO elevada en la pérdida gradual de la muerte de CGR durante las primeras tres semanas después de la inyección microbead y significativa la muerte de CGR se detecta a las 3 semanas después del procedimiento. Por lo tanto, este modelo permite el examen de los cambios tempranos y / o sutiles que se producen en este dNFERMEDAD, antes de la RGC abierta soma y la pérdida axonal. Un aumento significativo en la muerte de CGR no se observó entre 3 y 6 semanas después de la inducción de la hipertensión ocular. De hecho, RGC soma y axón pérdida se mantuvo estable en ~ 22 - 25% entre 3 y 6 semanas a pesar del éxito y sostenido aumento de la PIO en estos puntos de tiempo. Una mayor duración de la PIO sostenida puede ser necesario para la pérdida adicional RGC a ocurrir en ratones C57BL / 6, que parecen ser más resistentes a los daños RGC en comparación con otras cepas de ratón. 5 modificaciones adicionales al protocolo que se presenta aquí, incluyendo el ajuste de tamaño de las perlas y las inyecciones adicionales, podrían ser necesarias para estudiar la pérdida de RGC en puntos de tiempo posteriores. Por lo tanto, nuestro protocolo es ideal para estudios se centraron en los cambios fisiopatológicos primeros que se correlacionan con la neurodegeneración modesta RGC que son relevantes para inicio y la progresión temprana en el glaucoma humano.

El glaucoma es una enfermedad progresiva e irreversible cegadora que afectará a un estimado de 80 millones de personas en todo el mundo para el año 2020 1. En los pacientes con glaucoma, pérdida de la visión es causada por la muerte selectiva de las células ganglionares de la retina (CGR), las neuronas de salida que transmiten la información visual del retina al cerebro. El glaucoma es una enfermedad neurodegenerativa asociada a la edad con muchos factores de riesgo de los cuales el más común es la presión intraocular (PIO) elevada. De hecho, la PIO es el único factor de riesgo modificable en el glaucoma y los tratamientos actuales se centran exclusivamente en la gestión de la presión ocular. Sin embargo, múltiples factores genéticos, celulares y ambientales afectan a la aparición y progresión de esta enfermedad. Por lo tanto, la comprensión de los diversos mecanismos que contribuyen en última instancia, a la muerte neuronal es esencial para desarrollar tratamientos efectivos para el glaucoma. Los modelos animales de glaucoma son esenciales para estudiar la fisiopatología de la enfermedad y para identificar y pruebaterapias prometedoras. La creciente disponibilidad de líneas de ratones transgénicos que incluyen cepas de ratones knock-out condicionales y que llevan los marcadores fluorescentes codificadas genéticamente ha impulsado la necesidad de modelos murinos con glaucoma inducibles. Varios modelos de roedores de glaucoma se han desarrollado durante los años (revisado en 2,3). En muchos de estos modelos, el glaucoma se induce mediante la interrupción de la dinámica del humor acuoso, lo que resulta en la elevación de la PIO. Modelos de oclusión, en el que se inyectan microperlas u otras sustancias en la cámara anterior del ojo para bloquear el drenaje acuoso, han ganado popularidad en los últimos años, en parte debido a su relativa facilidad para aumentar la IOP 4-14. El modelo de microperlas oclusión de glaucoma, llevado a cabo primero en primates 12, conejos y ratas 8, 4,9,11, fue adaptado recientemente para su uso en ratones 5,6,10. En estos estudios, la inyección intracameral de microperlas de poliestireno, solo o encombinación con un material viscoelástico, dio lugar a elevación de la PIO que conduce a la posterior muerte de CGR 6,10. Sin embargo, el reflujo cuando la aguja se retira del ojo y se salga de microperlas a partir del ángulo iridocorneal son problemas comunes que surgen durante el procedimiento. Para reducir al mínimo estos inconvenientes, los imanes se han utilizado para atraer las microperlas magnéticas para el ángulo iridocorneal del ojo 4,9. El protocolo se describe aquí es un procedimiento modificado basado en estudios previos 9,10 que utilizan microperlas magnéticas y un imán de mano adaptado para el ojo de ratón (Figura 1). Varias modificaciones importantes se han introducido en el protocolo para asegurar aumento de la PIO eficaz y reproducible en ratones. En primer lugar, la inyección de microperlas se hace usando una microaguja de vidrio cuidadosamente preparada con un bisel facetado. Las superficies lisas resultantes de la microaguja, así como su punta afilada se asegura de que un daño mínimo esinfligido ya que perfora la córnea. El uso de este microaguja de vidrio también se traduce en un mayor control cuando la punta de microagujas entra en la cámara anterior, reduciendo así el riesgo de las estructuras cercanas perjudiciales tales como el iris y la lente. Además, la pequeña lesión inyección facilita la auto-reparación de la córnea y reduce los efectos no deseados relacionados con la lesión. En segundo lugar, la inyección de microperlas magnéticas y el uso de un imán de mano permiten un control preciso para atraer a las perlas para el ángulo iridocorneal en el ojo pequeño ratón. microperlas magnéticas que son 4,5 m de diámetro se utilizaron porque este tamaño de microperlas no obstruye la abertura de microagujas preparado y lo más importante, una vez inyectado, estas microperlas bloquearon eficazmente el drenaje del humor acuoso. Este enfoque no sólo reduce el reflujo de las microperlas inyectados, pero también asegura que un número máximo de microperlas se acumula en el área de destino para bloquear efectivamente el drenaje del humor acuoso. Furthermore, esta estrategia también reduce el número de cuentas que flotan en la cámara anterior evitando el contacto con otras estructuras, tales como el iris y la lente, y el paso de la prevención a la cámara posterior. En conjunto, estas modificaciones aseguran que la cirugía de inyección de microperlas se lleva a cabo con relativa facilidad y de una manera oportuna que resulta en una inducción altamente reproducible, eficaz y sostenida de la hipertensión ocular en ratones.

<table><tbody><tr><td>Tirador</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de pared delgada</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>El capilar tiene un diámetro exterior de 1,5 mm y un diámetro interior de 1,12 mm</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Zeiss</td><td>MZ9.5</td><td>Rango de factor de zoom de 2,5 a 6,0. Microscopio utilizado para la fabricación de agujas y la cirugía de inyección de microperlas.</td></tr><tr><td>Interruptor de pedal</td><td>Linemaster</td><td>T-91-SE</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de acero inoxidable</td><td>Feather</td><td>No. 11</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrodo Biselador</td> Productos <td>Científicos</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol Duster</td><td>Fisher</td><td>23-022-523</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-450 Epoxy</td><td>Life Technologies</td><td>14011</td><td>Las perlas magnéticas son 4.5 y micro; m de diámetro. La solución madre se encuentra en una concentración de 4 x 108 perlas/ml. Almacenar a 4&deg;C.</td></tr><tr><td>Rotores minitubo</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td></td></tr><tr><td>3 imanes de mano</td><td>Geomag</td><td></td><td>0.45 Tesla. Imán utilizado para la preparación de microperlas y la cirugía de inyección de microperlas.</td></tr><tr><td>Pipeta serológica de 25 ml</td><td>Costar</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Campana de contención biológica</td><td>Biostad</td><td>377355</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada (BSS)</td><td>Alcon</td><td>0065-0800-25</td><td></td></tr><tr><td>P1.000 Micropipeta</td><td>Gilson F123602</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtubo 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.690</td><td></td></tr><tr><td>P200 Micropipeta</td><td>Gilson F123601</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubo de PCR de 0,2 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72737.002</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td></td><td></td><td>Sustancia controlada</td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Bayer Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acepromazina</td><td>Vetoquinol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-100 Jeringa de insulina</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Ohaus</td><td>CS 200</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td></td><td></td><td>Sustancia controlada</td></tr><tr><td>Tropicamida solución oftálmica</td><td>Alcon</td><td>0998-0355-15 Bomba de</td> microjeringa manual de <td>midriacil al 1%</td></tr><tr><td>con pantalla digital</td><td>World Precision Instruments</td><td>DMP</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador manual</td> World <td>Precision Instruments</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-673-52</td><td>8 x 8 pulgadas</td></tr><tr><td>Hisopos absorbentes</td><td>Kettenbach</td><td>30601</td><td></td></tr><tr><td>P20 Micropipeta</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de plástico</td><td>Euroband</td><td>1001</td><td>Asegúrese de que la pinza sea de plástico y tenga una superficie plana para evitar dañar el ojo</td></tr><tr><td>Solución oftálmica de fluoroquinolonas</td><td>Alcon</td><td></td><td>Vigamox</td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Sunbeam</td><td>E12107-834</td><td></td></tr><tr><td>Tonómetro</td><td>iCare</td><td>TV02</td><td>Tonómetro de rebote TONOLAB&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehído, Para</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td></td></tr><tr><td>Herramientas</td><td></td><td></td><td></td>de disección</tr><tr><td>Cepillo</td><td></td><td></td><td></td>pequeño</tr><tr><td>Solución de glutaraldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7651</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato de sodio, trihidrato</td><td>Canemco y Marivec</td><td>124-65-2</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Brn-3a (C-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-31984</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos, 48 pocillos</td><td>Falcon</td><td></td> 353078 <td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Suero de burro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-IgG (H+L) anti-burro de cabra, Alexa Fluor 594 conjugado</td><td>Life Technologies</td><td>A-11058</td><td></td></tr><tr><td>Papel de aluminio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Desvanecimiento lento Reactivo antidecoloración de oro</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5E</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio solución acuosa al 2%</td><td>Ciencias de Microscopía Electrónica</td><td>3294949</td><td></td></tr><tr><td>Embed-812</td><td>Ciencias de Microscopía Electrónica</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Anhídrido succínico de dodecenilo</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>13710</td><td></td></tr><tr><td>Anhídrido de metilo nádico</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>19000</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de propileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110205-1L</td><td></td></tr><tr><td>Molde de inclusión-Dykstra</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>70907</td><td></td></tr><tr><td>Porter-Blum ultra-micrótomo</td><td>Sorvall</td><td>MT-2</td><td></td></tr><tr><td>Azul de toluidina O (Tinción biológica certificada)</td><td>Fisher-Scientific</td><td>T161-25</td><td></td></tr></tbody></table>

a magnetic microbead oclusión modelo para inducir hipertensión ocular dependiente de glaucoma en ratones

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

El uso de modelos de roedores de glaucoma ha sido esencial para comprender los mecanismos moleculares que subyacen a la fisiopatología de esta enfermedad neurodegenerativa multifactorial. Con la llegada de numerosas líneas de ratones transgénicos, hay un creciente interés en modelos murinos inducible de la hipertensión ocular. A continuación, presentamos un modelo de oclusión de glaucoma basado en la inyección de microperlas magnéticas en la cámara anterior del ojo usando una microaguja modificado con un bisel facetado. Las microperlas magnéticas son atraídos por el ángulo iridocorneal usando un imán de mano para bloquear el drenaje de humor acuoso de la cámara anterior. Esta alteración en la dinámica de resultados acuosas en una elevación constante de la presión intraocular, que posteriormente conduce a la pérdida de células ganglionares de la retina, como se observa en los pacientes con glaucoma humanos. El modelo microbead oclusión se presenta en este manuscrito es simple en comparación con otros modelos inducibles de glaucoma y también altamenteeficaz y reproducible. Es importante destacar que las modificaciones que se presentan aquí a minimizar los problemas comunes que surgen a menudo en los modelos de oclusión. En primer lugar, el uso de una microaguja de vidrio biselado evita el reflujo de microperlas y asegura que se produce el mínimo daño a la córnea durante la inyección, reduciendo así los efectos relacionados con la lesión. En segundo lugar, el uso de microperlas magnéticas asegura la capacidad de atraer la mayoría de perlas al ángulo iridocorneal, reduciendo efectivamente el número de perlas flotantes en la cámara anterior evitando el contacto con otras estructuras (por ejemplo., Iris, cristalino). Por último, el uso de un imán de mano permite flexibilidad al manipular el ojo pequeño ratón para dirigir eficientemente las microperlas magnéticas y asegurarse de que hay poco de reflujo de las microperlas de los ojos cuando se retira la microaguja. En resumen, la oclusión modelo de ratón de microperlas que aquí se presenta es una herramienta de investigación de gran alcance para estudiar los cambios neurodegenerativos que se producen durante el inicio y la progresión de glaucoma.

La inyección de microperlas magnéticas en la cámara anterior de ratones adultos descritos en este protocolo dio como resultado una elevación robusto y reproducible de la PIO. Una semana después del procedimiento, la PIO aumentó de 10 ± 0,6 mmHg (media ± SEM), la PIO promedio de referencia en los ojos contralaterales, a 19 ± 0,5 mmHg en los ojos hipertensos (prueba t de Student; *** p &lt;0,001, n = 12, Tabla 1, Figura 2). IOP estabilizado a partir de entonces y se mantuvo elevado en un promedio de 20 mm Hg durante al menos 6 semanas, el más largo de tiempo de punto examinado en este estudio. La PIO media de pico en los ojos de microesferas con inyección a los 2, 3, y 6 semanas después de la cirugía fue de 25 mm Hg. La gran mayoría de los ratones tratados desarrollaron una PIO elevada sostenida, por lo tanto, este protocolo no requiere una segunda inyección de microperlas. Para evaluar el curso de tiempo de la pérdida de RGC en este modelo, RGC soma eranprimera cuantificado por inmunotinción con Brn3a, un marcador de RGC-17 específica. El número de células positivas Brn3a se cuantificó en las retinas montadas en plano a 1, 2, 3 y 6 semanas después de la inducción de la hipertensión ocular. Aunque se detectó una elevación significativa de la PIO tan temprano como 1 semana después de la inyección de microperlas, no se observó pérdida significativa de RGC soma dentro de las primeras 2 semanas del procedimiento (Figura 3). La muerte de CGR sustancial (22%), sin embargo, fue evidente a las 3 semanas (2.430 ± 67 CGR / mm 2, media ± SEM, n = 12) y 6 semanas (2.350 ± 74 CGR / mm 2, n = 10) post- la inducción de la hipertensión ocular, en comparación con el control de los ojos intactos procedentes de ratones no operado (3.141 ± 49 CGR / mm 2, n = 23) (ANOVA, p &lt;0,001). Disfunción y degeneración de los axones de CGR es una característica cardinal del glaucoma. Por lo tanto, la pérdida axonal se examinó a los 3 y 6 semanas después de la inyección de microperlas porla cuantificación de los axones de CGR en nervio óptico secciones transversales teñidas con azul de toluidina (Figura 4). Se observó una pérdida sustancial de los axones de CGR (25%) a las 3 semanas (28,401 ± 702 axones / nervio, media ± SEM, n = 5) y 6 semanas (29,426 ± 948 axones / nervio, n = 6) después de la inyección de microperlas en comparación con los nervios ópticos de los ojos intactos no operado (39,467 ± 137 / axones del nervio, n = 4) (ANOVA, p &lt;0,001). En conjunto, estos datos demuestran que la inyección de microperlas magnéticas en la cámara anterior del ratón conduce a reproducible y elevación de la PIO que resulta en RGC soma y la degeneración axonal sostenida. <table><tbody><tr><td colspan="2"> Tiempo después de la cirugía OHT </td><td> norte </td><td colspan="3"> La media de la PIO (mmHg) ± SEM </td><td colspan="2"> Pico de la PIO (mmHg) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> contralateral </td><td> Glaucoma </td><td> diferenc </td><td> contralateral </td><td> Glaucoma </td></tr><tr><td colspan="2"> 1 semana </td><td> 12 </td><td> 10 ± 0,4 </td><td> 19 ± 0,5 </td><td> 9 ± 0,6 </td><td> 12 ± 0,4 </td><td> 22 ± 0,6 </td></tr><tr><td colspan="2"> 2 semanas </td><td> 13 </td><td> 11 ± 0,5 </td><td> 20 ± 0,8 </td><td> 9 ± 0,5 </td><td> 12 ± 0,9 </td><td> 25 ± 0,7 </td></tr><tr><td colspan="2"> 3 semanas </td><td> 10 </td><td> 11 ± 0,8 </td><td> 20 ± 0,7 </td><td> 10 ± 0,9 </td><td> 13 ± 0,2 </td><td> 25 ± 0,9 </td></tr><tr><td colspan="2"> 6 semanas </td><td> 12 </td><td> 12 ± 0,5 </td><td> 20 ± 0,6 </td><td> 9 ± 0,7 </td><td> 13 ± 0,5 </td><td> 24 ± 0,6 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. La elevación de la presión intraocular en el murino magnética Microbead Occlusien el modelo. En mujeres despierto / 6 ratones C57 BL, la PIO se midió utilizando un tonómetro de rebote calibrado. ojos operados muestran un aumento de la PIO se detecta en una semana después de la cirugía que se mantuvo elevado durante al menos seis semanas después del procedimiento. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig1.jpg" /> Figura 1. Flujo de trabajo de los pasos involucrados en el murino magnética Microbead Oclusión modelo de glaucoma. Esquema paso a paso de todos los procedimientos llevados a cabo antes, durante y después de la cirugía. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig2.jpg" /> Figura 2. Aumento de la presión intraocular en el modelo murino magnética Microbead oclusión. En despiertohembra C57 BL / 6 ratones, la PIO se midió usando un tonómetro de rebote calibrado. Las OIA de ojos inyectados microesferas fueron significativamente elevados en una semana después de la cirugía (ANOVA, p &lt;0,001). Las OIA se mantuvieron significativamente elevados en relación con el ojo contralateral de los ratones inyectados durante al menos 6 semanas (ANOVA, p &lt;0,001). (Intacto: n = 12; 1 semana: n = 12, 2 semanas: n = 13, 3 semanas: n = 10, 6 semanas: n = 12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig3.jpg" /> Figura 3. retiniana de la muerte celular en los murinos magnéticos Microbead oclusión del modelo. CGR se visualizaron mediante inmunotinción de retinas montadas planas usando Brn3a en las retinas intactas de control (A) y las retinas glaucomatosos a los 3 y 6 semanas después de la inyección para inducir microbeadhipertensión ocular (OHT) (B, C). Barras de escala: 20 m. (D) Análisis cuantitativo confirmó que la inyección de microperlas como resultado la pérdida significativa soma RGC a los 3 y 6 semanas después del procedimiento en comparación con el control de los ojos. La densidad de CGR, en el soma C57 no glaucomatosa ratones intactos, / BL6 se muestra como referencia (barras blancas, 100% de supervivencia). Los valores se expresan como la media ± SEM (Intacto: n = 23; 1 semana: n = 6, 2 semanas: n = 6, 3 semanas: n = 12, 6 semanas: n = 10, ANOVA, *** p &lt; 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig4.jpg" /> Figura 4. axonal degeneración en los murinos axones Magnetic Microbead Oclusión Model. RGC se visualizaron por tinción de nervio óptico secciones transversales con azul de toluidina ende control intacto (A) y retinas glaucomatosos a los 3 y 6 semanas después de la inyección de microperlas para inducir la hipertensión ocular (OHT) (B, C). Barras de escala: 10 m. (D) Análisis cuantitativo confirmó que la inyección de microperlas resultó en una pérdida significativa de axones RGC a los 3 y 6 semanas después del procedimiento en comparación con el control de los ojos. La densidad de los axones de CGR en C57 no glaucomatosa ratones intactos, / BL6 se muestra como referencia (barras blancas, 100% de supervivencia). Los valores se expresan como la media ± SEM (Intacto: n = 4; 3 semanas: n = 5, 6 semanas: n = 6, ANOVA, *** p &lt;0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .</a>

Aquí, se presenta un protocolo para inducir hipertensión ocular en el ojo murino que resulta en la pérdida de células ganglionares de la retina tal como se observa en el glaucoma. microperlas magnéticas se inyectan en la cámara anterior y atraídos por el ángulo iridocorneal usando un imán para bloquear el flujo de salida del humor acuoso.

A Magnetic Microbead Oclusión Modelo para inducir hipertensión ocular dependiente de glaucoma en ratones

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial ...

El objetivo general de este procedimiento quirúrgico es inducir un glaucoma dependiente de hipertensión ocular mediante la inyección de microesferas magnéticas en la cámara anterior del ojo del ratón. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del glaucoma, como cuáles son los cambios patológicos tempranos que ocurren en el ojo antes de la muerte evidente de las células ganglionares de la retina. La principal ventaja de esta técnica es que la presión interocular puede elevarse de manera confiable, causando daño mínimo al ojo durante el procedimiento.Las personas nuevas en este método tendrán dificultades para atravesar la córnea durante la inyección y podrían dañar estructuras cercanas, como el cristalino, debido a una microaguja mal preparada o a una posición incorrecta de la microaguja. Para comenzar, utilice un tirador de capilares para elaborar una microaguja a partir de un capilar de vidrio borosilicatado. Bajo un microscopio, use una cuchilla afilada para crear cuidadosamente una abertura en la punta de la microaguja, de modo que esta tenga una forma elíptica con un diámetro del eje mayor y del eje menor de aproximadamente 190 micrómetros y 70 micrómetros, respectivamente.En el sistema de biselado de micropipetas, coloque la microaguja a un ángulo de 20 grados con respecto a la placa de biselado, de modo que la abertura de la microaguja toque la placa. Realice el biselado durante aproximadamente 10 minutos utilizando gotas de agua hasta que los bordes estén planos y lisos. A continuación, gire la aguja para biselar los dos bordes que rodean la abertura hasta que la punta de la microaguja esté afilada.Luego, con un limpiador de aerosol, elimine todos los residuos y el agua de la abertura de la punta de la microaguja. Examine cuidadosamente la microaguja terminada bajo un microscopio. Deseche las microagujas que presenten fracturas.El siguiente procedimiento requiere dos personas para completarse. Cuando una acción específica deba realizarse por una persona determinada, se indicará dicha persona como "Persona 1" o "Persona 2". Prepare la solución de microesferas magnéticas según el protocolo descrito. Para medir la presión intraocular basal, o PIO, en un ratón despierto, restrinja suavemente al ratón sosteniendo la piel entre las orejas.Coloque el ratón sobre la superficie de trabajo de manera que el animal esté cómodo y los ojos sean accesibles. Aplique una gota de hidrocloruro de proparacaína sobre la córnea, luego sostenga el tonómetro perpendicular a la superficie corneal y tome al menos tres series de 10 mediciones consecutivas por ojo para obtener un promedio de la presión intraocular (IOP). A continuación, después de anestesiar al ratón según el protocolo descrito en el texto, administre 0.05 miligramos por kilogramo de peso corporal de buprenorfina por vía subcutánea.A continuación, trate el ojo con una gota oftálmica de tropicamida para inducir la dilatación de la pupila y facilitar la visualización de la posición de la microaguja durante la inyección. Aplique una pomada tópica en el ojo contralateral para prevenir el secado de la córnea durante el procedimiento. Ahora, fije una microaguja estéril al ensamblaje de inyección de la bomba de microjeringa.Luego, transfiera el ratón anestesiado a la plataforma quirúrgica. Bajo el microscopio, la Persona 1 debe asegurarse de que la pupila esté completamente dilatada y de que los músculos oculares estén relajados para que no haya movimiento ocular y así garantizar la estabilidad durante el procedimiento. Utilice torundas absorbentes para limpiar suavemente las gotas oculares de tropicamida del ojo.Haga que la Persona 2 mezcle la solución de microesferas magnéticas pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Luego, utilizando la bomba de microjeringa, cargue la microaguja con 1,5 microlitros de la solución homogeneizada de microesferas magnéticas. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la punta de la microaguja.Lo más rápidamente posible, coloque la aguja en un ángulo de 45 grados hacia delante, en relación con el limbo. Que la Persona 1 utilice la pinza de plástico para sostener el ojo, manteniendo un ángulo de aproximadamente 90 grados entre la microaguja y la pinza de plástico. Utilizando la bomba de microjeringa, que la Persona 2 punce suavemente la córnea con la microaguja cargada, de modo que la punta de la microaguja entre en la cámara anterior evitando el cristalino, el iris y la cámara posterior.Sin mover la cabeza del ratón, la Persona 1 debe colocar el imán al lado del ojo opuesto a la punta de la aguja. Para atraer las microesferas magnéticas hacia la cámara anterior y minimizar el contacto de las esferas con la superficie interna de la córnea. Mientras la Persona 1 sigue sosteniendo el imán, la Persona 2 debe usar la bomba de microjeringa para inyectar 1,5 microlitros de la solución de microesferas magnéticas en la cámara anterior durante un período de 15 a 30 segundos.Una vez que se haya inyectado todo el volumen de microesferas, retire lentamente la microaguja del ojo. Para evitar el reflujo de las microesferas, la Persona 1 debe continuar sosteniendo el imán junto al ojo durante 30 a 60 segundos adicionales para atraer las microesferas hacia la cámara anterior. Luego, utilice el imán para atraer las microesferas hacia el ángulo iridocorneal, evitando atraerlas hacia la superficie interna de la córnea, donde podrían adherirse.Asegúrese de que las microesferas formen un anillo uniformemente distribuido alrededor de la circunferencia de la cámara anterior. Posteriormente, trate el ojo operado con gotas oculares antibióticas para minimizar el riesgo de infección. Permita que el ratón se recupere sobre una almohadilla térmica hasta que esté completamente despierto, con el ojo operado orientado hacia arriba para prevenir infecciones y la acumulación de microesferas en la superficie interna de la córnea.Después de al menos dos días de recuperación, mida la PIO como se demostró anteriormente en el video y realice un seguimiento al menos una vez por semana o con mayor frecuencia según sea necesario, siempre a la misma hora del día. Analice los resultados de acuerdo con el protocolo descrito en el texto. La inyección de microesferas magnéticas en la cámara anterior de ratones adultos descrita en este protocolo provocó un aumento sólido y reproducible de la PIO.Como se observa aquí, una semana después del procedimiento, la PIO aumentó desde un valor basal promedio de 10, más o menos 0,6 milímetros de mercurio, hasta 19, más o menos 0,5 milímetros de mercurio en ojos hipertensos. Esta tabla muestra que la PIO se estabilizó posteriormente y se mantuvo elevada con un promedio de 20 milímetros de mercurio durante al menos seis semanas, el punto temporal más largo examinado en este estudio. La PIO máxima promedio en ojos inyectados con microesferas a las dos, tres y seis semanas posteriores a la cirugía fue de 25 milímetros de mercurio.Para evaluar la pérdida de células ganglionares de la retina, o RGC, se cuantificó el número de células positivas para BRN-3A en preparaciones planas de retinas a la una, dos, tres y seis semanas después de la inducción de hipertensión ocular. Aunque se detectó un aumento significativo de la PIO a la una semana, no se observó una pérdida significativa de somas de RGC durante las primeras dos semanas. Sin embargo, se observó una muerte celular significativa a las tres y seis semanas posteriores a la intervención. En esta figura, las secciones transversales del nervio óptico teñidas con azul de toluidina muestran una pérdida sustancial de axones de las CRR a las tres y seis semanas en comparación con los nervios ópticos intactos, lo que indica que esta intervención provoca una pérdida axonal como la observada en el glaucoma. Una vez dominada la técnica, la inyección en un ratón puede realizarse en 15 minutos. Al realizar este procedimiento, es importante tomar las medidas adecuadas para asegurar que se inyecte el mismo número de microesferas en la cámara anterior.Esto reducirá la variación que pueda ocurrir entre los animales. Después de ver el video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir hipertensión ocular mediante la inyección de microesferas magnéticas en la cámara anterior de los ojos de ratón.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

En este video, una rata anestesiada se somete a un procedimiento ocular en el que se inyectan perlas magnéticas en la cámara anterior bajo un campo magnético para bloquear el ángulo iridocorneal. Esta obstrucción obstruye la malla trabecular, impidiendo el drenaje acuoso del humor y provocando un aumento de la presión intraocular, dañando las células ganglionares de la retina y el nervio óptico. Esto desarrolla una afección similar al glaucoma.

Inducción experimental de glaucoma a través de la obstrucción del ángulo iridocorneal en un modelo de ratón

Hipertensión ocular crónica se induce mediante fotocoagulación con láser de la malla trabecular en los ojos de ratón. La presión intraocular (PIO) es elevada durante varios meses después del tratamiento con láser. La disminución de la agudeza visual y la sensibilidad al contraste de los animales experimentales se vigila por medio de la prueba de optomotor.

Un modelo de ratón inducida por láser de la hipertensión ocular crónica a Caracterizar los defectos visibles

Presentamos un método para inducir presión intraocular (PIO) elevada, mediante la inyección de microesferas magnéticas en el ojo de rata, para modelar el glaucoma. Esto conduce a fuertes aumentos de presión y muerte neuronal extensa. Este protocolo es fácil de realizar, no requiere inyecciones repetidas y produce aumentos estables y duraderos de la PIO.

Experimental glaucoma inducido por inyección ocular de microesferas magnéticas

El glaucoma se caracteriza por daño a las células ganglionares de la retina. La inducción de glaucoma en modelos animales puede proporcionar información sobre el estudio de esta enfermedad. Aquí, describimos un procedimiento que induce la pérdida de RGCs en un modelo de rata in vivo y demostramos la preparación de retinas de montaje completo para el análisis.

Glaucoma de inducir en un Procedimiento<em&gt; En Vivo</em&gt; Modelo de rata y Todo el montaje-Retina Preparación

La hipertensión ocular crónica se induce mediante la aplicación de una sutura de circumlimbal en ratas y ratones, llevando al deterioro funcional y estructural de las células ganglionares de la retina compatibles con glaucoma.

Un modelo de Glaucoma inducido por sutura de Circumlimbal en ratas y ratones

Aquí, presentamos un protocolo para inducir hipertensión ocular y neurodegeneración glaucomatosa en los ojos del ratón por inyección intracameral de aceite de silicona y el procedimiento para la eliminación de aceite de silicona de la cámara anterior para devolver la presión intraocular elevada a Normal.

Un modelo de hipertensión ocular inducida por aceite de silicio reversible en ratones

El objetivo de este protocolo es caracterizar un nuevo modelo de neurodegeneración glaucomatosa basado en la cauterización térmica de 360° del plexo vascular limbal, induciendo hipertensión ocular subaguda.

Cauterización de círculo completo del plexo vascular limbal para el glaucoma inducido quirúrgicamente en roedores

Oclusión filamentosa de la arteria cerebral media es un modelo común para el estudio de ACV isquémico en los ratones.

Modelado de accidente cerebrovascular en ratones - Oclusión arteria cerebral media con el modelo de filamento

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Un modelo murino de isquemia miocárdica y el precondicionamiento isquémico es una herramienta importante para estudiar los mecanismos...

El uso de un sistema de peso que cuelga de la oclusión coronaria en ratones

Aprende a inducir hipertensión ocular en ratones mediante la inyección de microesferas magnéticas en la cámara anterior. Este método reproduce fielmente el glaucoma y permite estudiar los cambios patológicos tempranos antes de la muerte de células ganglionares retinianas.

A Magnetic Microbead Oclusión Modelo para inducir hipertensión ocular dependiente de glaucoma en ratones

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