Name: Retroductal submandibular Glándula instilación y con localización fraccionado irradiación en un modelo de rata de hipofunción salival (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprende a administrar terapéuticos por vía retraductal en glándulas submandibulares de ratas usando cánulas de polietileno PE 10. Este método permite evaluar tratamientos localizados contra la disfunción salival inducida por radiación.

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Agradecemos al Dr. John Chang (Oncología Radioterápica, Centro de Ciencias de la Salud de LSU) por su ayuda con las mediciones de dosis de radiación. El estudio contó con el apoyo de la Sociedad Americana del Cáncer (número de subvención: 116945-RSG-09-038-01-CCE), el Instituto Nacional de Salud (número de subvención: R21CA173162) y el Centro Oncológico Feist-Weiller.

Todos los procedimientos fueron aprobados por la Salud LSU, Shreveport, Cuidado de Animales y el empleo y estaban de acuerdo con las directrices del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio. 1. La canulación de rata submandibular glándulas salivales <ol><li> Preparación de la jeringuilla de la tubería de Asamblea <ol><li> Cortar una longitud de 10 cm de tubo de polietileno PE10 con un bisturí. Sostenga los dos extremos de la tubería entre el dedo índice y el pulgar. Calentar la sección media de la tubería por encima de una llama suave, y estirar suavemente el tubo ablandado para duplicar su longitud tirando de ambos lados. </li><li> Corte el tubo en el medio con un bisturí en un ángulo de 45 ° para obtener 2 cánulas - cada uno con un extremo cónico. Expandir el extremo no afilado de la cánula por su montaje sobre una aguja 29 G de 0,5 cc jeringuilla de la insulina. </li><li> Retire la cánula, y dibujar 220 l de solución salina en la jeringa. Toque para desalojar las burbujas de aire. Montar el cannula sobre la aguja, y empuje el émbolo de la jeringa para expulsar el aire y asegurar la libre circulación de la solución a través de la cánula. Ajuste el volumen a 200 l. </li></ol></li><li> La canulación intra-oral de la glándula submandibular de conductos NOTA: instrumentos de autoclave antes del procedimiento, y esterilizar en-entre los procedimientos en un esterilizador de cuentas caliente. <ol><li> Pesar la rata Sprague Dawley, y dispensar el volumen calculado de ketamina (42 mg / kg) / xilazina (8 mg / kg) / acepromazina (1,4 mg / kg) de la mezcla en una jeringa hipodérmica. </li><li> Sujeción del animal sujetando la base de la cola entre el dedo índice y el pulgar de una mano y deslizando la otra mano sobre el cuerpo de captarlo. Descansar el dedo índice y medio a lo largo de los lados de la cabeza mientras se mantenga el torso con el pulgar y los dedos restantes. </li><li> Se inyecta la anestesia en la musculatura de las extremidades posteriores. Confirmar la profundidad de la anestesia mediante pizca dedo del pie y reflejo palpebral. Aplicar lubricante ocular para evitar la sequedad mientrasanimal es bajo anestesia. </li><li> Colocar el animal en una plataforma especialmente diseñada (Figura 1), e involucrar a los dientes incisivos superiores en la barra transversal. Tirar de la mandíbula inferior hacia abajo haciendo un bucle en una banda de goma alrededor de los incisivos inferiores y anclaje a la plataforma. </li><li> Pasar una sutura estéril a través de la lengua y la levante hacia arriba para levantar el suelo de la boca. Sujetar las suturas con una pinza hemostática, y pasarlo sobre la barra transversal. </li><li> Expandir las mejillas con un esparcidor de mejilla a la medida (Figura 1), y bajo un microscopio de disección localizar las papilas sublingual en el piso de la boca. </li><li> Tome el extremo cónico del tubo PE10 preformado mediante un delicado fórceps. manipular suavemente la punta de la cánula en el orificio ductal en la papila sublingual. Confirmar la colocación de la cánula enroscándolo 3-5 mm en el conducto; se asegure de pasar sin ninguna obstrucción. </li></ol></li><li> Glándula submandibular Instilación <ol><li> Inyectar atropina (0,5 mg / kg) por vía subcutánea en la piel del cuello, y esperar 10 minutos para una reducción en las secreciones salivares. </li><li> Asegurar la cánula al orificio del conducto con una gota de cianoacrilato (pegamento), y dejar secar. Infundir la solución en la glándula (200 l / glándula) presionando lentamente el émbolo de la jeringa a una velocidad de ~ 50 l / min. </li><li> Aplastar el tubo con una pinza hemostática, y retirar con cuidado la jeringa. Retener el tubo en el conducto durante 30 - 60 min hasta que el animal recupera la consciencia. Retire la sutura que mantiene la lengua. </li><li> Transferir el animal a una jaula separada, y el uso de una lámpara de calor para mantener el calor durante la recuperación. No dejar al animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado la conciencia para mantener la posición decúbito esternal. </li><li> Después de que el animal es totalmente ambulatoria, alojarlo en el vivero con acceso libre a alimento y agua. </li></ol></li></ol> 2. La irradiación localizada fraccionadode glándulas submandibulares <ol><li> Restringir el animal como se ha descrito antes, y anestesiar con la administración intramuscular de ketamina (33 mg / kg) / xilazina (6 mg / kg) / acepromazina (1 mg / kg) de la mezcla en la extremidad posterior. Confirmar profundidad de la anestesia, y aplicar lubricante a los ojos. </li><li> Coloque el decúbito supino sobre la mesa de animales acelerador lineal, y extender su cuello por la inclinación de la cabeza. Colimar el campo de radiación (3 cm ancho de la ranura) para abarcar el área desde el borde inferior de la mandíbula a la parte superior del esternón. </li><li> Coloque un bolo equivalente a tejido 1 cm sobre la región, y ajustar la distancia entre la fuente de radiación y la parte superior del bolo de 100 cm. </li><li> Irradiar el animal (2,5 Gy) utilizando un 6 MV de fotones de un acelerador lineal. Tasa de dosis, el tamaño del campo, y la distancia desde la fuente de radiación a la superficie de bolo dictará el tiempo de exposición. En la actual configuración, los animales se irradiaron con una dosis de ~ 1 Gy / min. </li><li> Repita la exposición; 2,5 Gy / día para un total de 8días; 4 días / semana con un intervalo de 2 días en el medio. Mantener caliente el animal durante la recuperación. Transferir el animal para el vivero después de que esté totalmente ambulatoria. </li><li> Recoger la saliva estimulada glándula submandibular 8 semanas después de la radiación para medir la función de la glándula 14. La eutanasia a los animales bajo anestesia mediante perfusión cardiaca de frío paraformaldehído al 4% / tampón fosfato salino pH 7,2. Extirpar las glándulas submandibulares para histológico e inmunohistoquímico análisis 14. </li></ol>

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<li>Tran, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+effects+of+bone+marrow+soup+restore+organ+function%2C+regeneration%2C+and+repair+in+salivary+glands+damaged+by+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Paracrine effects of bone marrow soup restore organ function, regeneration, and repair in salivary glands damaged by irradiation.</a> PLoS One. 8 (4), e61632(2013).</li>
<li>Nanduri, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salisphere+derived+c-Kit%2B+cell+transplantation+restores+tissue+homeostasis+in+irradiated+salivary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother+Oncol%22%5BJournal%5D)">Salisphere derived c-Kit+ cell transplantation restores tissue homeostasis in irradiated salivary gland.</a> Radiother Oncol. 108 (3), 458-463 (2013).</li>
<li>Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-mediated+gene+silencing+confers+radioprotection+to+salivary+glands+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo.</a> Mol Ther. 21 (6), 1182-1194 (2013).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las glándulas salivales a menudo reciben dosis de radiación más allá del umbral de la recuperación del tejido en pacientes sometidos a radioterapia para el cáncer de cabeza y cuello, la ablación electiva de los ganglios del cuello, o neoplasias malignas hematológicas regionales. Aunque las células acinares de fluidos secretores de la glándula son terminales diferenciadas, son paradójicamente sensibles a la radiación. La función secretora cae dentro de las primeras semanas de radiación, e irreversibles daños son el resul...

destrucción colateral de los tejidos sanos representa un número de deletéreos efectos secundarios de los tratamientos contra el cáncer. Una parte o la totalidad de las glándulas salivales mayores que se encuentran en los campos de radiación se destruyen inevitablemente. Por lo tanto, la mayoría de los pacientes sometidos a radioterapia para el cáncer de cabeza y cuello, linfoma de cuello de útero, o la radiación de todo el cuerpo antes del trasplante de médula ósea sufren uno de los efectos adversos más comunes y persistentes de la radiación, la hipofunción de las glándulas salivales 2-6. Las células acinares de fluido productoras de las glándulas salivales son extremadamente sensibles a la radiación. El daño a las glándulas salivales causa una disminución drástica del flujo salival, una condición que se refiere como hipofunción salival. La reducción crónica del flujo salival perjudica las actividades orales clave como la masticación, deglución, el habla y el gusto, pero las secuelas morboso de un intenso dolor, las lágrimas de las mucosas, disfagia, infecciones oportunistas, y la caries dental empeora unapaciente de bienestar y 2,3 función. Dado que la pérdida de células salival radioterapia asociada es irreversible, no existe un tratamiento correctivo de la xerostomía. El tratamiento actual que se centra en aliviando los síntomas con sustitutos salivales artificiales y drogas prosecretory es ineficaz para el alivio a largo plazo 6. Aunque las técnicas de administración de la radiación mejorados han ayudado a disminuir la gravedad de la enfermedad, la toxicidad tejido normal y sus complicaciones siguen siendo un factor limitante en el tratamiento del cáncer 6,7. medidas preventivas para evitar las complicaciones asociadas a la radioterapia son, por lo tanto, convirtiendo en la norma. Agentes de radio-protección que limpian las especies de oxígeno de radicales libres, repoblación de células de guarda, o mejoran la reparación del ADN están siendo exploradas para evitar la hipofunción salival 8-11. Las secreciones de las glándulas salivales exocrinas drenan en la boca a través de los principales conductos excretores. canulación intra-oral de THe conductos excretores para la inyección de medios de contraste se realiza de forma rutinaria como un procedimiento ambulatorio. Utilizando un enfoque similar, las glándulas salivales pueden ser dirigidos directamente para el tratamiento localizado 12. Además de reducir el riesgo de efectos secundarios sistémicos, la instilación glándula retroductal tiene beneficios adicionales. La disposición de monocapa de células salivales alrededor del árbol ductal permite la orientación de todas las células epiteliales salivales, y la encapsulación fibrosa de los actos de la glándula como una barrera para reducir la propagación terapéutico deseado. En esencia, las glándulas salivales son óptimamente adecuadas para el tratamiento dirigido de las aflicciones de la glándula como hipofunción salivales inducida por radiación. radiación convencional para el tratamiento del cáncer se entrega en dosis pequeñas (1.8 a 2.5 Gy / fracción / día, cinco días a la semana) durante un período de semanas. Por lo tanto, un producto terapéutico de radio-protección que muestra eficacia contra un esquema de radiación prolongada en modelos experimentales tiene mayor porte clínica. Comprofunción salival mised después de la radiación fraccionada ha sido registrado en los animales pequeños, pero fuente de radiación, la fracción de la dosis y los protocolos utilizados son variados 9,10,13. Este informe establece procedimientos para la administración de retroductal y radiación localizada de rata utilizando glándulas submandibulares fuente de radiación en el paciente relevante y la fracción de la dosis.

<table><tbody><tr><td>Tubo de polietileno Intramedic (PE10)</td><td>Becton Dickson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de insulina de 1/2 cc U-100</td><td>Becton Dickson</td><td>309306</td><td></td></tr><tr><td>Lágrimas artificiales</td><td>Miller Vet Supply&nbsp;</td><td>5098-9840-64</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de perlas</td><td>calientes Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de seda Perma-Hand</td><td>Pinza Ethicon</td><td>K833H</td><td></td></tr><tr><td>Graefe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico Olympus SZX16 Hunt</td><td>Óptica e imagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acelerador lineal de 6 MV</td><td>Elekta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bolo - Sin piel&nbsp;</td>Lámpara de calor <td>Civco</td><td>MTCB410</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Braintree Scientific</td><td>HL-1&nbsp; 110V</td><td></td></tr></tbody></table>

retroductal submandibular glándula instilación y con localización fraccionado irradiación en un modelo de rata de hipofunción salival

Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction

Los tejidos normales que se encuentran dentro de los portales de radiación se dañan inadvertidamente. Las glándulas salivales a menudo se lesionan durante la radioterapia de cabeza y cuello. El daño celular irreparable resulta en una pérdida crónica de la función salival que afecta las actividades orales básicas y aumenta el riesgo de infecciones orales y caries dentales. La hipofunción salival y sus complicaciones afectan gravemente la comodidad del paciente. El tratamiento sintomático actual de la afección es ineficaz y se necesitan terapias más nuevas para aliviar la afección. 
Las glándulas salivales son glándulas exocrinas, que expulsan sus secreciones a la boca a través de conductos excretores. La canulación de estos conductos proporciona acceso directo a las glándulas. La administración retroductal de un agente de contraste a las glándulas salivales principales es un procedimiento ambulatorio de rutina para el diagnóstico por imágenes. Con un procedimiento similar, es factible el tratamiento localizado de las glándulas. Sin embargo, la realización de esta técnica en estudios preclínicos con animales pequeños plantea desafíos únicos. En este estudio describimos la técnica de administración retroductal en glándulas submandibulares de rata, un procedimiento que fue perfeccionado en el laboratorio del Dr. Bruce Baum (NIH)1, y presentamos un procedimiento para la irradiación local de la glándula.

La adaptación de una técnica mínimamente invasiva sialografías, el tratamiento local de las glándulas salivales mayores es factible. Administración Retroductal en rata glándulas salivales submandibulares se intentó por canulación intra-oral de los conductos de Wharton (Figura 2). Los conductos salivales de Wharton abiertas en las papilas sub-lingual situado en el piso de la boca, pero los orificios no son fácilmente visibles. La inserción de la cánula fue, por tanto, hec...

La hipofunción de las glándulas salivales, un efecto adverso importante de la radioterapia de cabeza y cuello, disminuye la calidad de vida del paciente. La demostración de la eficacia de nuevas terapias en modelos animales es un requisito previo antes de la transición clínica. Este protocolo describe la administración retroductal y la irradiación local de las glándulas submandibulares de rata.

Retroductal submandibular Glándula instilación y con localización fraccionado irradiación en un modelo de rata de hipofunción salival

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. ...

El objetivo general de este procedimiento es administrar terapéuticas por vía retroductal a las glándulas submandibulares para evaluar su eficacia en la lucha contra la disfunción salival. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los trastornos de las glándulas salivales, como qué terapias pueden proteger contra o restaurar la función de las glándulas salivales frente a la radiación. La principal ventaja de esta técnica es que las glándulas salivales pueden tratarse localmente, reduciendo así el riesgo de efectos secundarios en tejidos no diana.Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque las aberturas de los conductos no son visibles y la cánula debe manipularse a ciegas dentro del conducto. Antes de comenzar el procedimiento, corte un trozo de tubo de polietileno PE 10 de diez centímetros de longitud con un bisturí; luego sujete ambos extremos del tubo entre el dedo índice y el pulgar de cada mano y caliente cuidadosamente la sección central del tubo sobre una llama suave, tirando simultáneamente de ambos extremos para estirar la sección ablandada hasta duplicar su longitud. A continuación, use un bisturí para cortar el t

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Un protocolo para la canalización de la glándula salival submaxilar del ratón a través de conductos de Wharton se describe. Para este experimento, la solución de azul tripán se usa como un tintorero para demostrar cómo esta técnica efectiva entrega infusiones en la glándula blanco, y sugerir la fiabilidad de este nuevo enfoque como un potencial clínico de drogas / terapia celular para la regeneración de las glándulas salivales.

Canulación de la glándula salival submaxilar del ratón a través del conducto de Wharton

La toxina botulínica se inyecta en las glándulas salivales para el tratamiento de la sialorrea. La inyección de toxina botulínica guiada por ultrasonido tanto en la glándula parótida como en la submandibular demuestra una eficacia sostenida y la ausencia de efectos secundarios graves.

Guiada por ultrasonografía Inyecciones de toxina botulínica-A: Un método para tratar sialorrea

Hipofunción de la glándula salival es una consecuencia frecuente de la terapia de radiación y enfermedad autoinmune. Evaluación reproducible de la función de la glándula salival en modelos de ratón de estas enfermedades es un desafío técnico. Aquí, se describe un método simple de medida preciso y reproducible de la producción de saliva de ratones.

Un método para la medición de la función de la glándula salival en ratones

Se describe un protocolo para exponer quirúrgicamente y estabilizar la glándula salival submaxilar murina intravital imagen usando microscopia intravital vertical. Este protocolo es fácilmente adaptable a otras glándulas exocrinas de la cabeza y región del cuello de los ratones y otros roedores pequeños.

Preparación de glándula salival submaxilar murino para la microscopia Intravital vertical

Entrega local de la droga a las glándulas submaxilares es de interés en biología de la glándula salival de entendimiento y para el desarrollo de nuevas terapias. Presentamos un protocolo de inyección de retroductal actualizada y detallada, diseñado para mejorar entrega exactitud y reproducibilidad experimental. La aplicación presentada en este documento es el de nanopartículas poliméricas.

Inyección de nanopartículas de Retroductal a la glándula submaxilar de ratón

Presentamos un enfoque detallado para realizar la colección de saliva, incluyendo traqueotomía murino y el aislamiento de tres glándulas salivales mayores.

Evaluación funcional salival murino mediante pilocarpina estímulo siguiente fraccionado radiación

El uso de cultivos organotípica tridimensionales para visualizar la morfología y los marcadores funcionales de las glándulas salivales puede proporcionar ideas novedosas sobre los mecanismos de daño tisular después de la radiación. Aquí se describe un protocolo de sección, cultura, irradiar, mancha, y la imagen de 50 – 90 μm grueso secciones de la glándula salival antes y después de la exposición a la radiación ionizante.

Tratamiento de radiación de cultivos organotípico de glándulas salivales submandibulares y parótidas modelos clave en vivo características

Las glándulas salivales se han propuesto como un sitio objetivo tisular para la terapia génica, especialmente en el área de la vacunación por transferencia de genes. Demostramos la entrega de genes en un modelo de primates no humanos utilizando infusión de parótida retrógrada.

Infusión de la glándula parótida retrógrada a través del conducto de Stensen en un primate no humano para la entrega de genes vectores

Las imágenes inmunofluorescentes están limitadas por la capacidad de observar procesos biológicos complejos y dependientes del tiempo en una sola instantánea en el tiempo. Este estudio describe un enfoque de imágenes en vivo realizado en cortes de glándula submandibular de ratón cortados con precisión. Este enfoque permite la observación en tiempo real de las interacciones célula-célula durante la homeostasis y los procesos de regeneración y reparación.

Interrogación de las interacciones célula-célula en la glándula salival a través de imágenes de células vivas ex vivo

Este protocolo describe la metodología para utilizar un dispositivo de fijación de labios en la biopsia de glándulas salivales labiales, junto con sus ventajas asociadas.

Un dispositivo de fijación de labios facilita la biopsia de la glándula salival labiosa para la enfermedad de Sjögren

Aprende a administrar terapéuticos por vía retraductal en glándulas submandibulares de ratas usando cánulas de polietileno PE 10. Este método permite evaluar tratamientos localizados contra la disfunción salival inducida por radiación.

Retroductal submandibular Glándula instilación y con localización fraccionado irradiación en un modelo de rata de hipofunción salival (Video) | JoVE Journal

Retroductal submandibular Glándula instilación y con localización fraccionado irradiación en un modelo de rata de hipofunción salival

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