Name: El tratamiento de ratones con SCA1 hidrosolubles compuestos para no específicamente estimular la función mitocondrial (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Aprende a evaluar compuestos hidrosolubles mitocondriales para tratar la ataxia espinocerebelosa tipo 1 en ratones. Este método permite cuantificar efectos terapéuticos en comportamiento cerebelar y tejido.

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Nos gustaría agradecer al Dr. Harry Orr de la Universidad de Minnesota por su generoso regalo de ratones transgénicos. También nos gustaría agradecer a los siguientes ex alumnos de Skidmore College por su trabajo realizando los experimentos anteriores: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson y Cheyanne Slocum. Además, nos gustaría agradecer a Skidmore College por financiar el desarrollo de estos métodos.

<ol><li>Stucki, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+impairments+contribute+to+Spinocerebellar+ataxia+type+1+progression+and+can+be+ameliorated+by+the+mitochondria-targeted+antioxidant+MitoQ%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ.</a> Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).</li>
<li>Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mitochondrial+dysfunctions+in+the+brain%2C+from+mice+to+men%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men.</a> J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).</li>
<li>Breuer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+OXPHOS+dysfunction+in+the+development+of+neurologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases.</a> Neurobiol Dis. , (2012).</li>
<li>Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunctions+in+neurodegenerative+diseases%2C+relevance+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease.</a> Biomed Res Int. 2014, 175062(2014).</li>
<li>Burright, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCA1+transgenic+mice%2C+a+model+for+neurodegeneration+caused+by+an+expanded+CAG+trinucleotide+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat.</a> Cell. 82 (6), 937-948 (1995).</li>
<li>Clark, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+expression+of+a+mutant+allele+of+SCA1+in+transgenic+mice+leads+to+disparate+effects+on+motor+behaviors%2C+followed+by+a+progressive+cerebellar+dysfunction+and+histological+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations.</a> J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).</li>
<li>Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+tempol%2C+a+catalytic+scavenger+of+peroxynitrite-derived+free+radicals%2C+in+a+mouse+traumatic+brain+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).</li>
<li>Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+peroxidation-derived+reactive+aldehydes+directly+and+differentially+impair+spinal+cord+and+brain+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function.</a> J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).</li>
<li>Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+Q10+administration+increases+brain+mitochondrial+concentrations+and+exerts+neuroprotective+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).</li>
<li>Ferrante, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+creatine+in+a+transgenic+mouse+model+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease.</a> J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).</li>
<li>Ferrante, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effects+of+coenzyme+Q10+and+remacemide+in+transgenic+mouse+models+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease.</a> J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).</li>
<li>Hersch, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+in+Huntington+disease+is+safe%2C+tolerable%2C+bioavailable+in+brain+and+reduces+serum+8OH2%27dG%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG.</a> Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+with+coenzyme+Q10+and+creatine+produces+additive+neuroprotective+effects+in+models+of+Parkinson%27s+and+Huntington%27s+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases.</a> J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).</li>
<li>Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+Q10+reduces+beta-amyloid+plaque+in+an+APP%2FPS1+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).</li>
<li>Sandhir, R., Mehrotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin+supplementation+is+effective+in+improving+mitochondrial+dysfunctions+induced+by+3-nitropropionic+acid%2C+implications+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).</li>
<li>Ergonul, P. G., Nergiz, C. <a target="_blank" href="http://www.agriculturejournals.cz/publicFiles/31627.pdf">Determination of organic acids in olive fruit by HPLC.</a> 'Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).</li>
<li>Jones, B. J., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantiative+measurement+of+motor+inco-ordination+in+naive+mice+using+an+acelerating+rotarod%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod.</a> J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).</li>
<li>Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+motor+balance+and+coordination+in+mice+using+the+balance+beam%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+the+ataxin-1+protein+in+tissues+from+normal+and+spinocerebellar+ataxia+type+1+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals.</a> Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).</li>
<li>Klement, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-1+nuclear+localization+and+aggregation%2C+role+in+polyglutamine-induced+disease+in+SCA1+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice.</a> Cell. 95 (1), 41-53 (1998).</li>
<li>Serra, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+profiling+links+SCA1+pathophysiology+to+glutamate+signaling+in+Purkinje+cells+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice.</a> Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).</li>
<li>Carter, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+progressive+motor+deficits+in+mice+transgenic+for+the+human+Huntington%27s+disease+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation.</a> J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).</li>
<li>Anjomani Virmouni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+GAA-repeat-expansion-based+mouse+model+of+Friedreich%27s+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia.</a> Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Si se utilizan estos métodos como se describe, que son capaces de detectar y mitigar la disfunción mitocondrial fosforilación mediada oxidativo en modelos de ratones enfermedad neurodegenerativa cerebelosos. Los ensayos bioquímicos y de comportamiento combinados son métodos multifacéticos para determinar el grado de contribución a la patología mitocondrial enfermedad neurodegenerativa cerebelosa. Al tratar a los ratones con ácido succínico para estimular el metabolismo y estimular la función mitocondrial, que son capace...

Las mitocondrias son los productores principales de trifosfato de adenosina (ATP), una coenzima esencial para la energía celular, con la mayoría de ATP mitocondrial producido a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) usando la cadena de transporte de electrones. El cerebro, dada su alta demanda metabólica y su dependencia de la fosforilación oxidativa para la alimentación de la actividad neuronal, es altamente susceptible a la disfunción mitocondrial. Como resultado, la disfunción mitocondrial se activa durante el proceso de envejecimiento 1 y está implicada en la patogénesis de múltiples enfermedades neurodegenerativas 2, 3, 4. Por lo tanto, se deduce que las mitocondrias son dianas terapéuticas atractivas para la neurodegeneración. En este protocolo, hemos adoptado el uso de la ataxia espinocerebelosa tipo 1 (SCA1) como una enfermedad neurodegenerativa modelo para el estudio de las mitocondriasl disfunción y el desarrollo de terapias mitocondriales de orientación. SCA1 es causada por una mutación de poliglutamina (polyQ) expansión de repetición en el producto del gen ataxina-1 que desencadena la degeneración progresiva de las neuronas de Purkinje del cerebelo y neuronas de otras regiones del cerebro. La línea de ratón transgénico utilizado aquí (designado como el ratón SCA1), que expresa un polyQ-mutante ataxina-1 transgén bajo el control de un promotor específico de las células Purkinje, permite el análisis específico del componente de las células de Purkinje de SCA1 5. Los ratones con SCA1 sufren degeneración de las células de Purkinje gradual y desarrollan marcha atáxica 6. La disfunción mitocondrial complejo y la eficacia del tratamiento mitocondrial de orientación pueden ser evaluados con una batería de ensayos moleculares y de comportamiento. La disfunción mitocondrial complejo se mide ex vivo mediante ensayos que detectan la respiración alterada consumo de oxígeno en el tejido del cerebelo enla presencia de sustratos de cadena de transporte de electrones y los inhibidores de 7. Ensayos de respiración se han utilizado previamente con el tejido permeabilized, los aislados mitocondriales, y todo el tejido 7, 8, 9. Permiten una evaluación directa de la función mitocondrial a diferencia de los métodos de recopilación de datos morfológicos como la microscopía electrónica de transmisión o la tinción de inmunofluorescencia. El uso de todo el tejido en lugar de mitocondrias aisladas evita sesgos en la selección de las mitocondrias sanas que pueden ocurrir durante el proceso de aislamiento 7. Cuando se adapta al protocolo como se muestra, el ensayo de respiración es un valioso método para la detección de la disfunción mitocondrial en enfermedades neurodegenerativas del cerebelo. activadores no específicos del metabolismo pueden utilizarse para inferir la disfunción mitocondrial en modelos de ratones transgénicos de diseas neurodegenerativase y la ayuda en el desarrollo de nuevas terapias. La quercetina, la coenzima Q10 y la creatina han sido mostrado para mejorar la patología enfermedad neurodegenerativa en pacientes y en modelos animales de enfermedad neurodegenerativa 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Aquí presentamos un activador metabólico novela, ácido succínico, para estimular el metabolismo y estimular la función mitocondrial en la enfermedad neurodegenerativa. Para asegurarse de que el activador está cruzando la barrera hematoencefálica, HPLC se empleó para detectar la entrega al tejido neural en ratones tratados 17. Para evaluar los efectos terapéuticos de los compuestos solubles en agua metabólicamente específica tales como el ácido succínico, una batería de paradigmas de comportamiento y estudios inmunopatológicos se puede utilizar. due a los déficits de coordinación motora se encuentran en la enfermedad neurodegenerativa cerebelosa, el ensayo pista huella, ensayo de haz y la aceleración de ensayo de barra giratoria se usa para detectar rescate de la patología conductual 6, 18, 19. Estas medidas se complementan con la evaluación de inmunopatológico citoarquitectura cerebelosa mediante la evaluación de espesor molecular capa (definida como Purkinje de células dendríticas longitud Arbor) y de Purkinje recuentos soma celular dentro de un lóbulo definido de tejido cerebelar 6, 20, 21. Aquí presentamos varios métodos neuropatológicos y de comportamiento para la detección y el tratamiento de la disfunción mitocondrial con compuestos solubles en agua metabólicamente objetivo. Utilizamos el análisis ex vivo de la respiración mitocondrial para analizar la disfunción mitocondrial en el tran SCA1sgenic ratón. Además, se muestra que los síntomas de la enfermedad y la patología se mejoran por el ácido succínico refuerzo mitocondrial soluble en agua, implicando más que la disfunción mitocondrial en progresión de la enfermedad SCA1.

<table><tbody><tr><td>Difosfato de adenosina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2754</td><td>ADP</td></tr><tr><td>Ascorbato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>BSA</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-fenilindol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>DTT</td></tr><tr><td>Suero de burro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Glutamato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1446600</td><td></td></tr><tr><td>Malato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6994</td><td></td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Potasio-lactobionato</td><td>Bio-Azúcares</td><td>69313-67-3</td><td></td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Ácido succínico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime;,N&prime; -Tetrametil-p-fenilendiamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7394</td><td>TMPD</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U0631</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>11NQ anticuerpo (anti-ataxina-1 )</td><td></td><td></td><td>Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-ratón anti-anti-ratón</td><td></td> anti-11015 <td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-conejo anti-conejo anticuerpo secundario</td><td>Life Technologies</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>Calbindin anticuerpo (cabra)</td><td>Santa Cruz</td><td>C-20<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Control de ratones transgénicos</td><td>Harry Orr, Ph.D.</td><td>A02</td><td>Burright, et al. 1997, PMID: 9217978</td></tr><tr><td>ratones SCA1</td><td>Harry Orr, Ph.D.</td><td>B05</td><td>Burright, et al. 1997, PMID: 9217978</td></tr><tr><td>Ratones de tipo salvaje</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESM-100L micrótomo</td><td>ERMA</td><td></td><td>Sledge Microscopio</td></tr><tr><td>Fluoview FV1200 Microscopio Confocal</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de glicerol-gelatina</td><td>FD Neuro Technologies</td><td>PO101</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>VCAT 80465</td><td></td></tr><tr><td>OXYT1 Unidad de control de electrodos Oxytherm</td><td>Hansatech Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P.T.F.E. papel</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-08277-15</td><td></td></tr><tr><td>Rotallion Rotarod</td><td>PPP& G</td><td></td><td>póngase en contacto con el autor para correspondencia para obtener información</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 HPLC</td><td>Dionex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td><a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a></td></tr><tr><td>Cell counter plugin (for ImageJ)</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a></td></tr><tr><td>3P& G Rota-Rod v3.3.3 (software rotarod)</td><td>PPP& G Póngase</td><td></td><td>en contacto con el autor para correspondencia para obtener información</td></tr><tr><td>Phidget21.dll (necesario para el software rotarod)</td><td>DLL-Files.com</td><td></td><td><a href="https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html">https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html</a></td></tr></tbody></table>

el tratamiento de ratones con sca1 hidrosolubles compuestos para no específicamente estimular la función mitocondrial

Treating SCA1 Mice with Water-Soluble Compounds to Non-Specifically Boost Mitochondrial Function

La disfunción mitocondrial desempeña un papel significativo en el proceso de envejecimiento y en las enfermedades neurodegenerativas incluyendo varios degeneración espinocerebelosa hereditarios y otros trastornos del movimiento marcados por la degeneración progresiva del cerebelo. El objetivo de este protocolo es evaluar la disfunción mitocondrial en la ataxia espinocerebelosa tipo 1 (SCA1) y evaluar la eficacia de la orientación farmacológica de la respiración metabólica a través del ácido succínico compuesto soluble en agua para retardar la progresión de la enfermedad. Este enfoque es aplicable a otras enfermedades cerebelares y se puede adaptar a una serie de terapias solubles en agua. Análisis ex vivo de la respiración mitocondrial se utiliza para detectar y cuantificar los cambios relacionados con la enfermedad en la función mitocondrial. Con la evidencia genética (datos no publicados) y la evidencia de proteómica de la disfunción mitocondrial en el modelo de ratón de SCA1, evaluamos la eficacia del tratamiento con la dosis de refuerzo metabólico s soluble en aguaácido uccinic disolviendo este compuesto directamente en el agua potable jaula. La capacidad del fármaco para pasar la barrera hematoencefálica puede deducirse usando la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). La eficacia de estos compuestos puede ensayarse utilizando varios paradigmas de comportamiento entre ellos el rotarod de aceleración, prueba de barra de equilibrio y análisis de la huella. integridad cytoarchitectural del cerebelo se puede evaluar usando ensayos de inmunofluorescencia que detectan núcleos de las células de Purkinje y las dendritas de células de Purkinje y soma. Estos métodos son técnicas robustas para la determinación de la disfunción mitocondrial y la eficacia del tratamiento con los compuestos solubles en agua en la enfermedad neurodegenerativa cerebelosa.

A través de la orientación farmacológica de las mitocondrias cerebelosa con ácido succínico somos capaces de prevenir la disfunción mitocondrial en un modelo de ratón de la enfermedad neurodegenerativa SCA1 cerebelosa. El donador de electrones canónica de la succinato deshidrogenasa, ácido succínico, se disolvió en jaula de agua potable de los ratones con SCA1 durante un mes, con el comienzo evaluación de comportamiento durante la segunda semana de tratamiento y evaluación neuropatológic...

Presentamos un protocolo bioquímico y conductual para evaluar la eficacia de los compuestos solubles en agua dirigidos a las mitocondrias para el tratamiento de la ataxia espinocerebelosa tipo 1 (SCA1) y otras enfermedades neurodegenerativas cerebelosas.

El tratamiento de ratones con SCA1 hidrosolubles compuestos para no específicamente estimular la función mitocondrial

Mitochondrial dysfunction plays a significant role in the aging process and in neurodegenerative diseases including several hereditary spinocerebellar ...

El objetivo general de este experimento es observar y cuantificar los efectos terapéuticos de los activadores mitocondriales solubles en agua sobre el comportamiento y el tejido cerebeloso en ratones con ataxia cerebelosa espinal tipo uno. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la ataxia cerebelosa espinal, como si los déficits mitocondriales contribuyen a la patología de la enfermedad y si la enfermedad podría ser impedida por un activador mitocondrial soluble en agua. La principal ventaja de esta técnica es que el ácido succínico es un compuesto soluble en agua barato aprobado por la FDA que puede administrarse directamente en el cerebro a través del agua potable.Las implicaciones de esta técnica pueden extenderse a una terapia de otras enfermedades neurodegenerativas, ya que se encuentran déficits en los complejos de fosforilación oxidativa mitocondrial en múltiples enfermedades neurodegenerativas, incluidas el Alzheimer y la enfermedad de Huntington. Por lo general, los individuos nuevos en este método lucharán con la configuración inicial de los paradigmas de comportamiento, que pueden tener que ser ajustados para lograr resultados consistentes. La demostración visual de este método es beneficiosa porque los pasos del comportamiento pueden ser difíciles de reproducir a partir de una sección del método escrito, pero son fáciles de replicar con la ayuda de una grabación visual.Para comenzar este procedimiento, coloque la pista en un ligero ángulo hacia arriba hacia la caja de inicio, forrada con ropa de cama y comida de recompensa. A continuación, alinea una hoja de papel blanco en la pasarela. Permita que el mouse se aclimate a la caja de inicio durante cinco minutos.A continuación, elija un solo sujeto y pinte las patas traseras izquierda y derecha con pintura azul y roja no tóxica a base de agua, respectivamente. Después, coloque al sujeto al comienzo de la pasarela y permita que camine hasta la caja de inicio. Una vez que el sujeto haya llegado a la caja de inicio, cierre la trampilla y permita que permanezca dentro de la caja de inicio durante un minuto antes de regresar a la jaula de inicio respectiva.A continuación, limpie la pista y la caja de inicio con etanol al 30% y sustituya la ropa de cama, la comida de recompensa y el papel de la pista para la próxima prueba. Al mismo tiempo, recoja el papel de la pista después del experimento e inspeccione la prueba. Una prueba de huella exitosa se define como un mínimo de cinco huellas secuenciales en las que el sujeto camina hacia la caja dorada sin darse la vuelta ni detenerse.Ahora configure el aparato de vigas de acuerdo con las especificaciones de la cruz de barras con seis vigas diferentes. En un extremo del haz de luz se colocó una caja de casa oscura con comida de recompensa. Para entrenar a los sujetos en la viga, ensamble el aparato con la viga tres.Coloque suavemente el sujeto en el extremo del haz opuesto a la caja de inicio. Y deja que camine a través de la viga. Permita a cada sujeto hasta tres pruebas de dos minutos para lograr una ejecución exitosa.Que se define como cruzar la viga y entrar en el área de inicio en dos minutos. En el cuarto día de entrenamiento con la viga, ensamble el aparato con la viga uno. Y configura la caja de inicio.Coloque una cámara de video frente al aparato y verifique que el aparato de haz completo se pueda capturar claramente en video. Permita que el ratón atraviese el haz, grabando en vídeo cada ensayo y registrando el número de ensayos exitosos por sujeto por haz. En este paso, aclimate a los sujetos a su depósito de carril durante 10 minutos antes del inicio de la prueba.Durante este período de aclimatación, prepare el aparato rotarod limpiando cada carril del aparato con etanol al 30%. A continuación, abra el software rotarod. Establezca la configuración de inicio a cuatro RPM, la configuración de aceleración a cinco minutos y la configuración de velocidad final a 40 RPM para proporcionar una aceleración constante de cuatro a 40 RPM durante un período de cinco minutos.Después del período de aclimatación, coloque a los sujetos en el rotarod en sus respectivos carriles mientras la varilla gira a cuatro RPM. Una vez que todos los sujetos estén en sus respectivos carriles, comience la primera prueba. Registre la latencia de caída utilizando el software del instrumento.Se puede emplear un temporizador secundario como respaldo. Una vez finalizada la prueba, permita que cada sujeto descanse en sus respectivos depósitos de carril durante 10 minutos antes de la siguiente prueba para evitar la fatiga. En este procedimiento, conecte el tubo de la caja de control de temperatura de un micrótomo de trineo desde la etapa a un grifo del fregadero.Utilice la caja de control de temperatura para enfriar la etapa del micrótomo a 28 grados centígrados. A continuación, ajuste el dial de espesor de sección a 50 micrómetros. A continuación, aplique una porción del tamaño de una moneda de diez centavos de solución de venta libre en la plataforma.Antes de que el OTC se congele, use pinzas para colocar el hemisferio de modo que la superficie de corte sagital medio quede boca abajo sobre la capa de OTC. Oriente rápida y suavemente el tejido de modo que la punta lateral del hemisferio apunte hacia la hoja. Superior al escenario.Trabajando en capas, agregue OTC adicional alrededor del pañuelo y deje que el OTC se congele por completo antes de agregar la siguiente capa. A continuación, añade una fina capa de OTC sobre el pañuelo y congélalo. A continuación, seccione el tejido con el mismo peso corporal distribuido a la cuchilla de corte.Recoge las secciones con un pincel de artista fino. Y colóquelos en una placa de pocillo debidamente etiquetada que contenga un XPBS. Entre secciones, restablezca el espesor de corte a 50 micrómetros si es necesario.Después de seccionar, reemplace el PBS en cada pocillo de la placa con una solución de urea. Y coloca el plato sobre hielo. Cuando esté listo, transfiera la placa a un bloque calefactor ajustado a temperatura de ebullición para hervir las secciones en solución de urea con el fin de desenmascarar los epítopos para el inmunomarcaje.Entre cada paso de ebullición, enfríe el plato que contiene las secciones de tejido en hielo. Después de hervir, lavar las secciones tres veces, reemplazando la solución presente por un XPBS y agitando las secciones durante 10 minutos. A continuación, bloquee las secciones con una solución de suero de burro incubándolas en suero durante una hora con una suave agitación a temperatura ambiente.Ahora se pueden manchar secciones. Una vez etiquetadas, monte las secciones en portaobjetos recubiertos de gelatina al 2% con medio de montaje para reducir el fotoblanqueo. Cubra el engobe y seque durante la noche a cuatro grados centígrados.A continuación, selle los cubreobjetos con esmalte de uñas y guárdelos a cuatro grados centígrados. Usando un microscopio confocal de barrido, localice la fisura primaria del cerebelo bajo la luz de campo brillante. El paso más crítico del ensayo aminológico es localizar con precisión el tejido cerebeloso en los módulos cinco y seis A que flanquean la fisura primaria.El análisis de los patrones de tinción y los lóbulos inconsistentes garantizará la variabilidad en su resultado. Con un objetivo de 10X, escanee y excite secuencialmente los canales DAPI, Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 594. Utilizando un láser de diodo de 405 nanómetros, un láser de gas argón de 488 nanómetros y un láser de diodo de 559 nanómetros respectivamente, junto con un divisor de haz dicroico DM 488559 nanómetros.A continuación, separe y recoja la luz emitida utilizando divisores de haz SDM 490 y SDM 560 y un filtro de paso de banda BA 575675 respectivamente. El ácido succínico se disolvió en el agua potable de la jaula doméstica de ratones SCA1 durante cuatro semanas a partir de las 17 semanas de edad. Los ratones SCA1 comienzan a mostrar el fenotipo de ataxia a las cinco semanas de edad.Las evaluaciones conductuales se llevaron a cabo durante el período de tratamiento de la siguiente manera. Ensayo de la huella durante la semana 17. Ensayo de haz durante la semana 18 y aceleración de rotarod durante la semana 19.A las 20 semanas de edad, se sacrificaron ratones y se extrajo tejido cerebeloso para ensayos de aminopatología, ensayos de HPLC y ensayos de respiración. Aquí están los datos representativos del ensayo de huella que muestran una puerta de tipo salvaje tratada con un vehículo, una puerta SCA1 tratada con vehículo y una puerta SCA1 tratada con ácido succínico. Aquí, los datos del análisis del haz muestran la mejora en el rendimiento del haz de los ratones SCA1 con el tratamiento con ácido succínico.El tratamiento con ácido succínico mejora significativamente el rendimiento acelerado del rotarod de los ratones SCA1, como lo demuestra el aumento de la latencia a la caída. Al intentar este procedimiento, es importante recordar aplicar la técnica de manera consistente a cada sujeto durante múltiples ensayos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la respiración mitocondrial, para responder a preguntas adicionales, como la respiración a través de complejos individuales de fosforilación oxidativa mejorados después de la administración de ácido succínico.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar ensayos conductuales y neuropatológicos. Que evalúan la mejora del comportamiento cerebeloso y la citoarquitectura.

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