Integración de Procesos húmedo y en seco de banco Optimiza Targeted secuenciación de próxima generación de baja calidad y biopsias de tumores de baja cantidad

El objetivo general de este procedimiento es describir un sistema integral para la secuenciación de muestras de cáncer desafiantes que combine reactivos de laboratorio húmedo, controles estandarizados y una suite de bioinformática estándar. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer, como cómo secuenciar biopsias tumorales de baja cantidad y baja calidad para lograr análisis e interpretaciones precisos de variantes de ADN. La principal ventaja de este método es que las muestras que son difíciles de secuenciar son aquellas que simplemente tienen cantidades limitadas de ADN disponibles, se pueden analizar de forma rápida y fiable utilizando reactivos y controles de una sola fuente y software bioinformático totalmente integrado.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la complejidad de la NGS dirigida, que este método simplifica. Sin embargo, los procedimientos para la cuantificación de bibliotecas y la agrupación de muestras requieren una atención especial para lograr una cobertura uniforme en todas las bibliotecas de muestras. Este protocolo integra procesos de banco húmedo y seco para la secuenciación de muestras de cáncer desafiantes.

El primer paso es la cuantificación y cualificación del ADN para determinar el número de copias de plantillas de ADN que pueden amplificarse mediante PCR en tiempo real. Comience el procedimiento para la cuantificación de muestras y el control de calidad preparando una cantidad suficiente de una mezcla maestra en un tubo de microcentrífuga. Utilice los siguientes volúmenes por muestra, 5 microlitros de mezcla maestra 2x, 0,5 microlitros de mezcla de sonda de cebador, 0,5 microlitros de mezcla de sonda de cebador de inhibición, 0,05 microlitros de ROX y 2,95 microlitros de diluyente.

Agregue nueve microlitros de la mezcla maestra en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Agregue un microlitro de los patrones de ADN por duplicado y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces. Después de asegurarse de que la muestra de ácido nucleico esté bien mezclada, agregue un microlitro de la muestra a la mezcla maestra y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces.

Coloque la placa sellada en el sistema de PCR. Realice ciclos de PCR de 10 minutos a 95 grados centígrados, seguidos de 40 ciclos de 15 segundos a 95 grados centígrados y un minuto a 60 grados centígrados. Analice los datos de qPCR generando un gráfico de regresión lineal para cada uno de los estándares de ADN duplicados.

A continuación, se calcula la concentración del ADN desconocido en el número de copias funcionales o amplificables por microlitro, tal y como se describe en el texto del protocolo. El siguiente paso, después de la cuantificación de la muestra y el control de calidad, es el enriquecimiento de las secuencias de puntos calientes del cáncer mediante PCR multiplex de un solo tubo. Se realizará una gsPCR específica para enriquecer 46 loci en 21 genes de cáncer.

Prepare una cantidad suficiente de mezcla maestra de gsPCR en un tubo de microcentrífuga utilizando los siguientes volúmenes por muestra, cinco microlitros de mezcla maestra de amplificación 2x y un microlitro de panel de cebador pancancerígeno. Alícuota de seis microlitros de la mezcla maestra de gsPCR en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Agregue cuatro microlitros de cada muestra de ácido nucleico en pocillos individuales.

Mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces. Incluya los controles adecuados. Coloque la placa sellada en el termociclador para los siguientes ciclos de PCR.

Cinco minutos a 95 grados centígrados, 15 segundos a 95 grados centígrados, seguidos de cuatro minutos a 60 grados centígrados durante dos ciclos, 15 segundos a 95 grados centígrados, seguidos de cuatro minutos a 72 grados centígrados durante 23 ciclos.

Una extensión final de 10 minutos a 72 grados centígrados, y luego se mantuvo a cuatro grados centígrados. Después de la PCR específica de genes, realice 10 ciclos de PCR de etiqueta para incorporar adaptadores específicos de la plataforma para la compatibilidad con la secuenciación de próxima generación. Agregue 7,5 microlitros de la mezcla maestra de índice 2x y 5,5 microlitros de un código de índice a un pocillo especificado en una placa de 96 pocillos y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces.

Abra con cuidado la placa de gsPCR y agregue dos microlitros de producto de gsPCR a la nueva placa con la mezcla maestra. Coloque la placa sellada en el termociclador durante los siguientes ciclos de PCR, cinco minutos a 95 grados Celsius, 30 segundos a 95 grados Celsius, 30 segundos a 55 grados Celsius y un minuto a 72 grados Celsius durante 10 ciclos, y una extensión final de 10 minutos a 72 grados Celsius. Seguido de mantenerlo a cuatro grados centígrados.

Después de la PCR de etiquetas, la purificación de la biblioteca y la selección del tamaño se realizan mediante la química de perlas magnéticas. Comience este procedimiento agregando 11 microlitros de perlas magnéticas de preparación pura de biblioteca en pocillos separados de una placa de 96 pocillos. Abra la placa tag-PCR y agregue 10 microlitros de producto tag-PCR a las perlas y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces.

Incuba la mezcla durante cuatro minutos a temperatura ambiente. Coloque la placa de 96 pocillos en un soporte magnético durante cuatro minutos. Con la placa de 96 pocillos todavía en el soporte, retire y deseche el sobrenadante con una pipeta.

Después de lavar las perlas dos veces con tampón de lavado que contenga etanol como se describe en el texto del protocolo, seque las perlas durante dos minutos a temperatura ambiente y luego retire la placa del soporte. Vuelva a suspender las perlas añadiendo 20 microlitros de tampón de elución a cada pocillo y pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces. Incubar durante dos minutos a temperatura ambiente.

Vuelva a colocar la placa de 96 pocillos en el soporte magnético durante cuatro minutos y retire y transfiera con cuidado 18 microlitros del sobrenadante transparente a un pocillo en una nueva placa de 96 pocillos. El siguiente paso en este protocolo es la cuantificación de cada biblioteca de muestras purificadas mediante PCR en tiempo real relativamente competitiva. Para comenzar este procedimiento, prepare una cantidad suficiente de la mezcla maestra LQ en un tubo de microcentrífuga utilizando los siguientes volúmenes por muestra, cinco microlitros de mezcla maestra LQ 2x, dos microlitros de mezcla de sonda de cebador LQ, 0,5 microlitros de estándar LQ y 0,5 microlitros de LQ ROX.

Agregue 8 microlitros de la mezcla maestra LQ a un pocillo de una placa óptica de 96 pocillos. En pocillos separados, agregue dos microlitros de una dilución en serie de la biblioteca, dos microlitros de control positivo LQ y dos microlitros de diluyente LQ y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces. Coloque la placa sellada en el sistema de PCR y asigne detectores FAM y VIC para cada muestra.

Realice la amplificación por PCR utilizando las siguientes condiciones de ciclo, cinco minutos a 95 grados Celsius y 15 segundos a 95 Celsius, seguidos de un minuto a 60 grados Celsius durante 40 ciclos. A continuación, se calcula la concentración de cada muestra como se describe en el texto del protocolo. Después de la cuantificación de la biblioteca, cada biblioteca de muestras se normaliza en función de su concentración medida y se agrupa en un solo tubo para la secuenciación.

Se utiliza un módulo de análisis simplificado para facilitar los cálculos para la normalización de bibliotecas y la agrupación de muestras. Para normalizar la biblioteca, primero determine la concentración mediana en nanomolares en todas las muestras, cada una de las cuales contiene un índice de pares único que se agrupará. A continuación, determine el volumen de muestra individual en microlitros para agrupar multiplicando la concentración mediana de todas las muestras por cinco, y luego dividiéndolo por su concentración individual.

Agregue el volumen normalizado de cada muestra a un solo tubo de microcentrífuga para crear el grupo de muestras. Diluya el pool de muestras a 1,25 nanomolares utilizando un diluyente de secuenciación. Prepare el grupo de muestras para la secuenciación desnaturalizándolo en presencia de phix control V3. Combine lo siguiente, 15 microlitros de grupo de muestras de 1,25 nanomolares, tres micorrlitros de phix de 0,5 nanomolares y dos microlitros de hidróxido de sodio 1N.

Después de un breve vórtice y centrifugación, incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Agregue 8 microlitros de la biblioteca desnaturalizada a 992 microlitros de tampón alto HT1 preenfriado en un tubo de microcentrífuga. Añada 600 microlitros de la biblioteca desnaturalizada y diluida a la posición número 17 del cartucho de reactivo.

En tubos de microcentrífuga, diluir por separado cuatro microlitros de cada cebador de secuenciación con 636 microlitros de tampón alto HT1. Añada 600 microlitros de cebadores de secuenciación de lectura 1 diluidos a la posición número 18 del cartucho de reactivo de secuenciación. 600 microlitros de cebadores de lectura de índice diluidos hasta la posición número 19 y 600 microlitros de cebadores de secuenciación de lectura 2 diluidos hasta la posición número 20.

Cargue los reactivos en el instrumento de secuenciación de próxima generación y realice una secuenciación de dos por 150 ciclos de dos en dos extremos emparejados de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Por último, analice los datos de secuenciación utilizando el software bioinformático complementario. Se pudieron procesar un total de 90 muestras en una sola ejecución de NGS utilizando un secuenciador de sobremesa.

Para el conjunto de datos mostrado, las muestras incluyeron línea celular, parafina clínica residual formal y fija incrustada, o FFPE, y ADN molde sintético, y dieron como resultado una secuenciación de alta profundidad y una cobertura uniforme. Los valores atípicos se compusieron de controles sin plantilla, una serie de dilución de una línea de ADN celular con una amplificación de gran número de copias y un ADN FFPE que se marcó para la inhibición de PCR mediante el ensayo de control de calidad preanalítico basado en qPCR. La uniformidad de la cobertura a través de los 46 amplicones se mantuvo utilizando tres operadores diferentes y para diferentes muestras de ADN FFPE de baja calidad.

En FFPE, se informó que la mezcla de control de ADN tumoral compuesta por una mutación conocida de BRAF V600E al 5 % tenía la mutación BRAF objetivo en una abundancia promedio de 5,2 más o menos 1,3 por ciento por tres operadores que utilizaron una entrada de 400 copias amplificables. Las diluciones de líneas celulares y muestras de ADN FFPE con amplificaciones del número de copias demostraron dependencia para la amplificación de EGFR y KRAS. De manera importante, la entrada de ADN FFPE podría reducirse a tan solo 50 copias amplificables o 1,2 nanogramos de ADN a granel.

Al mismo tiempo, se preserva la detección de mutaciones conocidas sin llamadas de falsos positivos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 11 horas con aproximadamente tres horas y media de tiempo de mano para un tamaño de lote de 24 muestras a la vez, si se realiza correctamente.