Name: Métodos para descubrir uso promotor alternativo y la regulación transcripcional de murino BCRP1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Aprenda a detectar exones alternativos en Bcrp1 y a establecer ensayos reporteros de luciferasa para evaluar la actividad funcional de promotores alternativos en tejidos murinos. Este método utiliza análisis in silico.

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Este trabajo fue apoyado por becas por mérito de revisión a Douglas D. Ross y a Arif Hussain, del Departamento de Asuntos de Veteranos.

1. predicción in silico de los primeros exones alternativos de BCRP1 Uso del análisis BLAST de la base de datos de EST de ratón Nota: Este protocolo se describe cómo buscar la etiqueta de secuencia expresada ratón (EST) base de datos de EST con similitud de secuencia con el exón 2 de BCRP1 (que contiene el sitio de iniciación de la traducción) y luego la forma de alinear las secuencias EST que coinciden con las secuencias genómicas para determinar su ubicación en el gen BCRP1 ratón en relación con el extremo 5 &#39;de BCRP1 exón 2. <ol><li> Obtener la secuencia de BCRP1 ratón exón 2 mediante la introducción del ARNm secuencia de referencia ID (NM_011920.3) en la ventana de búsqueda de la Ensembl Genome Browser 17, haga clic en &quot;IR&quot;. En la siguiente pantalla, seleccione una secuencia de longitud completa (contiene 16 exones): <ol><li> En la siguiente pantalla ( &quot;Pantalla basada en la transcripción&quot;), seleccione &quot;16 exones.&quot; Esto mostrará una pantalla que contiene la secuencia de todos los exones de BCRP1. Exón 2 de BCRP1 leerá &quot;59; -AAAGGC ... TATCAA-3 &#39; &quot;Los resultados obtenidos serán similares a los mostrados en la referencia 18.. </li><li> Haga clic en la opción &quot;Descargar secuencia&quot;. En la siguiente pantalla, seleccione el formato FASTA, y luego haga clic en &quot;Vista previa&quot;. En la siguiente pantalla, copiar la secuencia preliminar del exón 2 en el portapapeles. </li></ol></li><li> Navegue hasta la página 19 BLAST en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) sitio web 20. <ol><li> Seleccionar genoma &quot;ratón&quot;. Pegue la secuencia del exón 2 del portapapeles en el cuadro de consulta. </li><li> Seleccione &quot;EST&quot; en el menú desplegable de base de datos, optimizar para &quot;secuencias muy similares,&quot; y luego elija &quot;BLAST&quot;. El tiempo de ejecución se llevará unos minutos. Cuando la carrera BLAST se haya completado, aparecerá la página &quot;Resultados&quot;. </li><li> Bajo el subtítulo &quot;Descripción&quot; de la página &quot;Resultados&quot;, seleccione &quot;TODO&quot;, después en &quot;Descargar&quot; y luego &quot;FASTA (completasecuencia) &quot;en el menú desplegable, y luego elegir la opción&quot; Continuar &quot;aparecerá un archivo .txt;. abierta y copiar todo el archivo en el portapapeles El archivo .txt contiene las secuencias de todas las tecnologías ecológicamente racionales con alta similitud de secuencia con el exon2 BCRP1 ratón. pero no su posición en relación con el exón 2 del gen BCRP1. Nota: Un análisis realizado el 15 de abril el año 2015 identificó 14 EST murinos que alineado con BCRP1 exón 2. Estos se enumeran en la Tabla 1. </li></ol></li><li> Identificar la localización de la secuencia de EST que es 5 &#39;para el exón 2 en el gen BCRP1. El gen de ratón BCRP1 se encuentra en el cromosoma 6 NC_000072.6 contig (GI: 372099104). <ol><li> En la página de inicio BLAST bajo el subtítulo &quot;explosiva Especializada&quot;, seleccione &quot;Alinear dos (o más) secuencias utilizando BLAST (bl2seq).&quot; </li><li> Pegar el archivo de texto del portapapeles en el cuadro de búsqueda y escriba en el cuadro 372099104 secuencia sujeto. Optimizar para &quot;secuencias muy similares&quot; del programaselección, y la explosión de correr. </li><li> Una vez que aparezca la ventana de resultados, ver las alineaciones gráficamente haciendo clic en &quot;Gráficos&quot; en la ventana &quot;alineaciones&quot;. Usa las flechas derecha e izquierda y hacer zoom para centrarse en BCRP1 / Abcg2 y los alineamientos de secuencias. </li><li> Guarde los alineamientos de secuencias: seleccionar &quot;ALL&quot; en el cuadro &quot;Descripción&quot;, a continuación, en el menú desplegable &quot;descarga&quot; seleccionar &quot;Hit mesa (CSV),&quot; y haga clic en &quot;continuar&quot;. Este archivo contiene la secuencia de alineación de BCRP1 exón 2 y la alineación de todas las secuencias EST con similitud de secuencia a BCRP1 exon2 relativos a la numeración de los nucleótidos en el cromosoma de ratón contig 6. Cada secuencia completa EST puede generar múltiples alineaciones que abarcan las regiones 5 &#39;y 3&#39; con el exón 2, incluyendo las secuencias solapantes con BCRP1 exón 2. </li><li> A medida que la posición del extremo 5 &#39;del exón 2 corresponderá al nucleótido 58.655.638 en el contig cromosoma 6, designar esto como1, y luego calcular la posición de las secuencias parciales de cada EST 5 &#39;a 58.655.638. Los resultados para los 14 ESTs se dan en la Tabla 1. Nota: Tenga cuidado para analizar secuencias EST que son 5 &#39;a 1 (es decir, tienen un valor de nucleótidos negativo) como posibles primeros exones. Por ejemplo, en dos de los ESTs que alineados con BCRP1 exón 2 se muestra en la Tabla 1 (AI647825 y AI664571) la secuencia restante era 3 &#39;al exón 2. </li></ol></li></ol> Función 2. Evaluación de BCRP1 Alternativa Promotor <ol><li> Diseño del reportero construye para BCRP1 E1U, E1A, E1B y promotores E1C <ol><li> Utilizando la secuencia de E1U obtenido a partir de la búsqueda de la base de datos de EST, designar a la primera 5 &#39;de nucleótidos de E1U como 1. </li><li> Obtener un cromosoma artificial bacteriano (BAC) en los clones de ratón cromosoma 6 que contiene la secuencia del gen BCRP1 / Abcg2 y la secuencia de al menos 100 kb aguas arriba de laBCRP1 / gen Abcg2 (véase la lista de materiales y equipos). <ol><li> Identificar un vector indicador adecuado, tal como la luciferasa plásmido reportero pGL3-Basic. </li><li> Determinar los múltiples sitios de clonación en el vector reportero. KpnI, SacI, Mlu1, NheI, SmaI, XhoI, BglII y HindIII son los sitios de endonucleasas de restricción en el sitio de clonación múltiple del vector pGL3-Basic, en el 5 &#39;a 3&#39;. Nota: La secuencia de los sitios de digestión está disponible de catálogos de productos de empresas que producen las enzimas de restricción. </li><li> Identificar todos los sitios de digestión en el exón E1U y la región 2 kb 5 &#39;de E1U el uso de programas de software como DNA5. Identificar al menos dos sitios de digestión en el sitio de clonación múltiple pGL3-Basic que no se encuentran en E1U o la región aguas arriba 2 kb. Nota: Asegúrese de elegir un sitio de restricción sitio de clonación múltiple para el cebador directo que se encuentra aguas arriba de la elegida para el cebador inverso para garantizar que la inserción Will estar en la orientación apropiada. </li></ol></li><li> Preparar adelante y cebadores para PCR que contienen las secuencias de los sitios de restricción múltiples sitios de clonación de endonucleasa de pGL3-basic seleccionados utilizando servicios de síntesis de genes / cebadores comerciales o software de selección de imprimación (véase la lista de materiales y equipos) revertir. Seleccionar un cebador directo localizado ~ 2 kb aguas arriba de la secuencia de E1U y un cebador inverso dentro de la secuencia E1U. Los cebadores utilizados en los autores anteriores trabajos incorporan un sitio SacI en el cebador directo y un sitio NheI en el cebador inverso, y se amplificaron la región genómica de aproximadamente -1906 a 64 con el primer nucleótido 5 &#39;de E1U especificado como + 1 (véase el paso 2.1.1 anterior), y se proporcionan en la referencia 16. <ol><li> Amplificar por PCR la región genómica E1U usando estos cebadores, 0,01 a 1 g de la CAV, y PCR Master Mix contiene polimerasas Taq de alta fidelidad (véase la lista de materiales y equipos) con desnaturalización a95 ° C durante 30 segundos, luego 35 a 40 ciclos de PCR, con extensión a 72 ° C (2 min), y el recocido y las temperaturas de fusión en base a las características de fusión de los cebadores utilizados. Nota: El uso de polimerasas Taq de alta fidelidad es esencial para la secuenciación de regiones promotoras que tienen un alto contenido de GC. Cuando el uso de grandes fragmentos de ADN genómico como un BAC como la plantilla, la estructura secundaria del ADN genómico puede hacer que sea difícil para los cebadores de PCR para unen. Si surge este problema, mejores resultados de la PCR se pueden obtener si la plantilla de ADN genómico largo se corta suavemente mediante sonicación antes de la reacción PCR. </li><li> Verificar la longitud del producto de PCR amplificado mediante la comparación contra una escalera de ADN de 1 kb mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% TAE. </li></ol></li><li> Se digiere el producto de PCR obtenido y el vector pGL3-Basic, utilizando las endonucleasas de restricción específicas para los sitios de digestión de restricción introducidos en el avance y retroceso cebadores según instrucciones suministradas con las enzimas de digestión de restricción. <ol><li> Purificar las reacciones de digestión usando gel SV comercial y kit de PCR Clean-Up Sistemas (véase la lista de materiales y equipos), siguiendo el protocolo del kit 21. <ol><li> Verificar la digestión y linealización del vector mediante la comparación contra el vector sin cortar utilizando electroforesis en gel de agarosa, luego se corta y se purifica la banda de ADN vector digerido. Medir la concentración del producto de PCR purificado y el vector se purificó usando espectrometría UV (véase la lista de materiales y equipos). </li></ol></li></ol></li><li> Prepare la construcción de reporte E1U ligando el purificada, la enzima de restricción digiere el producto PCR y la luciérnaga vector indicador de luciferasa pGL3-Basic (contenida en el kit de ensayo de indicador; véase la lista de materiales y equipo) a insertar: relaciones vectoriales de 11, 21 y 31, utilizando el &quot;T4 ADN ligasa kit de ligación rápida&quot; según las instrucciones del kit 22, produciendo de este modo la E1U rconstructo eporter, llamado pGL3-E1U. <ol><li> Utilice el plásmido pGL3-E1U para transformar bacterias para ampliar clonal pGL3-E1U siguientes instrucciones en el kit de clonación TA (véase la lista de materiales y equipos). </li><li> Confirmar la orientación y la fidelidad del inserto mediante análisis de secuencia. </li></ol></li><li> Preparar reportero construye para E1A, E1B y E1C utilizando metodología similar a la de E1U. Confirmar la fidelidad de los insertos mediante secuenciación descrito en el apartado 2.1.5.2. Nota: Los insertos de promotor para E1A, E1B y E1C deben ser aproximadamente -1875 / + 10, -1847 / + 60, y -1904 / + 83 con relación a la primera 5 &#39;de nucleótidos (designada como 1) de E1A, E1B, o E1C, respectivamente. </li></ol></li><li> Métodos de ensayo de indicador Nota: Estrategia general de los ensayos de reportero: el promotor putativo (región 5 &#39;aguas arriba) de un gen se inserta en el sitio de clonación múltiple de un vector vacío &quot;reportero&quot; que contiene un &quot;Reporter gen &quot;(por ejemplo, luciferasa de luciérnaga) aguas abajo del sitio de clonación múltiple. El vector se transfecta luego en células eucariotas que expresan el gen de interés. Los factores que actúan en trans que promueven la expresión del gen de interés en estas células debe activar el promotor en el vector reportero transfectadas, causar la expresión de la luciferasa de luciérnaga, que puede ser fácilmente cuantificó con un ensayo de luminiscencia. <ol><li> Seleccione la línea celular apropiada a utilizar para el ensayo de indicador. Nota: Para evaluar la actividad del constructo reportero de promotor alternativo E1U, es necesario transfectar que constructo en células que expresan BCRP1 bajo el control del promotor E1U. La línea de células de Sertoli murino TM4 (véase la lista de materiales y equipo) y expresa la proteína BCRP1 BCRP1 ARNm contiene E1U, así como E1A, E1B, y E1C 5. Como control negativo, considerar el uso de una línea celular que no expresa la proteína BCRP1 o ARNm. </li><li> Cultura del ce TM4LLS en placas de 24 pocillos a una densidad inicial de 200.000 células / pocillo en una mezcla 1: 1 de medio F12 de Ham y medio de Eagle modificado de Dulbecco con bicarbonato de sodio 1,2 g / L, HEPES 15 mM suplementado con suero de caballo al 5%, 2,5% suero fetal bovino, penicilina (100 UI / ml) y estreptomicina (100 mg / ml), a 37 ° C, 5% de CO 2, como se describe anteriormente 5. </li><li> Seis horas después de colocar las células en cultivo, transfectar las células con 0,2 g de vacío vector pGL3-basic o con 0,2 g de vector pGL3 que contiene el E1U -1906 / + 64 o -1875 / + 10 E1A o -1847 / + 60 E1B o -1904 / + 83 E1C BCRP 1 deleción construir junto con 4 ng de pRL-TK (una luciferasa que expresan vector de Renilla) como control interno, utilizando un kit de transfección de ADN comercial y el protocolo del fabricante 23 (véase la lista de materiales y equipos) . </li><li> 30 horas después de la transfección, retire el medio de crecimiento de la cultured células transfectadas. Se lavan las células una vez con 200 l de PBS, a continuación, eliminar la solución de lavado. <ol><li> Medida de la luciérnaga y la actividad de luciferasa de Renilla utilizando un kit comercial de acuerdo con los protocolos del fabricante 24. </li></ol></li><li> Expresar la actividad para cada tubo como la relación de la actividad luciferasa de luciérnaga dividido por el control interno (Renilla luciferasa); resultados globales se expresan generalmente como la actividad de cada construcción informadora con relación a la de las células transfectadas con el vector básico pGL3 vacío, que se da un valor de 1. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversification+of+transcriptional+modulation%3A+large-scale+identification+and+characterization+of+putative+alternative+promoters+of+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes.</a> Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).</li>
<li>Doyle, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multidrug+resistance+transporter+from+human+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).</li>
<li>Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+breast+cancer+resistance+protein+%28BCRP%2FABCG2%29+in+cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance.</a> Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).</li>
<li>Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+resistance+protein+%28Bcrp%29+and+the+testis--an+unexpected+turn+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis--an unexpected turn of events.</a> Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).</li>
<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcrp1+transcription+in+mouse+testis+is+controlled+by+a+promoter+upstream+of+a+novel+first+exon+%28E1U%29+regulated+by+steroidogenic+factor-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1.</a> Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).</li>
<li>Maliepaard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+and+distribution+of+the+breast+cancer+resistance+protein+transporter+in+normal+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues.</a> Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).</li>
<li>Fetsch, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+ABCG2+mitoxantrone+resistance-associated+protein+in+normal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues.</a> Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).</li>
<li>Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localisation+of+breast+cancer+resistance+protein+in+microvessel+endothelium+of+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain.</a> Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).</li>
<li>Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+ABCB1+and+ABCG2+in+human+placental+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue.</a> Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).</li>
<li>Xiong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCG2+is+upregulated+in+Alzheimer%27s+brain+with+cerebral+amyloid+angiopathy+and+may+act+as+a+gatekeeper+at+the+blood-brain+barrier+for+Abeta%281-40%29+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ABCG2 is upregulated in Alzheimer's brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides.</a> J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).</li>
<li>Woodward, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+urate+transporter%2C+ABCG2%2C+with+a+common+functional+polymorphism+causing+gout%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).</li>
<li>Huls, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+breast+cancer+resistance+protein+transporter+ABCG2+is+expressed+in+the+human+kidney+proximal+tubule+apical+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane.</a> Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).</li>
<li>Nakanishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+5%27+untranslated+region+variants+of+BCRP+mRNA+are+differentially+expressed+in+drug-selected+cancer+cells+and+in+normal+human+tissues%3A+implications+for+drug+resistance%2C+tissue-specific+expression%2C+and+alternative+promoter+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel 5' untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage.</a> Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).</li>
<li>Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gene+expression+by+alternative+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Regulation of gene expression by alternative promoters.</a> FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).</li>
<li>Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+mouse+Abcg2+mRNA+during+hematopoiesis+is+regulated+by+alternative+use+of+multiple+leader+exons+and+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters.</a> J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).</li>
<li>Natarajan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+major+alternative+promoter+regulating+Bcrp1%2FAbcg2+expression+in+the+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine.</a> Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).</li>
<li>Ensembl Genome Browser. , 
 <a target="_blank" href="http://Ensembl.org">http://Ensembl.org</a> (2015).</li>
<li>Transcript-based Display from Ensembl. , 
 <a target="_blank" href="http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822">http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822</a> (2015).</li>
<li>Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST) homepage. , 
 <a target="_blank" href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome</a> (2015).</li>
<li>National Center for Biotechnology Information (NCBI). , 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov">http://www.ncbi.nlm.nih.gov</a> (2015).</li>
<li>Promega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Wizard%C2%AE+SV+Gel+and+PCR+Clean-Up+System+-+INSTRUCTIONS+FOR+USE+OF+PRODUCT%22">Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System - INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT</a>. , (2009).</li>
<li>New_England_Biolabs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Quick+Ligation+Kit+Protocol+-+M2200S%22">Quick Ligation Kit Protocol - M2200S</a>. , (2014).</li>
<li>Roche. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22XtremeGENE+HP+DNA+Transfection+Reagent+Protocol+-+Manual+version+1.0%29%22">XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol - Manual version 1.0)</a>. , (2010).</li>
<li>Promega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Quick+Protocol+for+the+use+of+the+Dual-Luciferase+Reporter+Assay%22">Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay</a>. , (2009).</li>
<li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+landscape+of+the+mammalian+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional landscape of the mammalian genome.</a> Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).</li>
<li>VanBuren, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly%2C+verification%2C+and+initial+annotation+of+the+NIA+mouse+7.4K+cDNA+clone+set%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set.</a> Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).</li>
<li>Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+and+subtraction%3A+two+approaches+to+facilitate+gene+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery.</a> Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).</li>
<li>Okazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+mouse+transcriptome+based+on+functional+annotation+of+60%2C770+full-length+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs.</a> Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).</li>
<li>Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+controls%3A+the+role+of+alternative+promoters+in+mammalian+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes.</a> Trends Genet. (11), 640-648 (2009).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Bulun, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aromatase+expression+in+breast+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue.</a> Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).</li>
</ol>

Douglas D. Ross y la Universidad de Maryland, Baltimore tienen derechos de patente a BCRP humana.

La mayoría de los métodos y resultados representativos presentados se describen en el trabajo anterior titulado &quot;B CRP1 la transcripción en los testículos del ratón es controlado por un promotor aguas arriba de un nuevo primer exón (E1U) regulada por el factor 1 de esteroides, a la&quot; que fue publicado en 2013 5 . Además de los resultados representativos representados aquí, en el documento anterior proporciona estimaciones de primera utilización exón alternativo utilizando 5&#39;-RACE PCR y R...

Más de la mitad de los genes humanos están regulados por promotores alternativos 1. Cada promotor alternativo puede contener elementos reguladores que pueden ser diferentes de los de otros promotores alternativos. El promotor (s) utilizado en un tejido puede diferir de los utilizados en otro tejido. Por ejemplo, es posible que la activación de una vía de señalización dado puede desencadenar el promotor alternativo para un gen utilizado en un tejido, sin embargo, no tienen efecto sobre o reprimir un promotor alternativo separado para el mismo gen que se utiliza en otro tejido. La expresión del gen BCRP1 se rige por los promotores alternativos. BCRP1 es el ortólogo murino del gen humano de mama proteína de resistencia al cáncer (BCRP). BCRP es un transportador de casete de unión a ATP (ABC), ABCG2 2, 3 designado formalmente. Como una proteína de la membrana plasmática apical, funciones BCRP / BCRP1 de flujo de salida de una amplia variedad de sustratos naturales y xenobióticos <sup&gt; 3, 4. En los seres humanos y los ratones, BCRP / BCRP1 es altamente expresado en órganos farmacológicamente relevantes, tales como el hígado (canalículos biliares), intestino y riñón, así como los órganos con las barreras de los tejidos de la sangre, tales como placenta, cerebro y testículo 2, 5-12. Expresión de BCRP / BCRP1 en hematopoyéticas y otras células madre, incluyendo células madre del cáncer, puede conferir resistencia de estas células a xenobióticos y fármacos quimioterapéuticos contra el cáncer 3. A principios de trabajo para entender la regulación de la expresión de BCRP en células normales y neoplásicas, se realizó 5 &#39;rápida amplificación de cDNA extremos (5&#39;-RACE) análisis de ARNm de BCRP para determinar su sitio de inicio de la transcripción exacta 13. No sólo eran múltiples sitios de inicio de la transcripción que se encuentran; También se encontraron tres formas alternativas del primer exón, que a su BCRP es sin traducir. Estos primeros exones alternativos - designados E1a, E1b, E1c - se expresaron de manera diferente en una variedad de tejidos humanos. Dos variantes adicionales primer exón fueron descubiertos en una búsqueda BLAST de la base de datos de EST humano utilizando el segundo exón del BCRP 13. Cuatro partidos revelaron una primera exón&gt; 70 kb aguas arriba del exón 2 que fueron designados E1U; otros cuatro partidos reveló ARNm de BCRP que carecía de un primer exón del todo, que fueron designados E1- 13. La presencia de exones líder alternativos se considera que es una manifestación del uso promotor alternativo 14. En ratones, cuatro exones primera alternativa de BCRP1 se describen que pueden corresponder a otros promotores que regulan la transcripción BCRP 1 en diferentes tejidos de ratón; estos exones / promotores se designan E1U, E1A, E1B y E1C, y se encuentran a unos 70, 58, 15 y 5 kb aguas arriba del exón 2 BCRP1 5, 15. Se encontró que la isoforma E1A ARNm ser predominante en Murine las células madre hematopoyéticas, corazón, pulmón, bazo y cerebro, mientras que la isoforma E1B se expresó en intestino de ratón, células de hígado fetal, y las células precursoras eritroides en la médula ósea 5, 15. El promotor aguas arriba de E1B ha demostrado ser el principal promotor alternativo de gobierno BCRP1 transcripción en intestino de ratón, regulada al menos en parte, por-cíclico-fosfo AMP proteína elemento de respuesta de unión (p-CREB) y un elemento de respuesta CREB única para esa alternativa promotor BCRP1 16. La isoforma E1C mRNA se expresa predominantemente en el hígado murino adulto y riñón 5. La isoforma E1U es indetectable en la mayoría de los tejidos a prueba a excepción de testículo murino, donde es la isoforma predominante expresado 5. BCRP1 expresa en los testículos de ratas se encuentra en ambas uniones endoteliales (células cerradas, myoid peritubulares y células de Sertoli) somáticas y las células germinales (en el endotelio seminíferos, donde se puede proteger espermátidas la última etapa 4). el region aguas arriba de E1U contiene un elemento de respuesta funcional para steroidogenic factor 1 (SF-1) 5. BCRP1 ARNm y proteínas se reducen notablemente en los testículos de SF-1 knockout mice específicos de células de Sertoli, lo que sugiere que la expresión BCRP1 en células de Sertoli murinas se controla mediante SF-1 5. Los protocolos presentados detalle métodos para detectar exones primera alternativa de BCRP1 en silico, y establecer reportero ensayos basados ​​en la luciferasa para supuestos promotores aguas arriba de los primeros exones alternativos identificados.

<table><tbody><tr><td colspan="4">COMMERCIAL BIOLOGICAL MATERIALS AND KITS:</td></tr><tr><td>First Choice RLM-RACE</td><td>kit Ambion Inc., Austin, TX, actualmente disponible a través de Life Technologies</td><td>AM1700</td><td>5'-RACE PCR kit de</td></tr><tr><td>clonación TOPO TA</td><td>Life Technologies K450001</td><td></td><td>Este kit contiene las bacterias TOP10 químicamente competentes E. coli.</td></tr><tr><td>Kit de ligadura rápida de ADN ligasa T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td></td></tr><tr><td>Faststart de alta fidelidad Taq- ADN polimerasa</td><td>Sigma-Aldrich/Roche</td><td>3553400001/RMB-4738284001&nbsp;</td><td>Contiene una mezcla de enzimas polimerasa Taq de alta fidelidad</td></tr><tr><td>Reactivo de transfección de ADN XtremeGENE HP</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo reportero de luciferasa dual</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td>Incluye el vector reportero vacío básico pGL3 (luciferasa de luciérnaga de luciérnaga), el vector de expresión de luciferasa rRILLA rRLTK y otros vectores de control.</td></tr><tr><td>QIAprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Para miniprep de plásmidos: aislamiento y purificación de ADN plasmídico de colonias bacterianas</td></tr><tr><td>vector pCR2.1</td><td>parte del kit</td><td></td><td></td>de clonación TOPO TA</tr><tr><td>Vector que contiene luciferasa básica pGL3</td><td>Promega</td><td>E1751</td><td></td></tr><tr><td>pRL-TK Vector expresor de luciferasa Renilla</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>Cromosoma artificial bacteriano</td><td>Centro de Recursos de BACPAC, Niños s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA</td><td>RP23-285A12 y RP24-314E24</td><td>http://bacpac.chori.org/clones.htm</td></tr><tr><td colspan="4">REACTIVOS/PRODUCTOS QUÍMICOS/MEDIOS/SUMINISTROS</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Wizard&reg; Sistema de limpieza de gel y PCR SV&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Útil para purificar productos de PCR después de la digestión con endonucleasas de restricción</td></tr><tr><td>CRYOVIALS</td><td>Denville Scientific</td><td>V9012</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">SOFTWARE:</td></tr><tr><td>Ensembl software</td><td>Proyecto Ensembl</td><td>http://Ensembl.org&nbsp;</td><td>El proyecto Ensembl produce bases de datos genómicas de vertebrados y otras especies eucariotas, y pone esta información a disposición gratuita en línea.</td></tr><tr><td>Software de voladura</td><td>NCBI</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web& PAGE_TYPE=Software BlastHome</td><td></td></tr><tr><td>Primer 3</td><td>Simgene</td><td>http://simgene.com/Primer3</td><td>Útil para diseñar cebadores para PCR de 5' RACE</td></tr><tr><td>Base de datos de nucleótidos</td><td>NCBI</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">CELL LINES:</td></tr><tr><td>TM4 células de Sertoli murinas</td><td>ATCC, Manassas, Virginia</td><td>CRL-1715&trade;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">INSTRUMENTS:</td></tr><tr><td>Luminómetro</td><td>Turner Biosystems</td><td>TD-20/20</td><td>Este es un luminómetro relativamente barato, operado manualmente. Los sistemas automatizados también están disponibles del mismo fabricante que utilizan placas de 96 pocillos.</td></tr><tr><td>Espectrofotómetros NanoDrop</td><td>Thermo Scientific, Inc.</td>El espectrofotómetro <td>NanoDrop 2000</td><td>puede utilizar cantidades muy pequeñas de muestra,</td></tr><tr><td>espectrofotómetro UV/VIS DU 800 y software de análisis de ácidos nucleicos II</td><td>, BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA</td><td>DU 800</td><td></td></tr></tbody></table>

métodos para descubrir uso promotor alternativo y la regulación transcripcional de murino bcrp1

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

La expresión de genes en diferentes tejidos es a menudo controlado por promotores alternativos que resultan en la síntesis de ARNm con únicas - por lo general no traducidas - primeros exones. BCRP1 (Abcg2), el ortólogo murino de la mama ABC transportador de proteína de resistencia al cáncer (BCRP, ABCG2), tiene por lo menos cuatro promotores alternativos que son designados por los correspondientes cuatro primeros exones alternativos producidos: E1U, E1A, E1B, y E1C. En este documento, en silico protocolos se presentan para predecir el uso promotor alternativo para BCRP1. Además, se describen métodos de ensayo reportero para producir construcciones de reportero de promotores alternativos y para determinar la funcionalidad de los promotores putativos aguas arriba de los primeros exones alternativos que se identifican.

1 Identificación de BCRP alternativa la utilización del promotor en los testículos del ratón mediante el análisis de los exones líder Cuando se sondeó la base de datos de EST en NCBI (abril de 2015) siguiendo los pasos descritos en el Protocolo 1, la EST encontraron que eran contiguo con el extremo 5 &#39;del exón 2 en BCRP 1 mRNA se muestran en la Ta...

Con el murino transportador ABC BCRP1 (Abcg2) como un ejemplo, en-silico protocolos se presentan para detectar el uso de promotor alternativo en los genes expresados ​​en tejidos de ratón, y para evaluar la funcionalidad de los promotores alternativos identificados mediante los ensayos de reportero.

Métodos para descubrir uso promotor alternativo y la regulación transcripcional de murino BCRP1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

El objetivo general de este conjunto de protocolos es detectar exones iniciales alternativos en el ARNm de un gen como Bcrp1 y establecer ensayos de reportero basados en luciferasa para los promotores putativos localizados aguas arriba de los exones iniciales alternativos identificados. Los métodos in-silico utilizados pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la transcripción y regulación, como la forma en que se controla la expresión del ARNm en diferentes tejidos. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza datos genéticos de acceso público para identificar exones iniciales alternativos en el ARNm del gen de interés, lo que implica un uso alternativo de promotores.Este método que prepara construcciones reporteras y realiza ensayos de reportero puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regulación génica, como la actividad funcional de promotores alternativos putativos. Para comenzar este procedimiento, obtenga la secuencia del exón 2 de Bcrp1 de ratón introduciendo el ID de secuencia de referencia de ARNm en la ventana de búsqueda del navegador genómico Ensembl y haga clic en Ir. A continuación, seleccione una secuencia completa que contenga 16 exones. Haga clic en la opción Descargar secuencia.Luego, elija el formato FASTA y haga clic en Vista previa. En la siguiente pantalla, copie la secuencia de vista previa del exón 2 en el portapapeles. Navegue hasta la página principal de blast en el sitio web del NCBI.Seleccione el genoma del ratón. Pegue la secuencia del exón 2 desde el portapapeles en el cuadro de consulta. A continuación, seleccione ESTs en el menú desplegable de Base de datos.Optimícelo para secuencias altamente similares y luego elija BLAST. Cuando finalice la ejecución de BLAST, aparecerá la página de resultados. En la sección Descripciones de la página de resultados, seleccione Todo, luego Descargar, seguido de FASTA en el menú desplegable, y a continuación elija Continuar.Aparecerá un archivo de texto. Ábralo y copie todo el contenido del archivo en el portapapeles. Para identificar la ubicación de la secuencia EST que se encuentra en la región cinco prima del exón 2 en el gen Bcrp1, en la página principal de BLAST, bajo el subtítulo BLAST especializado, seleccione Alinear dos secuencias utilizando BLAST.Pegue el archivo de texto del portapapeles en el cuadro de consulta e introduzca 372099104 en el cuadro Secuencia del sujeto. Optimice para secuencias altamente similares bajo Selección de programa y ejecute BLAST. Una vez que aparezca la ventana de resultados, visualice los alineamientos de forma gráfica haciendo clic en Gráficos en la ventana de Alineamientos.Utilice las flechas derecha e izquierda y el zoom para enfocarse en Bcrp1/ABCG2 y en las alineaciones de secuencias. Luego, guarde las alineaciones de secuencias seleccionando Todo en el cuadro de Descripciones. En el menú desplegable Descargar, seleccione Tabla de resultados y luego haga clic en Continuar.Dado que la posición del extremo cinco prima del exón 2 corresponde al nucleótido 58.655.638 en el contig del cromosoma 6, designe esta como más uno y luego calcule la posición de las secuencias parciales de cada extremo cinco prima de EST respecto a 58.655.638. Un paso crítico en este procedimiento es la predicción de múltiples exones iniciales. Por lo tanto, aquí se identifican los promotores alternativos.Utilizando la secuencia de E1U obtenida de la base de datos EST, designe el primer nucleótido cinco prime de E1U como más uno. Obtenga un clon inverso del cromosoma seis de ratón que contenga la secuencia del gen Bcrp1/ABCG2 y la secuencia de al menos 100 kilobases aguas arriba del gen Bcrp1/ABCG2. Luego, identifique un vector repórter adecuado, como el plásmido repórter de luciferasa pGL3-Basic.Determine los sitios de clonación múltiple en el vector reportero. KpnI, SacI, MluI, NheI, SmaI, XhoI, BglII y HindIII son los sitios de restricción de endonucleasas en el sitio de clonación múltiple del vector pGL3-Basic en la orientación de cinco prima a tres prima. A continuación, seleccione la región de dos kilobases ubicada aguas arriba del exón E1U y pegue la secuencia en DNA5 antes de ejecutar el programa.Se mostrarán los detalles de los sitios de digestión simples y múltiples. Después, compare la lista de sitios de digestión en la región E1U con el MCS del vector pGL3-Basic en una hoja de cálculo de Excel. Posteriormente, prepare los cebadores directo e inverso para PCR que contengan sitios de restricción utilizando servicios comerciales de síntesis de cebadores génicos o software de selección de cebadores.Seleccione un cebador directo ubicado aproximadamente dos kilobases aguas arriba de la secuencia E1U y un cebador inverso dentro de la secuencia E1U. Luego, amplifique la región genómica E1U utilizando estos cebadores con 0,01 a un microgramo de Bak y una mezcla maestra de PCR que contenga una polimerasa taq de alta fidelidad. Posteriormente, verifique la longitud del producto de PCR amplificado comparándolo con una escalera de ADN de un kilobase mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % TAE.Posteriormente, digiera el producto de PCR obtenido y el vector pGL3-Basic utilizando endonucleasas de restricción específicas para los sitios de digestión por restricción introducidos en los cebadores directo e inverso. Luego, verifique la digestión del producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Corte el ADN del vector digerido y la banda de dos kilobases del producto de PCR del gel de agarosa.A continuación, extraiga el ADN del vector digerido y la banda de PCR de dos kilobases de los fragmentos de gel utilizando un kit comercial de purificación de gel SV y de productos de PCR. Mida la concentración del producto de PCR purificado y del vector purificado mediante espectrometría UV. Posteriormente, prepare el constructo reportero E1U ligando el producto de PCR digerido con enzima de restricción y purificado con el vector reportero de luciferasa de luciérnaga pGL3-Basic utilizando el kit de ligación rápida con ligasa T4 de ADN, obteniendo así el constructo reportero E1U denominado pGL3 E1U.En este paso, cultive las células TM4 en placas de 24 pocillos a una densidad inicial de 200.000 células por pocillo. Seis horas después de colocar las células en cultivo, transfecte las células con 0,2 microgramos del vector MP pGL3-Básico o con 0,2 microgramos del vector pGL3 junto con cuatro nanogramos de pRL-TK como control interno. Treinta horas después de la transfección, retire el medio de crecimiento de las células transfectadas.Lave las células con PBS y luego elimine la solución de lavado. A continuación, mida la actividad de la luciferasa de luciérnaga y Renilla utilizando un kit comercial. Exprese la actividad de cada tubo como la relación entre la actividad de la luciferasa de luciérnaga dividida por el control interno.Este paso confirma la actividad funcional del promotor específico del testículo. Aquí se muestra el ensayo de reportero para los promotores E1U, E1A, E1B y E1C de Bcrp1 en bulbos, que son células TM4 de origen completamente celular. Los datos se expresan como la luminiscencia de la luciferasa de luciérnaga normalizada respecto a la de la luciferasa de Renilla.El asterisco indica una diferencia significativa respecto al control del vector MP pGL3. Este gráfico muestra los efectos de la mutación del elemento de respuesta a SF-1 en el constructo reportero Bcrp1 E1U sobre la actividad de luciferasa. Se transfirieron constructos reporteros de Bcrp1 con una región putativa de unión a SF-1 en células TM4 con y sin la expresión forzada de SF-1.En la figura, a denota una diferencia significativa respecto al control del vector vacío pGL3; b indica una diferencia estadísticamente significativa en comparación con el constructo del promotor E1U en las células transfectadas con el vector. Al realizar este procedimiento, es importante recordar seleccionar una línea celular adecuada para el ensayo de reportero. La línea celular debe expresar el gen de interés bajo el control del promotor presente en el constructo de reportero.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la RT-PCR cuantitativa, con el fin de facilitar la evaluación del uso de promotores alternativos en múltiples muestras de tejido. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo predecir el uso de promotores alternativos para un gen de interés y cómo determinar la funcionalidad de dicho promotor.

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Investigación

JoVE Journal

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Biología

Aquí estamos presentando una inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) Procedimiento para el análisis de localización en todo el genoma de las isoformas de la proteína que se diferencian en un dominio de unión a las histonas. Estamos aplicando a CHIP-Seq análisis para identificar los objetivos de la histona desmetilasa KDM5A/JARID1A/RBP2.

Análisis de todo el genoma con chip para identificar objetivos específicos para cada isoforma Gene

El ensayo del reportero genético es una herramienta bien establecida y poderosa para diseccionar la relación entre las secuencias de ADN y sus actividades reguladoras de genes. El acoplamiento de los elementos reguladores candidatos a genes reporteros que llevan etiquetas de secuencia identificativa permite la paralelización masiva de estos ensayos.

Ensayos Reporteros Massively Parallel en células de mamífero cultivadas

El método descrito aquí se utiliza para inducir la cascada de señalización apoptótica en pasos definidos con el fin de diseccionar la actividad de una proteína efectora bacteriana antiapoptótica. Este método también se puede utilizar para la expresión inducible de proteínas proapoptóticas o tóxicas, o para diseccionar la interferencia con otras vías de señalización.

La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular

Elementos reguladores del ADN, como potenciadores, controlan la expresión génica físicamente en contacto con promotores de genes de la blanco, a menudo a través de interacciones cromosómicas largo alcance que abarca grandes distancias genómicas. Promotor de captura Hi-C (PCHi-C) identifica interacciones significativas entre promotores y regiones distales, permitiendo la asignación de posibles secuencias reguladoras a sus genes diana.

Promotor captura Hola-C: Perfiles de alta resolución, genoma de interacciones promotor

Aquí presentamos un protocolo para desarrollar un sistema inducible negativo dominante, en el que cualquier proteína puede ser condicional inactivada por overexpressing reversiblemente una versión mutante dominante negativo de él.

Inhibición de la proteína inducible y Reversible dominante negativo (DN)

Aquí se describe un protocolo para la inmunoprecipitación de cromatina eficiente (ChIP), seguido por secuenciación de ADN de alto rendimiento (ChIP-seq) de tejido adiposo marrón (BAT) aislado de un ratón. Este protocolo es conveniente para el mapeo de modificaciones de las histonas e investigar localización de genoma no histona proteínas de interés en vivo.

Inmunoprecipitación de cromatina del tejido adiposo marrón murino

Este protocolo describe los pasos necesarios para generar un modelo de sistema en que se puede regular la transcripción de un gen endógeno de interés condicional en animales vivos o células con mayor lac represor y tet activador de sistemas.

Aplicación in vivo del sistema de control remoto para la manipulación de genes endógenos

La entrega directa de complejos de ribonucleoproteínacas Cas9/ARN guía premontados es un medio rápido y eficiente para la edición del genoma en células hematopoyéticas. Aquí, utilizamos este enfoque para eliminar un silenciador intrónico RUNX1 y examinar las respuestas transcripcionales en las células leucémicas OCI-AML3.

Investigación del papel transcripcional de un silenciador intrónico RUNX1 por RIBonucleoprotein CRISPR/Cas9 en células de leucemia mieloide aguda

Aquí describimos un método para la sobreexpresión retroviral y la transferencia adoptiva de células murinas B-1a para examinar la migración celular in vivo B-1a y la localización. Este protocolo puede ampliarse para diversos ensayos funcionales posteriores, incluida la cuantificación de la localización celular del donante B-1a o el análisis de factores secretos derivados de células de donantes después de la transferencia adoptiva.

Sobreexpresión retroviral de CXCR4 en células murinas B-1a y transferencia adoptiva para la migración celular B-1a dirigida a la médula ósea y la producción de IgM

La expresión génica está regulada por interacciones de promotores génicos con elementos reguladores distales. Aquí, describimos cómo la baja entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite la identificación de estas interacciones en tipos de células raras, que antes no se podían medir.

Un flujo de trabajo integrado para estudiar la arquitectura del genoma espacio-temporal centrada en el promotor en poblaciones celulares escasas

Aprenda a detectar exones alternativos en Bcrp1 y a establecer ensayos reporteros de luciferasa para evaluar la actividad funcional de promotores alternativos en tejidos murinos. Este método utiliza análisis in silico.

Métodos para descubrir uso promotor alternativo y la regulación transcripcional de murino BCRP1

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