Name: Un método mejorado para la rápida intubación de la tráquea en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprenda un método mejorado de intubación traqueal en ratones para administrar reactivos pulmonares de forma rápida y reproducible. Esta técnica minimiza el daño tisular y no requiere equipos especializados.

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Los autores agradecen a Brian Johnson, de la Histología y Imaging Core de la Universidad de Washington en busca de ayuda con la tinción de tricrómico y análisis. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones y HL098067 HL089455.

Los Comités Institucionales Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Washington y el Cedars-Sinai Medical Center han aprobado el trabajo con animales necesarios para estos estudios. 1. Preparación <ol><li> Esterilizar tanto las pinzas de extremos romos y el depresor través de autoclave. </li><li> El uso de una cabina de seguridad biológica, preparar una solución de trabajo de la BLM en PBS a partir del polvo liofilizado. Sonicar la solución durante 10 min a 35 Khz para asegurar una mezcla uniforme. Nota: Se recomienda un volumen total de entre 30 y 45 l para evitar la variación de pipeteado en el extremo inferior, y la asfixia con volúmenes más grandes. </li><li> Prepare un área de trabajo limpia que incluye aproximadamente 1 m 2 para el procedimiento en sí, así como los lugares designados para jaulas, tanto antes como después del procedimiento. </li><li> Fijar la base de la junta procedimiento para el banco inmediatamente delante del investigador poniendo 2 o 3 tiras de cinta de laboratorio a través de la base y SUBCARying banco. Ver Figura 1 para más especificaciones sobre la creación de una tabla. </li><li> Ate una sola longitud de tamaño de 4.0 hilo de sutura entre los dos tornillos de posicionamiento de la junta procedimiento. </li><li> Generar un espirómetro improvisada eliminando y desechando el émbolo de tres jeringas de 1 ml, y el depósito de 60 l de PBS en la parte superior de cada barril para formar un sello hermético. Asegurar el centro del catéter vagamente a una de las jeringas y colocarlo a un lado de la junta. </li><li> Aspirado de 300 l de aire en una jeringa de 1 ml y colocarlo a un lado de la junta. </li><li> Cortar una pieza adicional de cinta de aproximadamente 6 pulgadas de largo y el lugar de uno de los lados. Esto se utiliza para asegurar el animal a la junta en el paso 2.4. </li><li> Configurar una cámara de isoflurano. Adjuntar O2, isoflurano, y el vacío a los puertos apropiados tanto en la cámara de exposición y el vacío despacho. Alternativamente, administrar anestésico en un isoflurano-compatible biológicacabina de seguridad. </li></ol> 2. La intubación <ol><li> Anestesiar al ratón con isoflurano en la cámara hasta que se pierde la conciencia y la respiración se desacelera a un ritmo adecuado. Una exposición típica incluye 4% de isoflurano y 2% O 2 durante 3 a 4 minutos, y el resultado ideal es de 2 a 2,5 min de sedación. Esto corresponde a una tasa de respiración de 1 respiración cada 2 seg. </li><li> A la espera de la sedación a instaurarse, aspirado de entre 30 y 45 l de BLM en una pipeta y el lugar de uno de los lados. </li><li> Cuando esté listo, suspender el ratón sedado por sus incisivos superiores desde el hilo unido a los tornillos de posicionamiento de la plataforma procedimiento. Asegúrese de que el dorso del animal quede plana contra la superficie de la plataforma. </li><li> Teniendo cuidado de no restringir la ventilación, coloque un trozo de cinta sin apretar a través de la parte inferior (caudal) de la cavidad torácica, justo por encima del diafragma. La colocación debe ser lo suficientemente apretado para mantener la alineación adecuada durante el procedure, pero no tan apretado que restringe la respiración. </li><li> Encender el iluminador a entre 80% y 100% de intensidad y orientar el cuello de cisne de modo que es de 1 a 2 cm de la superficie de la piel, cerca del plexo solar. revisar periódicamente la punta del cuello de cisne para el calor para asegurarse de que no perjudique el ratón. </li><li> De pie detrás de la plataforma, utilizar las pinzas de punta roma, estériles para localizar la lengua. Teniendo cuidado de evitar los incisivos inferiores, suavemente agarre y sacar la lengua fuera de la cavidad oral. </li><li> Usando la mano restante, inserte el depresor y utilizarlo para aplanar la lengua contra el suelo de la cavidad oral. Liberar la pinza, pero deje el depresor en el lugar durante los siguientes dos pasos. </li><li> Oriente la luz para que la tráquea es visible al guiar el cuello de cisne proximalmente desde el nivel del plexo solar hasta que alcanza el nivel de la bronquios principales. Nota: La tráquea se puede distinguir fácilmente por la acción de la respiración, WHIch hace que la luz emitida a fluctuar en intensidad. Cuando está colocado correctamente, esta estructura será discernible en el plano axial como un pasador situado en el centro de la luz con la luz ambiental mínimo en la propia cavidad oral. </li><li> Ángulo de la jeringa para que siga el camino natural de la tráquea, y bajar la punta del catéter 22-G, con la jeringa unida que contiene la gota, directamente en el lumen. La burbuja PBS comenzará a subir y bajar con cada respiración sobre la colocacion exitosa. Nota: Esta acción se puede retrasar por varios segundos, como resultado de la sedación profunda. </li><li> Alimentar el catéter en un 5 mm adicionales. Retire el depresor de lengua. </li><li> Cambiar la jeringa con la mano opuesta, y agarrando el cubo, retire suavemente la jeringa. </li><li> Fuerte entre 30 y 45 l de BLM en el centro del interior del cubo del catéter, coloque la segunda jeringa y dispensar 300 l de aire en el cubo. </li><li> Vuelva a colocar la segundajeringa con la primera que contiene la burbuja de PBS. La burbuja seguirá subiendo y bajando si el procedimiento se ha realizado con éxito. </li></ol> 3. Cuidado post-procedimental <ol><li> Retirar el catéter y cinta, y colocar al animal en un lugar cálido y seco hasta que se recupere la conciencia - por lo general dentro de un par de minutos. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En los casos en que la aerosolización es poco práctico debido a la limitada disponibilidad de reactivos, la seguridad, o el coste, la administración directa de la tráquea es un método superior para la administración de agentes exógenos en los pulmones 16 transtraqueal instilación ha sido ampliamente utilizado para lograr esto.; Sin embargo, como con cualquier intervención quirúrgica, sino que también lleva consigo la posibilidad de complicaciones causadas por el procedimiento en sí, y no necesariamente el age...

A pesar de algunas diferencias anatómicas y fisiológicas, 1 modelos murinos continúan siendo de gran valor para el modelado de la biología humana y la patogénesis de la enfermedad. 2 Desde un punto de vista de la cría, los ratones son fáciles de manejar, tienen un tiempo de reproducción de baja, una esperanza de vida acelerada, y son relativamente baratos a casa. Con el desarrollo de diversas cepas genéticas y estrategias (por ejemplo., Knock-out condicionales, ratones reportero, enfoques de linaje de trazado, etc.), así como la amplia gama de reactivos disponibles (por ejemplo., Anticuerpos, proteínas recombinantes, inhibidores, etc.), los ratones se han convertido en un organismo modelo de vertebrados esencial para descubrir los procesos de homeostasis y enfermedades humanas. 3 Los ratones han sido especialmente valiosa para el estudio de enfermedades pulmonares, incluyendo lesión pulmonar aguda (ALI) y fibrosis pulmonar. 4 ALI en los seres humanos puede ser causado por trauma, lesión o sepsis y se caracteriza por epitelial yfuga endotelial (es decir., edema), la inflamación y la fibrosis incipiente. En muchos pacientes, ALI progresa a su forma severa, síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), que a menudo resulta en la fibrosis y la muerte por insuficiencia respiratoria. 5,6 La fibrosis pulmonar es una patología progresiva y fatal que se caracteriza por el exceso de deposición de la matriz extracelular , especialmente colágeno de tipo I, que lleva a la función pulmonar. 7,8 administración de bleomicina (BLM) es el modelo más ampliamente utilizado y mejor caracterizado para inducir ALI y fibrosis en animales de experimentación. 9 Aunque BLM inducida por la fibrosis pulmonar en roedores hace no recapitular completamente los fenotipos fibróticos humanos, 10 estudios con ratones con este modelo han llevado al descubrimiento de muchos factores importantes que influyen en la aparición y progresión de la enfermedad. 11 Aunque el mecanismo exacto (s) detrás de la fibrogénesis BLM inducida son desconocidos, la lesión iniciarse cree que surgen de la ruptura de cadenas de ADN dependientes del contacto en las células epiteliales que recubren las vías aéreas y los alvéolos, y, en particular, tipo 1 neumocitos. 12 La necesidad de un contacto directo entre la BLM y el epitelio pulmonar pone de relieve la importancia de una vía de administración robusta , y estas preocupaciones también son pertinentes para una amplia gama de tratamientos dirigidos a las vías respiratorias distales, incluyendo las proteínas recombinantes, anticuerpos, siRNA, virus, bacterias, partículas, y más. Aspiración orofaríngea (OPA) ha sido ampliamente utilizado para este fin 13, pero un importante una deficiencia de OPA es que alguna porción del agente suministrado puede ser tragado en el tracto gastrointestinal, lo que conduce a la imprecisión en la dosis administrada. Otro método ampliamente utilizado es la instilación transtraqueal, que implica la traqueostomía con anestesia fuerte como para exponer la tráquea y la instilación de un agente directamente en el tracto respiratorio. 14 Sin embargo, no sólo puede talesun procedimiento sea indeseable debido a su invasividad, pero también es mucho tiempo, requiere un poco de entrenamiento, y causa una lesión potente para el tracto respiratorio. 15,16 Varios protocolos se han desarrollado que implican la administración directa de los agentes en el tráquea sin la necesidad de intervención quirúrgica, 16,17,18,19,20 tiempos de recuperación pero estos métodos implican extendían causada por anestésicos potentes, el uso de equipo costoso (es decir., otoscopio / laringoscopio, tableros de procedimientos disponibles en el mercado, de fibra óptica cables, etc.), un exceso de manipulación en la cavidad oral, y la incertidumbre con respecto a la dosis. Este documento describe un método relativamente fácil de administración a través de intubación que permite al investigador rápida, económica y fiable a infundir un reactivo en el pulmón murino con riesgo limitado de daño residual a los tejidos circundantes.

<table><tbody><tr><td>Bleomicina inyectable, 30 unidades/vial</td><td>APP Pharmaceuticals, LLC</td><td>103720</td><td>Para obtener los mejores resultados, BLM debe suspenderse en PBS, alícuota y almacenarse como alícuotas liofilizadas de un solo uso</td></tr><tr><td>Pinza</td><td></td><td></td><td></td>de extremo romo</tr><tr><td>Depresor de lengua (es decir, electrodo de cuchilla Valleylab doblado, 2.4 ")&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>E1551G</td><td>Antes de usar, cree una curva de 45 grados a 1,5 cm de la punta de la hoja. También se puede crear un depresor adecuado a partir de cualquier implemento metálico de dimensiones similares.</td></tr><tr><td>Catéter Exel Safelet 22G X 1"</td> <td>Exel International</td><td>26746</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Jeringa de tuberculina desechable de punta deslizante (200/sp, 1600/ca)</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml Pipeta y puntas</td><td></td><td></td><td></td>de filtro</tr><tr><td>Iluminador Fiber-Lite. Modelo 181-1: Modelo 180 acoplado con el iluminador estándar de doble cuello de cisne</td><td>de Dolan Jenner Industries, Inc.</td><td>181-1</td><td>No se recomiendan los iluminadores LED de menor potencia, ya que no iluminan suficientemente la tráquea.</td></tr><tr><td>Tablero de</td><td></td><td></td> intubación <td>Ver diagrama 1.</td></tr><tr><td>Cinta de etiquetas de color: 0.5&nbsp; en. Ancho</td><td>Fisherbrand</td><td>15-901-15A</td><td></td></tr><tr><td>Oxígeno&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato, 1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td> El <td>producto debe ser estéril</td></tr><tr><td>Bobina de sutura trenzada negra de seda no estéril, 91,4 m, tamaño 4-0</td><td>Aparato Harvard</td><td>517698</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de anestesia de mesa Isoflurano</td><td>Highland Medical Equipment</td><td></td><td>http://www.highlandmedical.net/</td></tr> <tr><td>Cámara de isoflurano de ratón de inducción con tapa deslizante</td><td>MIP / Anesthesia Technologies</td><td>AS-01-0530-SM</td><td></td></tr><tr><td>FORANE (isoflurano, USP) Líquido para inhalación 100 mL&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sistema de patología digital Nanozoomer</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IgM ELISA Kit de cuantificación&nbsp;</td><td>Laboratorios Bethyl</td><td>E90-101</td><td></td></tr></tbody></table>

un método mejorado para la rápida intubación de la tráquea en ratones

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

A pesar de algunas diferencias anatómicas y fisiológicas, los modelos de ratón siguen siendo una herramienta esencial para estudiar la enfermedad pulmonar humana. La toxicidad de la bleomicina es un modelo comúnmente utilizado para estudiar tanto la lesión pulmonar aguda como la fibrosis, y se han desarrollado múltiples métodos para administrar bleomicina (y otros agentes tóxicos) en los pulmones. Sin embargo, muchos de estos abordajes, como la instilación transtraqueal, tienen inconvenientes inherentes, incluida la necesidad de anestésicos fuertes y cirugía de supervivencia. Este artículo informa sobre un método rápido y reproducible de intubación intratraqueal que implica anestesia inhalada leve, visualización de la tráquea y el uso de un espirómetro sustituto para confirmar la exposición. Como prueba de concepto, se administró a ratones C57BL/6 de 8-12 semanas de edad 2,0 U/kg de bleomicina o un volumen equivalente de PBS, y se midieron tanto el daño como los criterios de valoración fibróticos después de la exposición. Este procedimiento permite a los investigadores tratar a una gran cohorte de ratones en un período relativamente corto con poco gasto y un cuidado mínimo después del procedimiento.

Ratones intubados se controlaron diariamente para la pérdida de peso y la angustia, y se sacrificaron 4, 10 o 17 días más tarde a través de inyección intraperitoneal de 2,5% 2,2,2 tribromoetanol. Se recogió el lavado broncoalveolar (BAL) en tres lavados de PBS como se describe en otra parte 21 y el pulmón derecho se fijó en formalina al 10%, embebidos en parafina, y se tiñeron con tricrómico de Masson por la Universidad de Washington Histología y Imaging Core...

En este artículo se presenta un método rápido y sencillo para la administración de bleomicina directamente en la tráquea ratón a través de la intubación. Las principales ventajas de este método son que es altamente reproducible, fácil de dominar, y no requiere equipo especializado ni largos tiempos de recuperación.

Un método mejorado para la rápida intubación de la tráquea en ratones

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una administración rápida, sencilla y confiable de reactivos en los pulmones de ratones mediante intubación. El método también limita el riesgo de daño residual en los tejidos circundantes y es económico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología pulmonar básica y los mecanismos de las enfermedades.Como lesión pulmonar aguda y fibrogénesis. Las principales ventajas de esta técnica son que es altamente reproducible, fácil de dominar, no requiere equipo especializado ni tiempos prolongados de recuperación. El procedimiento debe realizarse utilizando instrumentos esterilizados.Autoclave tanto las pinzas de extremo romo como el depresor. En una cabina esterilizada, prepare un stock de trabajo del reactivo para administrar mediante intubación. Se recomienda un volumen en bolo entre 30 y 45 microlitros.Sonicar la solución durante 10 minutos a 35 kilohercios para asegurar una mezcla uniforme. Ahora, prepare el área de trabajo. Designe al menos un metro cuadrado de espacio para el área de trabajo propiamente dicha.Así como ubicaciones distintas para los animales tanto antes como después del procedimiento. Ahora, prepare una tabla de procedimientos. Este modelo personalizado está cortado de una lámina de aluminio y reforzado con una abrazadera en forma de T.También existen tableros comerciales similares. Utilizando unas tiras de cinta adhesiva, fije la base del tablero de procedimientos a la bancada, de modo que quede directamente frente al experimentador. Luego ate un trozo de sutura 4.0 entre los dos tornillos de posicionamiento del tablero de procedimientos.A continuación, construya un espirómetro. Retire los émbolos de tres jeringas de un mililitro. Luego, cargue hasta 60 microlitros de PBS en la parte superior de cada cilindro de jeringa.Sujete de forma suelta una de estas tres jeringas al conector de un catéter. Durante su uso, el aire que proviene de la tráquea hará que el PBS en el cilindro suba y baje. Coloque esto junto a la mesa de procedimientos.Coloque las otras dos jeringas adicionales al alcance para usarlas como respaldo. A continuación, aspire 300 microlitros de aire en una cuarta jeringa y colóquela a un lado del tablero. Prepare también algunos trozos de cinta de seis pulgadas de longitud para asegurar al animal al tablero.Luego, prepare una cámara de isoflurano si es necesario. Conecte las líneas de oxígeno, isoflurano y vacío a los puertos correspondientes de la cámara y del sistema de aspiración. Comience por anestesiar al ratón.Es importante que, dado que factores como la edad, el peso y la salud del animal pueden modificar la respuesta a los anestésicos, cada laboratorio optimice la exposición al isoflurano según sus propias necesidades. Mientras espera, cargue la dosis de reagente en la punta de una pipeta y colóquela aparte. Cuando el ratón esté sedado, suspéndalo por sus incisivos superiores del hilo en la plataforma de procedimientos, con el dorso del animal apoyado planamente sobre la superficie de la plataforma.Ahora, teniendo cuidado de no restringir la ventilación, sujete con cinta de forma floja la porción inferior de la cavidad torácica, justo por encima del diafragma, a la plataforma, para mantener al animal alineado durante el procedimiento. A continuación, ajuste el iluminador flexible al 80-100 %. Coloque la luz a uno o dos centímetros de la superficie de la piel cerca del plexo solar y verifique regularmente que no esté sobrecalentando la piel. Desde detrás de la plataforma, utilice la pinza de extremo romo para localizar la lengua.Luego, teniendo cuidado de evitar los incisivos inferiores, sostenga suavemente la lengua y extráigala de la cavidad oral. Mientras sujeta la lengua, aplánela con el depresor en la mano no dominante, permitiendo que las pinzas se suelten. Ahora, guíe el tubo de ganso desde el plexo solar hasta los bronquios principales para iluminar la tráquea.La tráquea también puede distinguirse fácilmente por la acción de la respiración, que hará que la intensidad de la luz fluctúe al salir de la tráquea. Cuando está correctamente posicionada, la tráquea puede observarse como un haz central de luz, con una luz ambiental mínima en la cavidad oral. El catéter no debe ingresar a la cavidad oral hasta que la visualización de la tráquea sea ideal.No es posible visualizar la tráquea mediante la manipulación de la fuente de luz o del depresor. Los investigadores deben soltar la lengua y volver a intentar el procedimiento. A continuación, incline la jeringa para seguir la trayectoria natural de la tráquea.Y baje la punta del catéter de calibre 22, con la jeringa acoplada que contiene el PBS, directamente hacia la luz. Ahora, introduzca el catéter unos cinco milímetros adicionales y retire el depresor lingual. Si está colocado correctamente, la burbuja de PBS en el cuerpo de la jeringa comenzará a subir y bajar con cada respiración.Sea paciente al buscar este indicador, ya que tanto la sedación profunda como la leve pueden modificar la frecuencia de la respiración. Luego, cambie la jeringa a la mano no dominante. Mientras sostiene el conector, retire suavemente la jeringa dejando el catéter en su lugar.Desde la mano dominante, introduzca directamente el bolo preparado del reactivo en el centro del conector del catéter. A continuación, conecte la segunda jeringa con 300 microlitros de aire e inyecte el aire en el conector. Esto ayudará a garantizar que el bolo se distribuya adecuadamente en los pulmones.Ahora, retire la jeringa y sustitúyala por una jeringa que contenga la burbuja de PBS. La burbuja continuará subiendo y bajando si el procedimiento se ha realizado con éxito. Ahora, retire el catéter y la cinta.Y coloque el animal en un lugar cálido y seco hasta que recupere la conciencia. Normalmente dentro de unos minutos. Los ratones intubados se monitorearon diariamente en busca de pérdida de peso.Los ratones se recolectaron a los cuatro, 10 y 17 días posteriores a la intubación intratraqueal con bleomicina. Se recolectó el lavado broncoalveolar de estos pulmones y se analizó. Niveles elevados de IgM demostraron un aumento significativo dependiente del tiempo en la permeabilidad pulmonar, indicativo de una disfunción de la barrera epitelial y/o endotelial.Los pulmones derechos se fijaron y tiñeron con tricrómico de Masson. Se cuantificó la respuesta fibrogénica, un marcador bien establecido del contenido total de colágeno. Las secciones de histología evidenciaron un engrosamiento del intersticio pulmonar dependiente del tratamiento y aumentos en las lesiones fibrosas.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de un minuto si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la manipulación de los tejidos blandos que rodean la tráquea no es necesaria ni recomendada. Y puede comprometer tanto la salud del animal como la integridad del experimento.

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Research

Investigación

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Medicine

Medicina

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