Name: Glaucoma de inducir en un Procedimiento En Vivo Modelo de rata y Todo el montaje-Retina Preparación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprende a inducir glaucoma en ratas mediante inyección de solución salina hipertónica en la vena episcleral. Este método permite estudiar la pérdida gradual de células ganglionares de la retina y evaluar estrategias de protección neuronal.

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Todos los procedimientos que utilizan los sujetos animales han estado de acuerdo con las normas del Instituto de Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Western Michigan. 1. Los animales <ol><li> Usar ratas macho y hembra de 3 meses de edad en este estudio. </li><li> Mantener a los animales en un ciclo de 12 horas de luz / oscuridad, con acceso libre a comida y agua. </li></ol> 2. Preparación de KAX Cocktail para anestesia animales <ol><li> Disolver 50 mg de xilazina (20 mg / ml) en 5 ml de ketamina (100 mg / ml) con 1 ml de acepromazina (10 mg / ml) y 3 ml de agua destilada. Mezclar bien. </li><li> Esterilizar con un filtro de jeringa y almacenar esta solución en una botella de suero de 10 ml. </li></ol> 3. Inyección KAX <ol><li> Pesar animales (g) y volver a la jaula hasta que esté listo para la inyección. </li><li> Inyectar 0,1 ml KAX / 100 g de peso corporal de los animales por vía intraperitoneal, usando una jeringa de 1 ml de insulina con una aguja de 28 G. </li><li> Permitirpara animales de pérdida de conocimiento. Compruebe reflejos pellizcando los pies y la cola. </li><li> Mantenga todos los animales de forma segura en el laboratorio para la duración de la cirugía. </li><li> Después de la cirugía, en lugar de los animales en sus jaulas y se mantiene cómodo en TA hasta que se recupere la conciencia. Sólo los animales regresar a las instalaciones cuando los animales se despiertan y reanudar un comportamiento normal. </li></ol> 4. Preparación para la cirugía y la Asamblea de Microneedle <ol><li> Hacer una solución estéril 2 M NaCl. </li><li> Al usar un extractor de microelectrodos (Figura 1C) para tirar de un diámetro interior de 0,86 mm estándar de pulido pesado y tubo de borosilicato de pared fina en dos microagujas de vidrio finamente cónicos (Figura 1D, 1E Figura). </li><li> Rellene una microaguja de la etapa anterior con 2 M de solución salina usando una aguja de jeringa de relleno y una jeringa de 1 ml (Figura 1B). Toque las burbujas de aire de la punta del electrodo. </li><li> Llene una segunda jeringa de 1 ml con 2 MNaCl. Conectar una aguja de 18 G y luego coloque una longitud (aproximadamente 10 pulgadas) de tubo de polietileno (Figura 1A). Utilice el émbolo de la jeringa para llenar el tubo de polietileno con solución salina a través de la aguja. </li><li> Cuando tanto la microaguja y el tubo se llena con solución salina, conecte cuidadosamente los dos. Eliminar el aire en la conexión entre ellos (Figura 2). </li><li> Finamente biselar la punta de la microaguja raspando muy a la ligera a contrapelo de una toalla de papel por supuesto. </li><li> Comprobar la resistencia de la microaguja empujando suavemente el émbolo de la jeringa hasta que un fino chorro de líquido se puede ver en la toalla de papel. La corriente de líquido no debe ser más ancha que 0,5 mm. </li></ol> 5. Preparación de los Animales <ol><li> Aplicar 1 - 2 gotas de anestesia tópica a la córnea (Proparacaína Solución Oftálmica clorhidrato, USP, 0,5%). Esperar hasta que se produzca ningún reflejo ocular. </li><li> Recortar los bigotes con unas tijeras. </li><li> Saturate un aplicador con punta de algodón con solución de betadine y el área hisopo alrededor del ojo experimental. </li><li> Usando un microscopio, adjuntar una pinza hemostática para sujetar el párpado inferior para sobresalir del ojo, exponer la vena episcleral y restringir el movimiento de los ojos. (Figura 3, punta de flecha) </li></ol> 6. Glaucoma inductor de inyección de solución salina <ol><li> Cuando se preparan el conjunto de microagujas y el animal, comenzar las inyecciones. </li><li> Cuando el animal se confirmó que no responden a la pizca pies / cola, perforar cuidadosamente la vena epiescleral con la microaguja al venir en un ángulo de entre 10 y 20 grados a la vena (Figura 3, flecha blanca). Una punción éxito en la vena es evidente cuando la sangre entra en la punta de la microaguja (Figura 3, flecha negro). </li><li> Poco a poco y de forma manual inyectar aproximadamente 50 l de solución salina en la vena. Esto debe tomar aproximadamente 10 seg. Las venas se blanquean blanco como la sal circula excelentes referenciasuf la vasculatura (Figura 4, punta de flecha). Algunas regiones pueden mantener una apariencia de glóbulos rojos (Figura 4, flecha). <ol><li> Realizar una segunda inyección en la vena, frente al sitio de la primera, para asegurar daño en la retina a fondo para la capa de células ganglionares de la retina completa. Nota: En cuestión de minutos, uno debería ver un aspecto turbio distinta a través del iris del ojo como la sal circula a través del sistema vascular. </li></ol></li><li> Deje el ojo opuesto no tratada para su uso como un control interno. </li></ol> 7. Recuperación de Animales <ol><li> Retire la pinza hemostática. </li><li> Use un hisopo de algodón para aplicar el ungüento antibiótico triple (bacitracina de zinc, sulfato de neomicina, sulfato de polymysin B) al sitio sujeta por la pinza hemostática y de los puntos de inyección. daño a los tejidos alrededor del ojo no se produce utilizando la pinza hemostática. </li><li> &gt; Poner a los animales anestesiados en sus jaulas en una manta de agua caliente que circula a prevla hipotermia ent. Mantener a los animales en observación hasta que la conciencia y el comportamiento normal se recuperaron. El transporte de animales despiertos de nuevo a la colonia de animales. Los animales permanecen en la colonia hasta el momento del sacrificio. </li></ol> 8. El sacrificio de animales y la eliminación de la retina <ol><li> Un mes después del procedimiento para inducir el glaucoma, los animales son sacrificados por asfixia con CO2 y la punción torácica secundaria. <ol><li> Colocar el animal en la cámara y poner la tapa en forma segura. </li><li> Abrir las de CO 2 y el regulador de gas válvulas para permitir que el 20% de volumen / min CO2 desplazamiento de oxígeno en la cámara. </li><li> Permitir cuatro a 5 min para el animal a punto de expirar. </li><li> Desactivar las dos válvulas. </li><li> Eliminar los animales de la cámara y realizar una punción torácica secundaria con un bisturí estéril. </li></ol></li><li> Después de la eutanasia, utilizar un bisturí para cortar el tejido conectivo en la cavidad orbital que rodea el ojo, being cuidado de no cortar en el propio globo ocular. </li><li> Con cuidado, usar tijeras de borde curvado para cortar el nervio óptico y cualquier tejido restante para extraer el globo ocular intacta. Coloque globo ocular extraída en un 60 mm x 15 mm placa de Petri estéril desechable que contiene PBS fresca. </li><li> Hacer una ojera del globo ocular. Para ello, hacer una pequeña incisión con el bisturí justo posterior a la frontera entre el iris y la esclerótica. Siga esta incisión alrededor de la circunferencia del ojo con pequeñas tijeras de primavera para eliminar el hemisferio corneal del globo ocular. El hemisferio conectado al nervio óptico permanece. </li><li> Encuentra la retina muy fina de color rosa / amarillento dentro del ocular del animal sacrificado. Mantenga la capa pigmentada de la retina con unas pinzas de punta roma para estabilizar la ojera. Utilice otro par de pinzas cerradas para provocar muy suavemente toda la retina intacta fuera de la parte posterior del ojo. Evitar pellizcar, tirar o tirando de la retina directamente. </li><li> Utilice pequeñas tijeras para cortar la primaveraárea donde el nervio óptico está todavía unido a la retina. </li><li> Asegúrese de cortar la basura cualquier epitelio pigmentario residual o tejido de la esclerótica de la retina. </li><li> Usando una pipeta de transferencia, transferir suavemente la retina aislada a una Sylgard recubierto limpia de 35 mm x 10 mm placa de Petri que contiene PBS fresca. </li></ol> 9. Todo el montaje Retina Preparación <ol><li> Una vez en el plato Sylgard, el uso de fórceps y una aguja de cactus para fijar la retina en su lugar. Mantener la capa de células ganglionares de la retina hacia arriba y hacia abajo del nervio óptico. forma hemisférica de la retina es notable, incluso después de la fijación. La curvatura de la retina se podrán curvar hacia el techo cuando la capa de células ganglionares de la retina está en la orientación deseada. </li><li> Utilice pequeñas tijeras para cortar la retina en cuatro cuadrantes, haciendo la forma de un trébol de cuatro hojas que irradia de la cabeza del nervio óptico. </li><li> Pin de los cuadrantes de la retina con agujas de cactus adicionales para que la retina lo más plana posible withoestiramiento ut (Figura 5). </li><li> Fijar las retinas fijadas en el plato Sylgard con 3 ml de paraformaldehído al 4% O / N a temperatura ambiente. </li></ol> 10. tinción de anticuerpos de la Retina Nota: retinas manchas fijas con anticuerpos primarios y secundarios para la visualización de las neuronas de la retina (Figura 6). <ol><li> Enjuague fijos, retinas montadas en plano tres veces durante 2 minutos cada uno en PBS. </li><li> Permeabilizar las retinas con 1% de Triton X-100 con suero bovino fetal al 1% en PBS durante 60 min. </li><li> Enjuague retinas tres veces, 2 minutos cada uno, en PBS. </li><li> Enjuague dos veces con 0,1% Triton X-100 en PBS, 5 min por lavado. </li><li> Enjuague dos veces con PBS, 5 minutos por lavado. </li><li> Incubar con 1% de Triton X-100 y suero bovino fetal al 1% en PBS a temperatura ambiente durante 45 min. </li><li> Enjuague dos veces con 0,1% Triton X-100 en PBS, 5 min por lavado. </li><li> Enjuague dos veces con PBS, 5 minutos por lavado. </li><li> Incubar cada retina en suero bovino fetal 3 ml 1% en PBScon el ratón purificado anti-CD90 de rata / ratón CD90.1 (dilución 1: 300) O / N a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague retinas una vez con 0,1% Triton X-100 en PBS durante 5 min. </li><li> Enjuague dos veces con PBS, 5 minutos por lavado. </li><li> Incubar cada retina en 3 ml de PBS (sin FBS) con secundario Alexa Fluor 594 de cabra anti-IgG de ratón (1: 300) O / N a TA. </li><li> Lávese las retinas con PBS liberalmente. </li><li> El uso de un microscopio de disección, retirar con cuidado las agujas de cactus de la retina. </li><li> transferir suavemente retinas en portaobjetos de microscopio con una pipeta de transferencia. Asegúrese de mantener la orientación con la capa de células ganglionares de la retina frente al techo. forma hemisférica de la retina es notable, incluso después de la fijación. La curvatura de la retina se podrán curvar hacia el techo cuando la capa de células ganglionares de la retina está en la orientación deseada. </li><li> Absorber cualquier exceso de PBS con KIMWIPE u otro material absorbente. Tenga cuidado de no absorber la retina. </li><li> Añadir 5 gotas de glicerina y ½ ½ PBS en peso como AMmedios ontaje. </li><li> Cubrir retina con cubreobjetos, evitando las burbujas de aire. </li><li> cubreobjetos seguro utilizando esmalte transparente de uñas, pegamento u otro adhesivo. </li></ol>

Los autores no tienen intereses contradictorios o contrapuestos que divulgar.

Este protocolo describe un método para inducir condiciones de glaucoma-como en un modelo de rata in vivo. Este procedimiento utiliza una inyección de solución salina hipertónica para inducir la formación de cicatrices en la malla trabecular 29, 32. El desarrollo de tejido de cicatriz ocluye el flujo de salida de humor acuoso que aumenta la presión en la cámara anterior. Con una disminución de flujo y la presión se acumulan, la lente está suspendido por ligamentos elásticos empuja de nuevo en la cámar...

El glaucoma es un grupo de enfermedades oculares que afectan a las neuronas de la retina, en concreto, las células ganglionares de la retina 1-2. Los axones de estas células convergen para convertirse en el nervio óptico lleva la información visual al cerebro donde se percibe la visión. El daño a la CGR y sus axones, por tanto, causa defectos visuales. Las características principales asociados con trastornos de glaucoma son RGC degeneración y la muerte, aumento de la presión intraocular (IOP), y cupping disco óptico y atrofia. Estas características conducen a la pérdida del campo visual o completa, la ceguera irreversible. En la actualidad, el glaucoma ha causado la ceguera en 70 millones de personas en el mundo 3. Como tal, es la tercera mayor causa mundial de ceguera 4. Se desconoce el mecanismo exacto de la muerte de CGR en el glaucoma. Muchas investigaciones se han hecho para resolver el misterio. Se sabe, sin embargo, que el principal factor de riesgo de glaucoma es un aumento in de la presión intraocular debido a la circulación irregular de humor acuoso (AH) en la cámara anterior del ojo. AH actúa como reemplazo transparente e incoloro para la sangre en la cámara anterior avascular del ojo. Nutre las células circundantes, elimina los productos de desecho secretados a partir de los procesos metabólicos, transporta los neurotransmisores, y permite la circulación de drogas y células inflamatorias dentro del ojo durante los estados patológicos 1. El mantenimiento de la circulación del humor acuoso implica el cuerpo ciliar y la malla trabecular. El humor acuoso es producido por el cuerpo ciliar. A continuación, fluye en la cámara anterior para mantener la salud general del tejido ocular. 75 a 80% de salida de humor acuoso es secretado activamente a través de epitelio ciliar no pigmentario cuando el fluido se filtra a través de tres capas de tejido esponjoso en el músculo ciliar. Las salidas de fluido a través de la malla trabecular y a través del canal de Schlemm, que adelantarseIES en el sistema sanguíneo 5 .El restante 20 a 25% del flujo de salida pasa por la malla trabecular y se pasivamente secretadas por ultrafiltración y difusión a través de la vía uveo-escleral. Esta vía parece ser relativamente independiente de la presión intraocular 1. Cuando la producción de humor acuoso y la salida están fuera de equilibrio, aumenta la presión dentro del ojo. Como se ha indicado, este aumento de la presión intraocular es el principal factor de riesgo en el desarrollo de glaucoma. Esta presión causa daño a las intrincadas capas de neuronas de la retina en la parte posterior del ojo. El daño a los axones de las células ganglionares de la retina del nervio óptico hace que el cerebro ya no recibe información visual precisa. Como resultado, la percepción de la visión se pierde y se puede producir ceguera completa. Hasta la fecha, no existe una cura para el glaucoma. Existen diferentes métodos de tratamiento que principalmente tienen como objetivo reducir la presión intraocular. Estos incluyen la administración tópicaclases de medicamentos tales como bloqueadores de los receptores beta1-adrenérgicos, o análogos de las prostaglandinas tópicas. Los bloqueadores beta reducen la presión intraocular al disminuir la producción de humor acuoso 7. Las prostaglandinas función para reducir la PIO mediante el aumento del flujo de salida de humor acuoso 8-14. agonistas adrenérgicos alfa y los inhibidores de la anhidrasa carbónica se utilizan también como métodos secundarios de tratamiento. Agonistas alfa adrenérgicos aumentan flujo de salida a través de la vía uveoescleral 15-17. Inhibidores de la anhidrasa carbónica reducen la producción de AH por la inhibición enzimática 18. Mucho más procedimientos invasivos también están siendo utilizados para tratar el glaucoma. Trabeculoplastia láser se utiliza para aumentar el flujo de salida del humor acuoso 19. Otra terapia quirúrgica, llamada trabeculectomía, crea un sitio de drenaje alternativo para filtrar AH cuando la vía trabecular tradicional es bloqueado 20-21. Estas opciones de tratamiento han sido conocidos por efcaz reducir la PIO. Sin embargo, hasta el 40% de los pacientes con glaucoma muestran niveles normales de PIO que indican una necesidad de procedimientos terapéuticos más completos. 22,23 Además, la muerte de células ganglionares de la retina se ve en el glaucoma es irreversible una vez que comienza y los tratamientos actuales no se detienen la progresión de la enfermedad 24-28. Esto ha puesto de relieve la necesidad de tratamientos neuroprotectores eficaces destinadas a la supervivencia de las neuronas mismas. Desarrollo de modelos de glaucoma es crucial para este desarrollo. En este estudio estamos demostrando un método de inducir efectos glaucoma-como en ratas Long Evans adultas utilizando un procedimiento modificado descrito originalmente por Morrison 29. En este procedimiento, las inyecciones de 2 M de solución salina hipertónica en el plexo venoso episcleral induce condiciones glaucoma-como por la cicatrización de tejido para reducir la salida de humor acuoso en la malla trabecular que conduce a un aumento de la presión intraocular y una pérdida significativa de CGR wentro de un mes tras el procedimiento 30-31. procedimientos de inducción de glaucoma, tales como la descrita aquí, puede ser la clave para desbloquear los nuevos avances en los tratamientos para el glaucoma.

<table><tbody><tr><td>Clorhidrato de xilacina, mínimo 99%</td><td>Sigma, Life Science</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr><tr><td>Inyección de clorhidrato de ketamina, USP, 100 mg / ml y nbsp;</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>Frasco de 10 ml</td></tr><tr><td>Maleato de acepromazina, 10 mg/ml</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td><td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td><td>Frasco de 50 ml</td></tr><tr><td>Frasco de suero, 10 ml</td><td>VWR</td><td>16171319</td><td>vidrio de borosilicato</td></tr><tr><td>jeringa de insulina de 1 ml&nbsp;</td><td>Aguja VWR</td><td>BD329410</td><td>28 G&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S7653</td><td>Solución de 2 m&nbsp;</td></tr><tr><td>Extractor de microelectrodos&nbsp;</td><td>Narishige Group</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de borosilicato estándar pulido pesado y de pared delgada &nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-10HP</td><td>sin filamento, 0,86 mm</td></tr><tr><td>Aguja de jeringa Microfil para el llenado de micropipetas</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF28G</td><td></td></tr><tr><td>Aguja Luer-Lock de calibre 18</td><td>Fisher Scientific</td><td>1130421</td><td>Aguja de jeringa</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno flexible</td><td>Fisher Scientific</td><td>22046941</td><td>0,034 pulgadas de diámetro, aproximadamente 10 pulgadas&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución oftálmica de clorhidrato de proparacaína, USP, 0.5%</td><td>Akorn, Inc</td><td>NDC 17478-263-12</td><td>15 ml&nbsp; frasco estéril&nbsp;</td></tr><tr><td>Tijeras curvas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica&nbsp;</td>Pinza hemostática <td>StereoZoom 4</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>1310912 ungüento</td> antibiótico triple de <td>borde curvo</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Mango</td> de bisturí <td>Fisher Scientific NC0664481</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de bisturí #11</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri Desechable de 60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td></td> 351007 <td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato 10x Concentrado</td><td>Sigma, Ciencias de la Vida&nbsp;</td><td>P7059-1L</td><td>1x dilución&nbsp;</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte</td><td>Herramientas de ciencia fina&nbsp;</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas (2), Dumont # 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia de 3 ml, polietileno, no estériles</td><td>BD Biosciences</td><td>357524 o 52947-948</td><td>graduaciones de 1 y 2 ml</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Placa de Petri de fácil agarre&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>Agujas</td><td></td><td></td><td></td>de cactus</tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>PX0055-3 o 818715.0100</td><td>Hecho en una solución al 4%&nbsp;</td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T9284-100 ml</td><td>Hecho en una solución al 1% y al 0,1%&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino&nbsp;</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11150</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Ratón Purificado Anti-Rata CD90/ratón CD90.1</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat 554892</td><td>dilución 1:300&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 cabra anti-ratón&nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida&nbsp;</td><td>A11005</td><td>dilución 1:300&nbsp;</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Corning&nbsp;</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol &nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G5516-100 ml&nbsp;</td><td>50% glicerol a 50% PBS, en peso&nbsp;</td></tr><tr><td>Cubreobjetos&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>2975-225</td><td>Espesor 1 22 x 50 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>C2 Eclipse Ti</td><td></td></tr></tbody></table>

glaucoma de inducir en un procedimiento<em&gt; en vivo</em&gt; modelo de rata y todo el montaje-retina preparación

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

El glaucoma es una enfermedad del sistema nervioso central que afecta a las células ganglionares de la retina (CGR). RGC axones que forman el nervio óptico llevan la información visual al cerebro para su percepción visual. El daño a la CGR y sus axones conduce a la pérdida de la visión y / o ceguera. Aunque la causa específica del glaucoma es desconocido, el principal factor de riesgo para la enfermedad es una presión intraocular elevada. procedimientos de inducción de glaucoma en modelos animales son una herramienta valiosa para los investigadores que estudian el mecanismo de la muerte de CGR. Dicha información puede conducir al desarrollo de tratamientos neuroprotectores eficaces que podrían ayudar en la prevención de la pérdida de la visión. El protocolo en este documento se describe un método para inducir el glaucoma - al igual que las condiciones en un modelo de rata in vivo en 50 l de 2 M de solución salina hipertónica se inyecta en el plexo venoso epiescleral. El blanqueo de los vasos indica inyección con éxito. Este procedimiento provoca la pérdida de la CGR para simular el glaucoma. Un mes siguienteinyección, los animales son sacrificados y los ojos son removidos. A continuación, la córnea, el cristalino y vítreo se retiran para hacer una ojera. La retina se desprende entonces de la parte posterior del ojo y inmovilizó en placas de Sylgard con agujas de cactus. En este punto, las neuronas de la retina se pueden teñir para su análisis. Los resultados de esta práctica de laboratorio muestran que aproximadamente el 25% de la CGR se pierden dentro de un mes del procedimiento en comparación con los controles internos. Este procedimiento permite el análisis cuantitativo de la muerte de células ganglionares de la retina en un modelo de rata in vivo glaucoma.

Esta sección ilustra los componentes del aparato y el procedimiento utilizado para inducir condiciones glaucoma-como en una rata modelo de glaucoma in vivo. Mostramos las herramientas individuales y el equipo utilizado para realizar una inyección de solución salina hipertónica que provoca un aumento en la presión intraocular. Mostramos la inyección en el plexo venoso epiescleral con su característico efecto de blanqueo y el aspecto turbio de la cámara anterior que resulta. Tambi...

El glaucoma se caracteriza por daño a las células ganglionares de la retina. La inducción de glaucoma en modelos animales puede proporcionar información sobre el estudio de esta enfermedad. Aquí, describimos un procedimiento que induce la pérdida de RGCs en un modelo de rata in vivo y demostramos la preparación de retinas de montaje completo para el análisis.

Glaucoma de inducir en un Procedimiento<em&gt; En Vivo</em&gt; Modelo de rata y Todo el montaje-Retina Preparación

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

El objetivo general de este procedimiento es provocar una pérdida significativa de células ganglionares de la retina en la retina de rata induciendo condiciones similares a las del glaucoma. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del glaucoma y la protección neural. La principal ventaja de esta técnica es que provoca una pérdida gradual de las células ganglionares de la retina, similar a la observada en el glaucoma humano.Para comenzar este procedimiento, tire de dos micropipetas de vidrio finamente cónicas a partir de un tubo estándar de borosilicato de pared delgada y pulido grueso utilizando un extractor de microelectrodos. Luego, rellene una micropipeta con solución salina dos molar, usando una jeringa de un mililitro. Elimine las burbujas de aire golpeando suavemente la punta del electrodo.A continuación, llene una segunda jeringa de un mililitro con NaCl dos molar. Conéctela a una aguja de calibre 18 y luego fije la aguja a un tubo de polietileno de 10 pulgadas. Utilice el émbolo de la jeringa para llenar el tubo de polietileno con solución salina a través de la aguja.Cuando tanto la micropunción como el tubo estén llenos de solución salina, conéctelos cuidadosamente. Elimine cualquier aire presente en la conexión golpeando suavemente para expulsar las burbujas. Luego, raspe ligeramente la punta de la micropunción contra una toalla de papel para afilarla finamente.Compruebe la resistencia de la microaguja empujando suavemente el émbolo de la jeringa hasta que se observe un chorro fino de líquido en la toalla de papel. El chorro de líquido no debe ser más ancho de 0,5 milímetros para garantizar la integridad adecuada de la punta de la aguja. En este procedimiento, tras anestesiar al animal con la mezcla KAX, compruebe los reflejos pellizcando sus patas o cola para asegurarse de que el animal está inconsciente.Luego, recorte los vibrissas con tijeras. Posteriormente, sature un aplicador de punta de algodón con solución de betadina y limpie el área alrededor del ojo experimental. Bajo el microscopio, use una pinza hemostática para sujetar el párpado inferior, con el fin de hacer sobresalir el ojo, exponer la vena epiescleral y restringir el movimiento ocular.A continuación, punce cuidadosamente la vena epiescleral con la micropunzón a un ángulo entre 10 y 20 grados respecto a la vena. Un punción en la vena es exitosa cuando se observa que la sangre entra en la punta de la micropunzón. Inyecte lentamente 50 microlitros de solución salina en la vena.Las venas se vuelven blancas al pasar la sal por la vasculatura, pero algunas regiones pueden mantener un aspecto rojo sangre. El paso más crítico de este procedimiento ocurre durante la inyección de la solución salina dos molar. Es fundamental que se produzca el blanqueamiento en la vasculatura para garantizar un resultado exitoso.Mantener una aguja estable y un ángulo de 20 grados es crucial para este procedimiento. Después, realice una segunda inyección en la vena para asegurar un daño completo de la capa de células ganglionares de la retina. En cuestión de minutos, se debería observar una apariencia nubosa clara a través del iris del ojo, a medida que la sal circula por el sistema vascular.Ahora, use un escalpelo para cortar el tejido conectivo en la cavidad orbitaria que rodea el ojo, teniendo cuidado de no cortar el globo ocular en sí. Luego, corte cuidadosamente el nervio óptico y cualquier tejido restante para extraer el globo ocular intacto con las tijeras de borde curvo. Coloque el globo ocular extraído en una placa de Petri estéril que contenga PBS fresco.A continuación, prepare una copa ocular del ojo haciendo una pequeña incisión con el escalpelo justo por detrás del borde entre el iris y la esclerótica. Continúe la incisión alrededor de la circunferencia del ojo para separar el hemisferio corneal del globo ocular. Sujetando con pinzas la capa pigmentada de la retina para estabilizar la copa ocular, use otro par de pinzas para extraer suavemente la retina intacta de color rosado-beige desde la parte posterior del ojo.Posteriormente, corte o pellizque la zona donde el nervio óptico está unido a la retina. Asegúrese de eliminar cualquier epitelio pigmentario residual o tejido escleral de la retina. Luego, transfiera suavemente la retina aislada a una placa de Petri limpia recubierta con Sylgard que contenga PBS fresco.Una vez en la placa de Sylgard, sujete la retina en su lugar. Mantenga la capa de células ganglionares de la retina hacia arriba y el nervio óptico hacia abajo. A continuación, corte la retina en cuatro cuadrantes, formando la figura de un trébol de cuatro hojas, irradiando desde la cabeza del nervio óptico.Luego, sujete los cuadrantes de la retina con agujas adicionales de cactus para hacerla lo más plana posible sin estirarla. Posteriormente, fije la retina sujeta en el recipiente de Sylgard con tres mililitros de paraformaldehído al 4% durante la noche a temperatura ambiente antes de realizar los procedimientos estándar de tinción. A continuación se muestra una comparación entre el ojo control no tratado y el ojo experimental, un mes después de recibir la inyección de solución salina que induce glaucoma.Las células ganglionares de la retina están marcadas con un anticuerpo contra Thy 1.1. El procedimiento conduce a una reducción en el número de CRG, desfasciculación de las axonas fuera de los haces axónicos principales y distorsión de la circularidad de las CRG restantes. Estas son las axonas desfasciculadas características resultantes de la inyección de solución salina.Se muestra un vaso sanguíneo dentro de la retina, y estos son los haces de axones. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 30 minutos, si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar siempre utilizar una micropunzón fresca, afilada y biselada.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como inmunocitoquímica, transferencias Western, hibridación in situ, secuenciación de ARNm o análisis del comportamiento con el fin de responder preguntas adicionales relacionadas con el glaucoma, tales como cómo la pérdida de células ganglionares de la retina afecta la agudeza visual de los animales. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del glaucoma exploraran estrategias de protección neuronal en ratas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir una pérdida significativa de células ganglionares de la retina en la rata, mediante una inyección de solución salina hipertónica en la vena epiescleral.

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Source: Bosco, A., et al. Dinámica in vivo de la activación de la microglía retiniana durante la neurodegeneración: imagen oftalmoscópica confocal y morfometría celular en glaucoma de ratón. J. Vis. Exp. (2015) Este video muestra imágenes in vivo de la microglía de la retina en un modelo de ratón de glaucoma. Un ratón transgénico con microglía retiniana fluorescente que expresa proteínas se coloca debajo de un oftalmoscopio. La iluminación infrarroja se utiliza para localizar la cabeza del...

Obtención de imágenes in vivo de la microglía de la retina en un modelo murino de glaucoma

El protocolo descrito aquí es para la evaluación estructural de una preparación de retina de montaje completo. Esto incluye descripciones de la disección de tejidos, el montaje en un inserto de membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) hidrofilizado, la carga en bolo con marcadores fluorescentes y una comparación de la fijación con carbodiimida y paraformaldehído para el análisis inmunohistoquímico de componentes celulares y sinápticos.

Protocolo optimizado para Retina Preparación Wholemount de la Imagen y la inmunohistoquímica

Protocolos de inmunohistoquímica se utilizan para estudiar la localización de una proteína específica en la retina. Se emplean técnicas de imagen de calcio para estudiar la dinámica del calcio en las células ganglionares de la retina y sus axones.

Inmunohistoquímicos y métodos de imagen de calcio en Wholemount Rata Retina

Aquí, se presenta un protocolo para inducir hipertensión ocular en el ojo murino que resulta en la pérdida de células ganglionares de la retina tal como se observa en el glaucoma. microperlas magnéticas se inyectan en la cámara anterior y atraídos por el ángulo iridocorneal usando un imán para bloquear el flujo de salida del humor acuoso.

A Magnetic Microbead Oclusión Modelo para inducir hipertensión ocular dependiente de glaucoma en ratones

El siguiente informe describe cómo replicar el modelo de roedores de la neuropatía óptica isquémica anterior no arterítica (rNAION), utilizando los parámetros apropiados de tinte, lente de contacto y láser. También revelamos los pasos apropiados para evaluar la lesión rNAION in vivo.

El modelo de roedor de la anterior no arterítica neuropatía óptica isquémica (rNAION)

Este protocolo describe un método novedoso para la investigación de una forma de neuroestimulación química de wholemount rat retinas en vitro con el neurotransmisor glutamato. Química neuroestimulación es una alternativa prometedora a la neuroestimulación eléctrica convencional de retinales neuronas para tratar ceguera irreversible causada por enfermedades degenerativas fotorreceptor.

Metodología para la neuromodulación química Biomimetic de Retinas de ratas con el neurotransmisor glutamato In Vitro

Demostrar técnicas de preparación de tres tejidos diferentes para la visualización de immunohistochemical del pericitos microvasculares retina de rata, es decir, cryo-secciones, todo-montajes e hipotónica aislamiento de la red vascular.

Retinales crio-secciones, montajes de todo y vasculatura aislado hipotónica preparados para la visualización de Immunohistochemical del pericitos microvasculares

La hipertensión ocular crónica se induce mediante la aplicación de una sutura de circumlimbal en ratas y ratones, llevando al deterioro funcional y estructural de las células ganglionares de la retina compatibles con glaucoma.

Un modelo de Glaucoma inducido por sutura de Circumlimbal en ratas y ratones

La retinopatía inducida por oxígeno (OIR) se puede utilizar para modelar enfermedades retinianas isquémicas como la retinopatía de la prematuridad y la retinopatía diabética proliferativa y para servir como modelo para estudios de prueba de concepto en la evaluación de fármacos antiangiogénicos para enfermedades neovasculares. OIR induce neovascularización robusta y reproducible en la retina que se puede cuantificar.

Modelo de retinopatía inducida por oxígeno para enfermedades retinianas isquémicas en roedores

La retinopatía diabética es una de las principales causas de ceguera. La histología, el ensayo de ruptura de la barrera hematoencefaliana y la angiografía por fluorescencia son técnicas valiosas para comprender la fisiopatología de la retina, lo que podría mejorar aún más la detección eficaz de medicamentos contra la retinopatía diabética.

Evaluación fisiopatológica de la retina en un modelo de rata

El objetivo de este protocolo es caracterizar un nuevo modelo de neurodegeneración glaucomatosa basado en la cauterización térmica de 360° del plexo vascular limbal, induciendo hipertensión ocular subaguda.

Cauterización de círculo completo del plexo vascular limbal para el glaucoma inducido quirúrgicamente en roedores

Aprende a inducir glaucoma en ratas mediante inyección de solución salina hipertónica en la vena episcleral. Este método permite estudiar la pérdida gradual de células ganglionares de la retina y evaluar estrategias de protección neuronal.

Glaucoma de inducir en un Procedimiento

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