Name: La secuenciación de pared planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilación) y (espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear) Técnicas Físicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Aprende a caracterizar secuencias glicosídicas de heteroxilanos de pared celular vegetal mediante marcado con 2-aminobenzamida, hidrólisis enzimática con endoxilanasas y análisis por espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear.

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Este proyecto fue apoyado por fondos del Programa de Investigación Colaborativa Insignia de la Organización Científica y de Investigación de la Commonwealth, proporcionado al Clúster de Granos de Alta Fibra a través del Food Futures Flagship. AB también reconoce el apoyo de una subvención del Consejo de Investigación de Australia (ARC) al Centro de Excelencia en Paredes Celulares de Plantas (CE110001007).

1. El etiquetado del extremo reductor (RE) Azúcar Residuo de la W-sol AXs con 2-aminobenzamida (2AB) <ol><li> Incubar W-sol AXs con 2AB (0,2 M) en presencia de 1 M NaBH 3 CN (cianoborohidruro de sodio) (pH 5,5) durante 2 horas a 65 ° C para convertir los extremos reductores de las cadenas de polisacárido de cadena principal a sus derivados fluorescentes. PRECAUCIÓN: El siguiente paso se debe realizar en la campana de humos como NaBH 3 CN libera gas cianuro venenoso cuando está en contacto con el agua. <ol><li> Pesar NaBH 3 CN (62,8 mg) y disolver en agua (1 ml) en un tubo de microcentrífuga (1,5 ml) para preparar una solución 1 M NaBH 3 CN. Disolver reactivo 2AB (27,2 mg) en una solución 1 M NaBH 3 CN (1 ml) por calentamiento a 65 &#160; ° C y ajustar el pH de la mezcla de reacción (0,2 M 2AB, 1 M NaBH 3 CN) a pH 5,5 con ácido acético al 10%. </li><li> Añadir 200 l de mezcla de reacción (0,2 M 2AB, 1 M NaBH 3 CN) para W-sol AXs (1 mg) en un tubo de vidrio con una tapa y se mezclan usando un mezclador de vórtice. Incubar durante 2 horas a 65 &#160; ° C en una campana de humos. Se enfría la suspensión a temperatura ambiente y añadir 4 vols. de etanol absoluto. </li><li> Coloque la suspensión en un almacenamiento en frío (4 ° C) O / N para precipitar polisacáridos. </li><li> Se centrifuga (1.500 xg, 10 min, RT) para eliminar el sobrenadante. Lavar el sedimento extensamente con etanol absoluto (4x), acetona (1 x) y metanol (1 x), centrifugando entre cada lavado. seca al vacío a 40 ° CO / N. Nota: Lavado extenso también elimina 2AB residual. </li></ol></li></ol> 2. Generación de xilo-oligosacáridos de 2 AB Etiqueta W-sol AXs <ol><li> Disolver 2AB etiquetado W-sol AXs (1 mg) en 500 l de tampón de acetato de sodio (100 mM, pH 5) en un tubo de microcentrífuga (1,5 ml). Añadir 4 unidades de endoxilanasa (GH 11, [M1]) y se incuba a 37 &#160; ° C durante 16 horas. </li><li> Destruir la actividad de la enzima por calentamiento de las mixto de reacciónUre durante 10 minutos en un baño de agua hirviendo. Se enfría la suspensión a temperatura ambiente y transferir al tubo de vidrio con una tapa. Añadir 4 vols. de etanol absoluto y colocar la suspensión en un almacenamiento en frío (4 ° C) O / N para precipitar cualquier polisacáridos no digeridos. </li><li> Se centrifuga (1.500 xg, 10 min, RT) para separar los polisacáridos no digeridos (pellet) y endoxilanasa generado xilo-oligosacáridos (sobrenadante). Decantar el sobrenadante en un tubo de vidrio limpio y colocarlo en un baño de agua caliente (40 ° C). </li><li> Se evapora el etanol bajo una corriente de gas nitrógeno a un volumen punto final (~ 500 l). Congelar el sobrenadante a -80 ° C durante 4 horas y se seca el sobrenadante congelado en un liofilizador para recuperar xilo-oligosacáridos. </li></ol> 3. Generación de xilo-oligosacáridos de KOH-sol AXs y Etiquetado 2AB <ol><li> El tratamiento de KOH-sol AXs con endoxilanasa (GH 11, [M1]) para generar xilo-oligosacáridos como se describió anteriormente (secciones 2.1-2.4). </li><li> Tratar a Endoxylanase genera xilo-oligosacáridos de KOH-sol AXs con la mezcla de reacción 2AB (0,2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) como se describió anteriormente (secciones 1.1.1-1.1.2). </li><li> Decantar el sobrenadante en un tubo de vidrio limpio y colocarlo en un baño de agua caliente (40 ° C). Se evapora el etanol bajo una corriente de gas nitrógeno a un volumen punto final (~ 500 l). Congelar el sobrenadante a -80 ° C durante 4 horas y se seca el sobrenadante congelado en un liofilizador para recuperar xilo-oligosacáridos. </li></ol> 4. MALDI-TOF-MS <ol><li> Preparación de la solución matriz de MALDI- <ol><li> Añadir una pequeña bola de 2, ácido 5-dihydroxbenzoic (DHB) a 50% de acetonitrilo (500 ml) que contenía ácido fórmico al 0,1% en un tubo (solución MALDI-matriz). Mezclar utilizando un vórtice, si se disuelve rápidamente, añadir otra cucharada pequeña de DHB. Nota: concentración ideal de la solución de MALDI-matriz es 10 g / l -1. </li></ol></li><li> Preparación de la placa de MALDI-objetivo <ol><li> Depositar el aqueonos oligosacáridos muestras (nativas) (5-10 mg) (W-sol y / o KOH-sol) sobre una placa MALDI-objetivo. Añadir la solución matriz de MALDI-0,3 l usando una punta separada y mezclar pipeteando arriba y abajo. Dejar que la mezcla se seque a temperatura ambiente. Nota: Las muestras secadas correctamente deben consistir en cristales largos en forma de aguja apuntando hacia el centro de la mancha. Si el depósito es pegajoso y / o smeary la muestra puede ser o bien demasiado concentrada o consiste de sales, tales depósitos son poco probables para producir buena espectros y la muestra debe ser purificados adicionalmente. </li><li> Introducir la placa del objetivo en la fuente MS y operar en el modo de ion positivo (+ iva). Ajustar la tensión de acelerador a 19,0 kV en la fuente de iones de 1 y 16,3 kV en la fuente de iones 2. ajustar la potencia de láser para mayor que 70%. Seleccione el punto de la muestra en la placa de MALDI-objetivo y haga clic en inicio para comenzar disparos de láser. Nota: Todas las zonas del objetivo no producirán señales. Un punto particular sólo dará una señal por unos disparos de láser, ya sea debido aagotamiento de la mezcla de muestra / matriz o las características del cristal. <ol><li> Mueva el láser a diferentes áreas del objetivo durante la adquisición y el promedio de aproximadamente 200 espectros aleatorio para obtener señal-ruido satisfactoria. </li></ol></li></ol></li></ol> 5. ESI-QTOF-MS <ol><li> Analizar oligosacáridos generados endoxilanasa-(nativo) usando nano-HPLC junto con una ionización por electrospray (ESI) Tiempo de cuadrupolo de vuelo por instrumentos (QTOF) MS con separación cromatográfica en línea utilizando un RP columna C-18 (75 micras x 150 mm; 3,5 micras del grano tamaño). <ol><li> Transfiera la mezcla de oligosacáridos acuosas generadas endoxilanasa-en un vial y el lugar en el muestreador automático de HPLC. Programar el gradiente de elución de 5 a 80% con las fases móviles 0,1% (v / v) de ácido fórmico en agua y 0,1% (v / v) de ácido fórmico en acetonitrilo, respectivamente, durante 60 min. </li><li> Ajustar la velocidad de flujo de 0,2 l / min. Ajustar el modo de iones positivos en el rango de exploraciónde 300-1,600 m / z y a-velocidad de barrido de 0,5 exploraciones / segundo utilizando las condiciones de la fuente de ESI como sigue: gas cortina 10, GS1 4, temperatura de la fuente 100 ° C, la tensión de pulverización iónica 2.300 V, y de-la agrupación de potencial 50 V. Ejecutar el programa LC cromatográfico y oligosacáridos eluir. El cromatograma de iones totales resultante (TIC) se guarda automáticamente por el software. </li><li> Abra el TIC guardado y seleccione cromatograma del extracto. Escriba las masas esperadas (por ejemplo, 271, 403, 535, 667, 799 y 931 m / z) en la línea de comandos. cromatograma de análisis haciendo clic Intro. Procesar las exploraciones de iones seleccionadas de los datos del cromatograma ESI-QTOF MS utilizando el software de acuerdo con las instrucciones del fabricante 14. </li></ol></li></ol> 6. ESI-MS n <ol><li> Introduzca 1 a 2 l de oligosacárido per-O-metilado (metilado como se describe por Pettolino et al. 1) de muestra en 50% de acetonitrilo en una punta de nanopulverización usando una jeringa. Recortarla punta nano-pulverización utilizando un cortador de vidrio para encajar en el soporte de nano-aerosol discreto unido a la MS. </li><li> Establecer la masa de acuerdo con el rango esperado de masas (200-1,500 m / z) y el gas de cortina a 10, tensión ionspray a 1.900 V y la polaridad de positivo. </li><li> Pulse el botón ADQUISICIÓN para abrir la ventana correspondiente, introduzca el nombre del archivo de datos para obtener un escaneo total de iones (ESI-MS 1). A continuación, pulse el botón STOP. </li><li> Cambiar el tipo de escaneo de iones producto a fragmentar un pico de interés. Ingrese la masa de interés (por ejemplo, 885 m / z) para fragmentar y ajustar el rango de masa (200-900 m / z). Pulse el botón adquirir y ajustar la energía de colisión (hacia arriba y / o hacia abajo en la pestaña compuesto) para conseguir toda la fragmentación del ion primario (885 m / z) y adquirir una exploración fragmento de iones (ESI-MS 2). </li><li> Ingrese la masa del ión fragmento de interés (por ejemplo, 711 m / z) y ajustar el rango de masa (200-720 m / z). Presione el botón de adquirir unad ajustar la energía de colisión para lograr toda la fragmentación del ion precursor (711 m / z) y adquirir una exploración de iones fragmento (ESI-MS 3). </li></ol> 7. H 1 NMR Spectroscopy <ol><li> Disolver endoxilanasa generada mezcla de oligosacáridos (KOH-sol, forma nativa) (~ 500 g) en D2O (1,0 ml, 99,9%) en un tubo de ensayo de plástico (15 ml). Congelación de la suspensión a -80 ° C durante 4 horas y se seca la suspensión congelada en un liofilizador para recuperar xilo-oligosacáridos. </li><li> Repetir dos veces 7.1 con el fin de intercambiar plenamente el H2O con D2O </li><li> Disolver oligosacáridos secos en D2O (0,6 ml, 99,9%) y añadir 0,5 l de acetona (5% en D2O) como estándar interno. La transferencia de los oligosacáridos deuterados en el tubo de la muestra de RMN. </li><li> Mantenga el tubo que contiene la muestra de RMN por la parte superior e insertar el tubo de muestra en una centrifugadora de plástico. Coloque el control de giro en el medidor de profundidad de la muestra. Push o tire del tubo de muestra para ajustar la profundidad de la muestra para asegurar que la línea central de la parte superior de la muestra y calibres de profundidad inferior son iguales. </li><li> Retire el medidor de profundidad e inserte la muestra en el muestreador automático conectado a un espectrómetro de RMN de 600 MHz equipado con un crio-sonda. </li><li> Inicio de sesión y el software de control espectrómetro abierta. Introduzca el nombre de archivo de ejemplo. Abrir una base de datos existente y luego utilizar el comando &quot;EDC&quot; para guardarlo con un nuevo nombre. Escriba el número de la posición de la muestra en el muestreador automático y pulse &quot;ENTER&quot;. Nota: Al pulsar el botón &quot;ENTER&quot; se reducirá el tubo de muestra suavemente a la cavidad del imán donde será colocado en la parte superior de la sonda. </li><li> Ajuste la temperatura de la muestra deseada escribiendo &quot;edte&quot; en la línea de comandos. Esperar a que la temperatura de la muestra para llegar al valor deseado antes de proceder al siguiente paso. Enter &quot;bloqueo&quot; en la línea de comandos y seleccione disolvente apropiado (D2O). Esperen al &amp;#34; bloquear mensaje de finalización &quot;para aparecer en la parte inferior de la ventana. </li><li> Tipo &quot;ATMM&quot; en la línea de comandos y haga clic en &quot;optimizar&quot; en la parte superior de la barra de menús ATMM. Elija Inicio de ajuste y adaptación de la sonda para el canal seleccionado (1 H en este caso). </li><li> Tipo &quot;topshim&quot; en la línea de comandos para el proceso de calce en el que se hacen pequeños ajustes en el campo magnético hasta que el campo magnético uniforme se logra alrededor del sample.Acquire la señal escribiendo &quot;ZG&quot; en la línea de comandos y escriba. </li><li> Analizar espectros utilizando el software 15 de acuerdo con las instrucciones del fabricante con 1 desplazamiento químico H hace referencia a un estándar interno de acetona a 2,225 ppm. </li></ol>

<ol><li>Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Determining the polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).</li>
<li>Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reducing+end+sequence+of+wheat+endosperm+cell+wall+arabinoxylans%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans.</a> Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).</li>
<li>Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBacic%2C+A+%22The+Biochemistry+of+Plants%2C+Vol.+14%2C+Carbohydrates%22">The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates</a>. Preiss, J. 14, Academic Press. San Diego. 297-371 (1988).</li>
<li>York, W. S., O'Neill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+control+of+xylan+biosynthesis+-+which+end+is+up%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical control of xylan biosynthesis - which end is up?</a> Plant Biol. 11, 258-265 (2008).</li>
<li>Fincher, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revolutionary+times+in+our+understanding+of+cell+wall+biosynthesis+and+remodeling+in+the+grasses%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses.</a> Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).</li>
<li>Faik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xylan+Biosynthesis%3A+News+from+the+Grass%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Xylan Biosynthesis: News from the Grass.</a> Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).</li>
<li>Scheller, H. V., Ulskov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemicelluloses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Hemicelluloses.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).</li>
<li>Bacic, A., Stone, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%281%E2%86%923%29-+and+%281%E2%86%924%29-linked+%CE%B2-D-glucan+in+the+endosperm+cell-wall+of+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat.</a> Carbohydr. Res. 82 (13), 372-377 (1980).</li>
<li>Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+soluble+and+insoluble+cell+wall+fractions+from+rye%2C+wheat+and+hull-less+barley+endosperm+flours%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Hydrocolloids%22%5BJournal%5D)">Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours.</a> Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).</li>
<li>Pena, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+irregular+xylem8+and+irregular+xylem9%3A+Implicationsfor+the+Complexity+of+Glucuronoxylan+Biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis.</a> Plant Cell. 19, 549-563 (2007).</li>
<li>Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+reducing+end-groups+in+Spruce+xylan%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan.</a> Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).</li>
<li>Mazumder, K., York, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+arabinoxylans+isolated+from+ball-milled+switchgrass+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass.</a> Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).</li>
<li>Kulkarni, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ability+of+land+plants+to+synthesize+glucuronoxylans+predates+the+evolution+of+tracheophytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiol%22%5BJournal%5D)">The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes.</a> Glycobiol. 22 (2012), 439-451 (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Agilent+MassHunter+Workstation+Software+-+Quantitative+Analysis+Familiarization+Guide%22">Agilent MassHunter Workstation Software - Quantitative Analysis Familiarization Guide</a>. , Agilent Technologies. Available from:
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<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Topspin+User+Manual%22">Topspin User Manual</a>. , Bruker. Available from:
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<li>Domon, B., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+nomenclature+for+carbohydrate+fragmentation+in+FAB-MS%2FMS+spectra+of+glycoconjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate.+J%22%5BJournal%5D)">A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates.</a> Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).</li>
<li>Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+by+1H-n.m.r.+spectroscopy+of+oligosaccharides%2C+derived+from+arabinoxylans+of+white+endosperm+of+wheat%2C+that+contain+the+elements+----4%29%5Balpha-L-Araf-%281----3%29%5D-beta-D-Xylp-%281----+or+----4%29%5Balpha-+L-Araf-%281----2%29%5D%5Balpha-L-Araf-%281----3%29%5D-beta-D-Xylp-%281----%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements ----4)[alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1---- or ----4)[alpha- L-Araf-(1----2)][alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1----.</a> Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).</li>
<li>Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+by+1H+NMR+spectroscopy+of+enzymically+derived+oligosaccharides+from+alkali-extractable+wheat-flour+arabinoxylan%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan.</a> Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).</li>
<li>Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+enzymatic+cleavage+of+cellulose+using+polysaccharide+analysis+by+carbohydrate+gel+electrophoresis+%28PACE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE).</a> Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

La mayoría de los polisacáridos de la pared celular de la fase de matriz han backbones aparentemente sustituido al azar (con tanto glicosilo y residuos no glicosilo) que son muy variable dependiendo de las especies de plantas, el grado de desarrollo y tipo de tejido 3. Desde polisacáridos son productos de los genes secundarios su secuencia no es plantilla derivada y por lo tanto no hay un enfoque analítico único, como el que existe para los ácidos nucleicos y proteínas, para su secuenciación. La disponibilida...

Heteroxilanos son una familia de polisacáridos que son los polisacáridos no celulósicos predominantes de las paredes primarias de gramíneas y las paredes secundarias de todas las angiospermas 3-6. Las cadenas principales de xilano difieren en sus tipos y patrones de sustitución con glicosil (ácido glucurónico (GlcA), arabinosa (Araf)) y los residuos en función del tipo de tejido, el grado de desarrollo y las especies no-glicosil 7 (O-acetilo, ácido ferúlico). Paredes de trigo (Triticum aestivum L.) endospermo se componen principalmente de arabinoxilanos (AXs) (70%) y (1 → 3) (1 → 4) -β-D-glucanos (20%) con cantidades menores de celulosa y heteromannans (2% cada uno) 8. La cadena principal de xilano puede ser diversamente un-sustituido y predominantemente mono-sustituido (principalmente O-2 posición y en menor medida O-3 posición) y (O-2 y O-3 posiciones) con α-L-Ara di-sustituido residuos de F 9. El extremo reductor (RE) de heteroxilanos de dicotiledóneas (por ejemplo, de Arabidopsis thaliana) 10 y gimnospermas (por ejemplo, el abeto (Picea abies)) 11 contiene una secuencia característica tetrasacárido glicosilo; -β-D-Xyl p - (1 → 3) -α-L-Rha p - (1 → 2) -α-D-Gal p A- (1 → 4) -D-Xyl p. Para entender la biosíntesis y la función (biológica y industrial) heteroxilano, es importante para secuenciar completamente la columna vertebral de xilano entender los tipos y los patrones de sustituciones, así como la secuencia del extremo reductor (RE). Las técnicas específicas utilizadas para la caracterización estructural de la reducción final (RE) y la secuencia de glicosilo región interna (s) de heteroxilanos se describen en este manuscrito. Las técnicas se basan en el etiquetado de fluoróforo (con 2 aminobenzamida (2AB)) el extremo reductor (RE) de la cadena heteroxilano antes de la hidrólisis enzimática (endoxilanasa). Este enfoque, en particular para la secuenciación RE, eraprimero reportada por el laboratorio York 10,12-13 pero ahora se extiende para incluir la secuenciación región interna y es una combinación de las técnicas establecidas que es igualmente adaptable a todos los heteroxilanos independientemente de su fuente de aislamiento. Este enfoque también se puede aplicar a otras clases de polisacáridos usando (si está disponible) las endo-hidrolasas adecuadas. En el presente estudio, las paredes de-almidonado celulares del endospermo de trigo se aislaron como un residuo de alcohol insoluble (AIR) y secuencialmente se extrajo con agua (W-sol Fr) y 1 M KOH conteniendo 1% NaBH 4 (KOH-sol Fr) como se describe en Ratnayake et al. (2014) 2. Los oligosacáridos liberados tanto de Frs KOH-sol W- y son entonces metilado y el análisis estructural detallado tanto de los oligosacáridos nativos y metilados se realiza utilizando una combinación de MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-MS-acoplado con HPLC con el separación cromatográfica en línea usando una columna RP C-18y ESI-MS n. Endoxilanasa digerido KOH-sol AXs también se caracterizó por resonancia magnética nuclear (NMR).

<table><tbody><tr><td>2 aminobenzamida (2AB)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>A89804</td><td></td></tr><tr><td>borohidruro de sodio (NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>247677</td><td>Peligroso, maneje con cuidado</td></tr><tr><td>cianoborohidruro de sodio (NaBH3CN)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>156159</td><td>Peligroso, manéjelo con cuidado</td></tr><tr><td>endo-1,4-&beta;-Xilanasa M1 (de Trichoderma viride) (120101a)</td><td>Megazyme (www.megazyme.com)</td><td>E-XYTR1</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de deuterio (D2O)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RP C18 Zorbax eclipse plus column&nbsp;</td><td>Agilent&nbsp;</td><td></td><td>(2.1 y veces; 100 mm; 1.8 y micro; m tamaño de la cuenta)&nbsp;</td></tr><tr><td>MicroFlex MALDI-TOF MS&nbsp; &nbsp; (Modelo - MicroFlex LR)</td><td>(Bruker Daltonics, Alemania)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(ESI) -(QTOF) MS&nbsp; &nbsp; (Modelo # 6520)</td><td>(Agilent, Palo Alto, CA )</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESI-MSn &nbsp;- trampa de iones&nbsp; (Modelo # 1100 HCT)</td><td>(Agilent, Palo Alto, CA).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 600 MHz -NMR</td><td>Bruker Daltonics, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Topspin (versión 3.0)-Biospin- software&nbsp;</td><td>Bruker&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC-MS (Modelo # 7890B)</td><td>Agilent&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la secuenciación de pared planta heteroxilanos usando enzimática, química (metilación) y (espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear) técnicas físicas

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Este protocolo describe las técnicas específicas utilizadas para la caracterización de la reducción final (RE) y la secuencia de glicosilo región interna (s) de heteroxilanos. Paredes celulares del endospermo de trigo De almidonadas-se aislaron como un residuo de alcohol insoluble (AIR) 1 y secuencialmente se extrajo con agua (W-sol Fr) y 1 M KOH conteniendo 1% NaBH 4 (KOH-sol Fr) como se describe por Ratnayake et al. (2014) 2. Se adoptaron dos enfoques diferentes (véase el resumen en la Figura 1). En el primero, intactos AXs W-sol se tratan con 2AB para etiquetar el RE columna vertebral residuo original de azúcar de cadena y luego tratados con una endoxilanasa para generar una mezcla de RE 2AB marcado y la región interna reducir oligosacáridos, respectivamente. En un segundo enfoque, el Fr KOH-sol se hidroliza con endoxilanasa para generar primero una mezcla de oligosacáridos que posteriormente se etiquetan con 2AB. Los liberados enzimáticamente (ONU) (etiquetados) oligosacáridos de ambosW- y los PP KOH-sol son entonces metilado y el análisis estructural detallado tanto de los oligosacáridos nativos y metilados se realiza utilizando una combinación de MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS y ESI-MS n. Endoxilanasa digerido KOH-sol AXs también se caracterizan por resonancia magnética nuclear (RMN), que también proporciona información sobre la configuración anomérica. Estas técnicas se pueden aplicar a otras clases de polisacáridos utilizando las endo-hidrolasas adecuadas.

Digestión endoxilanasa de 2AB-etiquetado W-sol AXs genera una mezcla de oligosacáridos RE 2AB marcado y una serie de oligosacáridos un-marcado (sin la etiqueta de 2AB) derivados de las regiones internas de la cadena de xilano (Figura 1; de Ratnayake et al. 2). se emplea luego una serie de enfoques cromatográficas para fraccionar el complejo de mezcla de isómeros. Por último, se utilizan técnicas MS para identificar las estructuras isoméricas que luego...

Este protocolo describe las técnicas específicas utilizadas para la caracterización estructural de las secuencias reductoras de glicosil extremo (RE) e interno de los heteroxilanos mediante el marcaje del RE con 2 aminobenzamida antes de la hidrólisis enzimática (endoxilanasa) y luego el análisis de los oligosacáridos resultantes mediante espectrometría de masas (MS) y resonancia magnética nuclear (RMN).

La secuenciación de pared planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilación) y (espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear) Técnicas Físicas

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

El objetivo general es caracterizar las secuencias de glicósidos del extremo reductor y de las regiones internas de las heteroxilanas mediante la marcación del residuo de azúcar del extremo reductor original de las heteroxilanas solubles en agua y el tratamiento con una endoxilanasa para generar una mezcla de sacáridos marcados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la glicómica, como las alteraciones en la estructura fina de oligosacáridos o polisacáridos en respuesta al desarrollo programado del crecimiento, así como a factores de estrés abióticos y bióticos. La principal ventaja de este método es que describe un enfoque integrado para la secuenciación del extremo reductor, así como de la secuencia interna de cualquier glicano o polisacárido.Prepare una solución unimolar de cianoborohidruro de sodio en un mililitro de agua. Luego, disuelva 27,2 miligramos del reactivo 2AB en la solución de cianoborohidruro de sodio calentando a 65 grados Celsius y ajustando el pH de la mezcla de reacción a pH 5,5 con ácido acético al 10 por ciento. Añada 200 microlitros de la mezcla de reacción a un miligramo de arabinoxilanos solubles en agua en un tubo de vidrio con tapa y mezcle utilizando un mezclador de vórtice.Incube la muestra durante dos horas a 65 grados Celsius en una campana extractora. Tras la incubación, enfríe la suspensión hasta temperatura ambiente y agregue cuatro volúmenes de etanol absoluto. Coloque la suspensión en refrigeración durante la noche para precipitar los polisacáridos.Luego, centrifugue la muestra y elimine el sobrenadante. Lave extensamente el botón con etanol absoluto, acetona y metanol, centrifugando entre cada lavado. Seque al vacío el botón a 40 grados Celcius durante la noche.Disuelva un miligramo de arabinoxilanos solubles en agua marcados con 2AB en 500 microlitros de tampón de acetato de sodio en un tubo de microcentrifugado. Añada cuatro unidades de endoxilanasa e incube a 37 grados Celsius durante 16 horas. Destruya la actividad enzimática calentando la mezcla de reacción durante 10 minutos en un baño de agua hirviendo.Enfríe la suspensión hasta temperatura ambiente y transfiérala a un tubo de vidrio con tapa. Después de agregar cuatro volúmenes de etanol absoluto, coloque la suspensión en refrigeración durante la noche para precipitar cualquier polisacárido no digerido. Centrifugue para obtener un precipitado de los polisacáridos no digeridos a partir de los oligosacáridos generados por endoxilanasa.Luego, vierta el sobrenadante en un tubo de plástico limpio y colóquelo en un baño de agua tibia. Evapore el etanol bajo una corriente de gas nitrógeno hasta alcanzar un volumen final. Congele el sobrenadante a menos 80 grados Celsius durante cuatro horas antes de secar el sobrenadante congelado en un liofilizador para recuperar los xilooligosacáridos.Para generar los xilooligosacáridos a partir de arabinoxilanos solubles KO8 y la etiqueta 2AB, consulte el protocolo escrito. Para preparar la solución de matriz MALDI, agregue una pequeña cantidad de DHB a 500 mililitros de acetonitrilo al 50 por ciento que contenga ácido fórmico al 0,1 por ciento en un tubo. Mezcle utilizando un vórtex.Si se disuelve rápidamente, agregue otra pequeña porción de DHB. Deposite las muestras acuosas nativas de oligosacáridos sobre una placa de objetivo para MALDI. Añada 0,3 microlitros de la solución de matriz MALDI utilizando una punta separada y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.Deje secar la mezcla a temperatura ambiente. Introduzca la placa objetivo en la fuente de MS y opere en modo de iones positivos. Ajuste el voltaje del acelerador a 19 kilovoltios en la fuente de iones uno y a 16,3 kilovoltios en la fuente de iones dos.Ajuste la potencia del láser a más del 70 por ciento. Seleccione el punto de muestra en la placa objetivo de MALDI y haga clic en iniciar para comenzar los disparos del láser. Analice los oligosacáridos generados por endoxilanasa nativa utilizando HPLC en nanoescala, acoplado a un instrumento de espectrometría de masas con ionización por electroaspersión y analizador cuadrupolo con tiempo de vuelo, con separación cromatográfica en línea mediante una columna C18 de fase reversa.Transfiera la mezcla acuosa de oligosacáridos generada por endoxilanasa a un vial y colóquelo en el muestreador automático de HCLC. Programe el gradiente de elución del cinco al 80 por ciento con las fases móviles de ácido fórmico al 0,1 por ciento en agua y ácido fórmico al 0,1 por ciento en acetonitrilo, respectivamente, durante 60 minutos. Ejecute el programa de cromatografía líquida y eluya los oligosacáridos.Pulse el botón de agregar muestra, escriba el nombre de la muestra y presione el botón de aceptar. Seleccione el archivo del método de espectrometría de masas y pulse el botón de enviar. A continuación, inicie la muestra.El cromatograma total de iones resultante, o TIC, se guarda automáticamente mediante el software. Abra el TIC guardado y seleccione extraer cromatograma. Escriba las masas esperadas en la línea de comandos.Analice el cromatograma haciendo clic en enter antes de procesar los escaneos de iones seleccionados utilizando el software según las instrucciones del fabricante. Introduzca uno o dos microlitros por muestra de oligosacárido metilado por O en acetonitrilo al 50 %, en una punta de nanospray usando una jeringa. Ajuste la nanospray con un cortavidrios para que encaje en el soporte de nanospray específico conectado al espectrómetro de masas. Configure la masa según el rango de masas esperado, el gas de cortina en 10, el voltaje de pulverización iónica en 1900 voltios y la polaridad en positiva.Pulse el botón de adquisición para abrir la ventana correspondiente. Luego, ingrese el nombre del archivo de datos para obtener un escaneo de iones totales antes de pulsar el botón de detención. Cambie el tipo de escaneo de ion producto a fragmento de una parte de interés.Introduzca la masa de interés para fragmentar y ajuste el rango de masas. Pulse el botón de adquisición y ajuste la energía de colisión para lograr la fragmentación completa del ion parental y adquirir un espectro de iones fragmento. Disuelva la mezcla de oligosacáridos generada por endoxilanasa en un mililitro de óxido de deuterio en un tubo de ensayo plástico de diez mililitros.Congele la suspensión a menos 80 grados Celsius durante cuatro horas antes de secar la suspensión congelada en un liofilizador para recuperar los xilooligosacáridos. A continuación, disuelva los oligosacáridos secos en 0,6 mililitros de óxido de deuterio y agregue 0,5 microlitros de acetona al cinco por ciento en óxido de deuterio como estándar interno. Transfiera los oligosacáridos deuterados al tubo de muestra de RMN.Sujete el tubo de RMN que contiene la muestra por la parte superior e inserte el tubo de muestra en un rotor de plástico. Coloque el rotor en el medidor de profundidad de muestra. Empuje o tire del tubo de muestra para ajustar la profundidad de la muestra y asegurarse de que la línea central de la parte superior e inferior de los medidores de profundidad sea igual.Retire el medidor de profundidad e inserte la muestra en el muestreador automático conectado a un espectrómetro de RMN de 600 megahercios equipado con una sonda criogénica. Proceda a realizar el experimento de RMN y analice los espectros resultantes según se describe en el protocolo del texto. Las señales en el espectro de MS de oligosacáridos MALDI-TOF derivados de arabinoxilanos solubles en agua nativos marcados con 2AB incluyen una serie de oligosacáridos neutros y ácidos de la región interna sin etiquetar, así como oligosacáridos originalmente marcados con 2AB en su extremo reductor.Se muestran aquí escaneos de iones seleccionados de los escaneos de iones elegidos de los cromatogramas MS con corte ESI de oligosacáridos nativos derivados de oligosacáridos de la región interna generados mediante tratamiento con endoxilanasa de arabinoxilanos solubles en agua marcados con 2AB. También se incluyen escaneos de oligosacáridos nativos derivados de oligosacáridos del extremo reductor con marcaje 2AB y oligosacáridos de región ácida generados de la misma manera. Los grupos hidroxilo sin metilar generados durante la fragmentación en fase gaseosa de oligosacáridos per-O metilados en MS producen una huella de diferencia de masa de 14 Dalton utilizada para identificar el patrón de ramificación y las secuencias glicosídicas.Cada cicatriz generada por el evento de fragmentación se marca como una línea continua, ya que varias estructuras isoméricas son posibles para una masa definida. Los iones Y se etiquetan en rojo, y los iones B se etiquetan en negro. El análisis de los espectros de MS en tándem con ionización por electrospray de glicósidos neutros y reductores per-O-metilados de alditol glicósido compuestos por cuatro residuos de azúcar de pentosa y xilitol a una relación masa/carga de 885 indica que la secuencia del extremo reductor del glicósido consiste en la cadena lateral de arabinosa unida al residuo de xilitol en el extremo reductor y/o tanto al xilitol en el extremo reductor como al residuo xilosilo penúltimo.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el perfilado por cromoprioransomicro y pulsos eléctricos para responder preguntas como la especificidad del epítopo de anticuerpos y el cribado rápido de cambios en la estructura fina. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la glicómica exploraran las características estructurales de los glicanos, incluyendo el tipo y patrón de sustituciones con residuos glicánicos o no glicánicos en diferentes tipos de tejidos, etapas de desarrollo y especies. Este enfoque puede aplicarse a otras clases de polisacáridos utilizando la endrohidrolasa adecuada.No olvide que trabajar con alida metálica y cianoborohidruro de sodio puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como usar guantes adecuados y trabajar en una campana extractora, al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

La biomasa vegetal es uno de los principales de carbono-neutral recurso renovable que podría ser utilizado para la producción de biocombustibles. La biomasa vegetal se compone principalmente de las paredes celulares, un material compuesto estructuralmente complejos denomina lignocelulosa. Aquí se describe un protocolo para un análisis exhaustivo del contenido y la composición de la lignina polifenólicos.

Análisis Integral de la composición de las paredes celulares vegetales (biomasa lignocelulósica) Parte I: La lignina

La biomasa vegetal es uno de los principales de carbono-neutral recurso renovable que podría ser utilizado para la producción de biocombustibles. La biomasa vegetal se compone principalmente de las paredes celulares, un material compuesto estructuralmente complejos denomina lignocelulosa. Aquí se describe un protocolo para un análisis exhaustivo del contenido y la composición de los hidratos de carbono de pared derivados.

Análisis Integral de la composición de las paredes celulares vegetales (biomasa lignocelulósica) Parte II: Los hidratos de carbono

Una manera rápida se describe para obtener información sobre la estructura de los polisacáridos en una matriz extracelular. El método tiene la ventaja de la especificidad de glycosylhydrolases y la sensibilidad de la espectrometría de masas permite pequeñas cantidades de materiales para ser analizados. Esta técnica se puede adaptar para utilizarse directamente sobre el tejido en sí.

Oligo perfiles Misa (OLIMP) de polisacáridos extracelulares

Perfiles de Polímeros Glycan la pared celular vegetal utilizando microarrays

Este protocolo tiene como objetivo presentar un método general para visualizar la lignina, la celulosa y la hemicelulosa en las paredes celulares de las plantas usando imágenes Raman y análisis multivariante.

Combinación de imágenes Raman y Análisis Multivariante para visualizar Lignina, Celulosa y Hemicelulosa en el Muro de la Célula Vegetal

Un protocolo para el análisis estructural de polisacáridos por electroforesis del gel (PACE), usando Manano como ejemplo, se describe.

Caracterización estructural de polisacáridos de pared celular mananos en plantas con ritmo

Se presenta un protocolo para preparar 13C,15marcado con N muestras de hongos y plantas para espectroscopia de RMN de estado sólida multidimensional y las investigaciones de la polarización nuclear dinámica (DNP).

Preparación de hongos y materiales vegetales para la elucidación estructural mediante RMN de estado sólido de polarización Nuclear dinámica

El perfil de polímeros de microarrays (MAPP) es una técnica de alto rendimiento para el análisis de la composición de glicanos en muestras biológicas.

Perfil de polímeros de microarrays (MAPP) para análisis de glicanos de alto rendimiento

El presente protocolo describe los procedimientos utilizados para estudiar y caracterizar las enzimas relacionadas con la pared celular, principalmente la β-1,3-glucanasa y la peroxidasa, en plantas de trigo. Sus niveles de actividad aumentan durante la interacción trigo-RWA y están involucrados en la respuesta de defensa de la planta a través del refuerzo de la pared celular, lo que disuade la alimentación de pulgones.

Elucidando #946;-1,3-glucanasa y peroxidasa, propiedades fisicoquímicas del mecanismo de defensa de la pared celular del trigo contra la infestación por Diuraphis noxia

Conformación de la proteína y la dinámica son claves para entender la relación entre estructura y función de proteínas. Intercambio de hidrógeno acoplada a espectrometría de masas de alta resolución es un método versátil para estudiar la dinámica conformacionales de proteínas, así como la caracterización de la proteína-ligando y proteína-proteína interacciones, incluidas las interfaces de contacto y los efectos alostéricos.

El análisis de dinámica de proteínas utilizando hidrógeno Intercambio de Espectrometría de Masas

Aprende a caracterizar secuencias glicosídicas de heteroxilanos de pared celular vegetal mediante marcado con 2-aminobenzamida, hidrólisis enzimática con endoxilanasas y análisis por espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear.

La secuenciación de pared planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilación) y (espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear) Técnicas Físicas (Video) | JoVE Journal

La secuenciación de pared planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilación) y (espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear) Técnicas Físicas

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