Un método mejorado para la rápida intubación de la tráquea en ratones

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una administración rápida, fácil y confiable de reactivos en los pulmones murinos a través de la intubación. El método también limita el riesgo de daño residual a los tejidos circundantes y es económico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos básicos de la biología pulmonar y los mecanismos de la enfermedad.

Como la lesión pulmonar aguda y la fibrogénesis. Las principales ventajas de esta técnica son que es altamente reproducible, fácil de dominar, no requiere equipo especializado ni largos tiempos de recuperación. El procedimiento debe realizarse con herramientas esterilizadas.

Por lo tanto, autoclave tanto las pinzas de extremo romo como el depresor. En una campana esterilizada, prepare un stock de trabajo de reactivo para administrar a través de la intubación. Se recomienda un volumen de bolo entre 30 y 45 microlitros.

Sonicar la solución durante 10 minutos a 35 kilohercios para asegurar una mezcla uniforme. Ahora, prepare el espacio de trabajo. Designe al menos un metro cuadrado de espacio para el espacio de trabajo en sí.

Así como ubicaciones distintas para los animales tanto antes como después del procedimiento. Ahora, prepare un tablero de procedimientos. Este modelo personalizado está cortado a partir de una chapa de aluminio y reforzado por un soporte en T.

También hay disponibles tableros comerciales similares. Con unas tiras de cinta adhesiva, fije la base de la placa de procedimiento al banco, de modo que quede directamente frente al experimentador. A continuación, ate una sutura de 4,0 entre los dos tornillos de posicionamiento de la placa de procedimiento.

A continuación, construya un espirómetro. Retire los émbolos de tres jeringas de un mililitro. A continuación, cargue hasta 60 microlitros de PBS en la parte superior de cada cilindro de jeringa.

Asegure sin apretar una de estas tres jeringas al centro de un catéter. Cuando está en uso, el aire que emana de la tráquea hará que el PBS en el cañón suba y baje. Colóquelo junto al tablero de procedimientos.

Coloque las otras dos jeringas adicionales al alcance de la mano para que sirvan como respaldos. A continuación, en una cuarta jeringa, aspire 300 microlitros de aire y colóquela a un lado de la tabla. También prepare unos trozos de cinta adhesiva de seis pulgadas para asegurar al animal a la tabla.

A continuación, instale una cámara de isoflurano si es necesario. Conecte las líneas de oxígeno, isoflurano y vacío a los puertos apropiados de la cámara y al vacío de holgura. Comienza anestesiando al ratón.

Es importante destacar que, debido a que factores como la edad, el peso y la salud del animal pueden modificar la respuesta a los anestésicos, cada laboratorio debe optimizar la exposición al isoflurano para satisfacer sus propias necesidades. Mientras espera, cargue el bolo de reactivo en la punta de una pipeta y déjelo a un lado. Cuando el ratón esté sedado, cuélguelo por sus incisivos superiores de la rosca en la plataforma de procedimiento, con el dorso del animal acostado contra la superficie de la plataforma.

Ahora, teniendo cuidado de no restringir la ventilación, pegue sin apretar la parte inferior de la cavidad torácica, justo por encima del diafragma, a la plataforma, para mantener al animal alineado durante el procedimiento. A continuación, configure el iluminador de cuello de cisne entre 80 y 100%Coloque la luz a uno o dos centímetros de la superficie de la piel cerca del plexo solar y verifique regularmente que no esté sobrecalentando la piel. Desde detrás de la plataforma, use las pinzas de extremo romo para ubicar la lengua.

Luego, teniendo cuidado de evitar los incisivos inferiores, agarre suavemente y saque la lengua de la cavidad oral. Mientras asegura la lengua, aplánela con el depresor en la mano no dominante, permitiendo que las pinzas se suelten. Ahora, guía el cuello de cisne aproximadamente desde el plexo solar hasta los bronquios del tallo principal para iluminar la tráquea.

La tráquea también se puede distinguir fácilmente por la acción de la respiración, lo que hará que la luz fluctúe en intensidad a medida que sale de la tráquea. Cuando se coloca correctamente, la tráquea puede verse como un pin central de luz, con una luz ambiental mínima en la cavidad bucal misma. El catéter no debe entrar en la cavidad bucal hasta que la vista de la tráquea sea ideal.

La tráquea no puede ser vista a través de la manipulación de la fuente de luz o del depresor. Los investigadores deben soltar la lengua y volver a intentar el procedimiento. A continuación, incline la jeringa para seguir el camino natural de la tráquea.

Y baje la punta del catéter de calibre 22, con la jeringa adjunta que contiene el PBS, directamente en el lumen. Ahora, introduzca el catéter en cinco milímetros adicionales y retire el depresor de la lengua. Si se coloca correctamente, la burbuja de PBS en el barril comenzará a subir y bajar con cada respiración.

Tenga paciencia cuando busque este indicador, ya que tanto la sedación intensa como la ligera pueden modificar la frecuencia de la respiración. A continuación, cambie la jeringa a la mano no dominante. Mientras sujeta el cubo, retire suavemente la jeringa dejando el catéter en su lugar.

Desde la mano dominante, deposite el bolo de reactivo preparado directamente en el centro del cubo del catéter. A continuación, coloque la segunda jeringa con 300 microlitros de aire y expulse el aire al cubo. Esto ayudará a asegurar que el bolo esté bien distribuido en los pulmones.

Ahora, retire la jeringa y reemplácela con una jeringa que contenga la burbuja de PBS. La burbuja continuará subiendo y bajando si el procedimiento se ha realizado con éxito. Ahora, retire el catéter y la cinta adhesiva.

Y coloque al animal en un lugar seco y cálido hasta que recupere la conciencia. Por lo general, en un par de minutos. Los ratones intubados fueron monitoreados diariamente para la pérdida de peso.

Los ratones se recolectaron a los cuatro, 10 y 17 días después de la intubación intratraqueal con bleomicina. Se recolectó y analizó el lavado broncoalveolar de estos pulmones. Los niveles elevados de IgM demostraron un aumento significativo de la permeabilidad pulmonar dependiente del tiempo, indicativo de disfunción de la barrera epitelial y/o endotelial.

Los pulmones derechos fueron fijados y teñidos con el tricrómico de Masson. Se cuantificó la respuesta fibrogénica, un marcador bien establecido del contenido total de colágeno. Los cortes histológicos evidenciaron engrosamiento del intersticio pulmonar dependiente del tratamiento y aumentos de las lesiones fibróticas.

Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en menos de un minuto si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la manipulación de los tejidos blandos que rodean la tráquea no es necesaria ni recomendable. Y puede comprometer tanto la salud del animal como la integridad del experimento.