Name: Combinados Optogenética y congelación-fractura Réplica Immunolabeling para Analizar Arreglo-entrada específica de glutamato receptores en el ratón amígdala (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprende a combinar optogenética con inmunomarcado de réplicas por fractura-congelación para analizar la densidad de receptores de glutamato en sinapsis de la amígdala de ratón. Este método permite el análisis cuantitativo de proteínas en microdominios pre y postsinápticos identificados.

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La financiación fue proporcionada por la subvención FWF del Fondo Austriaco para la Ciencia Nº P-22969-B11 a F. Ferraguti, y por la Fundación Benéfica Hertie y el Centro Werner Reichardt para la Neurociencia Integrativa y por la DFG (CIN-Exc. 307) a I. Ehrlich.

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

microscopía electrónica de congelación-fractura ha sido una técnica importante en la investigación ultraestructural por más de 40 años. Sin embargo, la falta de medios eficaces para estudiar la composición molecular de las membranas produjo una disminución significativa en su uso. Recientemente, ha habido un renacimiento importante en la microscopía electrónica de congelación-fractura debido al desarrollo de medios eficaces para revelar las proteínas integrales de membrana, mediante el etiquetado inmunoelectrónica 1, 2, a saber, la técnica de FRIL. La técnica FRIL posee varias ventajas sobre otros métodos ultraestructurales de inmunomarcaje. En primer lugar, las proteínas son fácilmente accesibles a los anticuerpos aumentando la sensibilidad. En segundo lugar, la exposición de gran parte de especializaciones de la membrana plasmática, tales como la membrana postsináptica, en la superficie de dos dimensiones de la réplica permite la inspección de la distribución espacial y la contigüidad física de moléculas de interés sin reconstrucción laborioso y requiere mucho tiempo de seriAl secciones ultrafinas. En tercer lugar, la disponibilidad de las dos mitades de la membrana plasmática aumenta el número de proteínas que se pueden etiquetar para cada estructura individual, anticuerpos adecuados proporcionados están disponibles. Tras la fractura, la cara hidrofóbica de la membrana de separación se recubre con carbono-platino que afianza dominios de proteína restantes en la superficie fracturada. Esto impide el acceso de los anticuerpos a los antígenos en estos dominios. Por ejemplo en el P-cara de una réplica de sólo epítopos que se enfrenta el espacio protoplasmática pueden ser detectados por los anticuerpos, mientras que en el E-cara solamente que los epítopos frente al espacio exoplasmic puede estar unido por anticuerpos (ver Figura 2). Por otra parte, la técnica de FRIL también sufre de ciertas limitaciones 2. Como fracturas se producen al azar, puede ser difícil a las células diana o estructuras específicas. Esto también puede conducir a un sesgo de muestreo, por ejemplo, en la recolección de sinapsis, dada la diferente probabilidad de fracturing a lo largo de la membrana de las estructuras con curvatura diferente (por ejemplo, frente a los ejes espinas). Por otra parte, la asignación de las proteínas de membrana a una de las dos caras es impredecible. Por lo tanto, la distribución de una proteína a la P-cara o E-cara, particularmente para los estudios cuantitativos, debe ser cuidadosamente examinada usando anticuerpos reactivos con los dominios intracelular y extracelular. Por último, la identificación de la réplica de ciertas estructuras, tales como terminales de los axones presinápticos, puede ser difícil cuando se basan solamente en las características morfológicas. Sin embargo, el uso de anticuerpos específicos para las proteínas marcadoras o la transducción de proteínas integrales de membrana etiquetados o canales usando vectores virales ofrece herramientas adicionales para facilitar la identificación de las membranas fracturados. Por ejemplo, este estudio se aprovechó de la transducción de ChR2-YFP en las neuronas del tálamo para identificar sus eferentes axonal en la amígdala o el etiquetado de los receptores opioides μ-para revelar mi postsinápticambranes de neuronas ITC. Con el fin de realizar la técnica FRIL con éxito, la atención se debe tener especial relativo a la fijación del tejido. la fijación del tejido Strong (&gt; paraformaldehído 2%) puede dar lugar a una alta tasa de fracturas-cruz y una disminución en la sensibilidad de etiquetado. Por otro lado, las fijaciones débiles hacen que la manipulación de tejidos y la preparación (por ejemplo, el corte de secciones) difícil. También es importante controlar que el grosor de los bloques recortados coincide con el espesor de la cinta de doble cara. Si el espesor de la muestra es menor que la de la cinta, las superficies del tejido podrían no se adhieren a la superficie de los dos soportes de metal, por consiguiente, la muestra congelada no está fracturado. Si el tejido es más grueso, se comprime con distorsiones estructurales inevitables cuando se realiza el sándwich de los dos portadores de cobre. La temperatura a la que se fracturó la muestra (en este protocolo, -115 ° C) juega también un papel importanteen la estructura de la réplica. Las temperaturas más altas pueden producir una mayor tasa de artefactos tales como condensación del vapor de agua en la superficie del tejido antes o durante la evaporación. Las temperaturas más bajas (&lt;-125 ° C) puede aumentar el riesgo de escisión del material durante la fracturación. Este material puede caer sobre la superficie de la muestra o mantenerse en contacto con ella. Estas escamas de material también son recubiertos y contrastada producir manchas oscuras en la imagen. Fracturando a temperaturas más bajas también puede afectar a la frecuencia de fracturas transversales-particularmente para las pequeñas estructuras finas, como las espinas dendríticas. Un paso crítico aún más en la preparación de réplicas es el detergente digestión. Si la digestión es incompleta, el tejido no digerido aparece como manchas oscuras en la réplica, confundiendo el análisis de la estructura en el TEM. Por otra parte, el tejido no digerido puede atrapar anticuerpos o se unen de forma no específica, aumentando el etiquetado de fondo. Por otro lado, el uso de detergentes para la digestión de tejidos puede desnaturalizar las moléculas asociadas a la réplica de la alteración de sus estructuras secundaria y terciaria. Por lo tanto, para ciertos antígenos podría ser necesario para diluir gradualmente la concentración de SDS con etapas de lavado adicionales. Para immunolabeling, la disponibilidad de diferentes tamaños de partícula de oro conjugado con anticuerpos secundarios permite detectar al mismo tiempo, pero sólo cualitativamente, múltiples proteínas, incluso en microdominios específicos de la membrana plasmática, tales como la especialización postsináptica. Sin embargo, debido al impedimento estérico, los estudios cuantitativos se limitan generalmente a la detección de una sola molécula. El tamaño de la partícula de oro también puede afectar a la eficacia de etiquetado. Para la interpretación de la etiqueta en FRIL, se debe tener en cuenta que la partícula inmunoelectrónica puede estar situado en cualquier lugar dentro de un hemisferio con un radio de 20 a 25 nm a partir del antígeno debido a la forma compleja flexiblesed por el anticuerpo primario y secundario 26. Para más información sobre la teoría y la práctica de FRIL y técnicas relacionadas, remitimos al lector también a otros artículos metodológicos 27, 28. La técnica FRIL se ha utilizado recientemente para alta resolución análisis cuantitativos de la localización del receptor de glutamato en diversas poblaciones de la sinapsis 29, 30. Por otra parte, la sensibilidad de detección de la técnica FRIL para la AMPA-R se estima tan alta como una partícula inmunoelectrónica por uno AMPA funcional -R canal 29. Por lo tanto, este enfoque es en general muy útil para cuantificar y analizar el patrón de expresión postsináptica de AMPA y NMDA-R-R en las sinapsis centrales. Aquí, hemos demostrado su aplicabilidad en las sinapsis PIN / MGN-ITC, un sitio más probable es importante para la transmisión de información de Estados Unidos durante el condicionamiento del miedo. El uso de un anticuerpo generado contra los residuos de aminoácidos extracelulares altamente conservadas de las subunidades del receptor de AMPA GluA1-GluA4, encontramos una distribución uniforme de las partículas de oro dentro de las agrupaciones IMP correspondientes a las especializaciones de la membrana postsináptica. La densidad de AMPA-R en las espinas ITC fue significativamente mayor en comparación con las sinapsis de eje dirigidos por PIN / MGN aferentes talámicas. En ambos sinapsis de la columna vertebral y el eje, se detectó una correlación positiva entre el etiquetado de AMPA-R y el área postsináptica, una característica común a otras sinapsis glutamatérgicas 25. La baja variación en la densidad de AMPA-R en las sinapsis PIN / MGN-ITC indica una distribución homogénea similar a otras sinapsis formadas por eferentes talámicas 7, pero diferente de las sinapsis corticales 25. Por el contrario, la densidad de NMDA-R es más variable y no hubo diferencia entre la columna vertebral y el eje de las sinapsis que sugiere una regulación diferente de la AMPA-R. En el futuro, la alta reproducibilidad de la técnica FRIL no sólo permitirá evaluar la composición molecular basal de las sinapsis centrales, pero puede facilitar la detección de cambios en el número de receptores de glutamato ionotrópicos y distribución subsináptica Después de aprender el miedo, como complemento de las grabaciones de ex-vivo de propiedades pre y postsinápticos de estas entradas. En conclusión, este enfoque podría ser utilizado por otros investigadores para obtener información sobre las relaciones estructura-función de las sinapsis excitadoras-entrada específica en muchos otros circuitos neuronales en el que desentrañar el origen de los insumos y la naturaleza y composición de los elementos postsinápticos es crucial, pero problemático .

La definición de la arquitectura funcional de biomembranas en escala nanométrica se ha cuestionado en los últimos años por el desarrollo de una serie de técnicas immunolabeling adecuadas para microscopía electrónica de transmisión. Sin embargo, estas técnicas, por ejemplo, antes y después de la incorporación de inmunoelectrónica, tienen una serie de limitaciones importantes, que incluyen la mala detección de antígenos y / o evaluación cuantitativa limitado de proteínas unidas a membrana. Estas limitaciones se hacen particularmente crítico en la investigación de la estructura fina del sistema nervioso, que se caracteriza por un alto grado de diversidad de células y la heterogeneidad sinapsis. Esta heterogeneidad resultados de la diversidad estructural y funcional dictada por los elementos pre y postsinápticos y por la expresión diferencial, el enriquecimiento, o la interacción de las proteínas de señalización, tales como receptores, transportadores, y las moléculas efectoras. Un nuevo enfoque para immunolabe directaling de las proteínas integrales de membrana o reticulados en réplicas de congelación-fractura solubilizada con detergente (FRIL) fue introducido originalmente por Fujimoto hace dos décadas 1. Este método original tenía, sin embargo, varias limitaciones, es decir, la fragmentación severa de réplicas, lo cual obstaculizó correlaciones significativas de moléculas marcadas con células organizadas en tejidos complejos de forma individual, como el cerebro. Hace aproximadamente 10 años, y Shigemoto Fukazawa mejora progresiva de la técnica 2. Esto fue acompañado de esfuerzos por parte de otro grupo de científicos de los laboratorios de Boulder de la Universidad del Estado de Colorado, que también mejoraron significativamente la técnica, en particular, para el estudio de las uniones comunicantes 3. La mejora en los protocolos de congelación-fractura y máquinas, así como la introducción de congelación rápida (a alta presión), ahora permite a los investigadores para producir réplicas ininterrumpida de especímenes de tamaño relativamente grande y high imágenes de calidad de la mayoría de los componentes celulares sin las limitaciones y artefactos producidos por fuertes fijaciones químicas. La técnica FRIL ofrece la gran ventaja de un altamente cuantitativo en la identificación in situ de una o más proteínas (simultáneamente) en histológicamente asignada y células citológicamente identificados dentro de los tejidos complejos tales como el cerebro, con la ventaja adicional de una vista en planta de pre- y postsináptica elementos en una única réplica. Por lo tanto, la técnica de FRIL, a pesar de sus numerosos obstáculos técnicos, mantiene la promesa para un número de avances científicos muy importantes, en particular para la correlación de las propiedades estructurales y funcionales de las sinapsis individuales. Durante las últimas décadas, una gran cantidad de información que se haya obtenido sobre la estructura, composición molecular, y la función fisiológica de las sinapsis; sin embargo, las sinapsis son morfológica y molecularmente muy diversas dependiendo del pa pre y post-sinápticaalquiler neuronas 4. Sólo un puñado de tipos de sinapsis fueron los estudios de estructura-función logrado hasta ahora 5-7. Esto fue principalmente debido a limitaciones técnicas que impedían una identificación precisa de la naturaleza de los elementos pre y postsinápticos. El análisis ultraestructural ha proporcionado una perspectiva crítica en la variabilidad de las especializaciones de la membrana postsináptica a través de los contactos sinápticos distintas, tanto en términos de tamaño y contenido sináptica en receptores de neurotransmisores 6, que tiene un gran impacto en la fuerza y la plasticidad de la transmisión sináptica. Por otra parte, una gran cantidad de investigaciones indica que el número de receptores de glutamato ionotrópicos expresadas en diferentes tipos de sinapsis se regula de una manera afferent- y dependiente de la diana 7-10. Aquí, un método se describe que permite el análisis de la estructura y composición del receptor especializaciones de membrana postsinápticos con definird elementos presinápticos y función. Este enfoque se aprovecha de expresión presináptica de luz proteínas de algas sensibles recientemente desarrollados, como channelrhodopsin2 (ChR2), y de la técnica de FRIL para analizar el patrón de expresión postsináptica de α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico ácido (AMPA-R) y N-metil-D-aspartato (NMDA-R) receptores de glutamato. Esto se demuestra en las sinapsis formadas por los axones procedentes de los núcleos del tálamo-geniculado medial posterior (PIN / MGN) en las neuronas de las masas de células intercalares de la amígdala (ITC). Neuronas ITC son pequeñas células GABAérgicas espinosas organizados en grupos que rodean el complejo amigdalino basolateral (BLA) 11, 12. Neuronas ITC son conocidos para recibir entradas excitadoras desde BLA neuronas principales y para apuntar el núcleo central (CEA), lo que funciona como una puerta inhibidora para el flujo de información entre el BLA y CEA 12-15. Recientemente, hemos demostrado que las TIC neuronas ubicadas en el clúster medio-dorsal entre BLA y CEA también reciben entradas excitadoras directos y convergentes de las regiones corticales del tálamo y temporales sensoriales, que se modifican en el miedo pavloviano aprendizaje durante el condicionamiento del miedo auditivo 16. El condicionamiento del miedo es una de las formas más entendidos de aprendizaje asociativo en términos de los mecanismos del cerebro. En el condicionamiento del miedo, un estímulo condicionado inicialmente neutro (CS, por ejemplo, un tono) está emparejado con un estímulo aversivo incondicionado (EI, por ejemplo, un choque ligero en los pies), resultando en una asociación EC-EI y condicionado respuesta de miedo 17, 18. Excitatorios aportaciones de ambas áreas del tálamo y neocorticales, que transportan información que representa el CS y Estados Unidos, respectivamente, se sabe que convergen en las neuronas piramidales del núcleo lateral de la amígdala (lA) y se someten a la plasticidad 19. Nuestro trabajo anterior reveló que la información de entrada sensorial es también retransmitida en paralelo a las neuronas ITC <shasta&gt; 16. Como un primer paso hacia un análisis molecular mecanicista de la entrada sensorial individuo sinapsis en las neuronas del ITC, se utilizó un virus adeno-asociado (AAV) para expresar ChR2 etiquetado con la proteína fluorescente amarilla (YFP). El AAV se inyectó en el PIN / MGn y los terminales de los axones se identificaron por su expresión de ChR2-YFP. Utilizamos ambas caras generadas por la técnica FRIL para evaluar la densidad postsináptica de AMPA y NMDA-R-R en las sinapsis formadas con ITC neuronas por terminales de los axones PIN / MGN.

<table><tbody><tr><td>Surgery</td>Stereotactic frame Stoelting, USA 51670 puede ser reemplazado por otro marco estereotáctico para ratones Adaptador de ratón de frame estereotactic Stoelting, USA 51625 Máscara de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anestesia de gas para ratones</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>ya no está disponible, reemplazado por el art. no. 51609M</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de inyección a presión, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, EE. UU.</td><td>T25-2-900</td><td>Se pueden utilizar otros dispositivos de inyección a presión (por ejemplo, Picospritzer)</td></tr><tr><td>Kwik Fill capilares de vidrio</td><td>World Precision Instruments, Alemania</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de anestesia, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Alemania</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura de CC y almohadilla térmica</td><td>FHC, EE. UU.</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas horizontales modelo P-1000</td><td>Sutter Instruments, EE. UU.</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de herramientas quirúrgicas, Esterilizador 75</td><td>Melag, Alemania</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotipo 2/9)</td><td>Penn Vector Core, EE. UU.</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>fast green</td><td>Roth, Alemania</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>Anestésico isoflurano, isofurano CP (1 ml/ml)</td><td>CP Pharma, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiséptico, Betadine (providona-yodo)</td><td>Purdure Products, EE. UU</td>. <td>BSOL32</td><td>puede ser reemplazado por otros desinfectantes</td></tr><tr><td>Analgésico, Metacam Solución (5 mg/ml meloxicam)</td><td>Boehringer Ingelheim, Alemania</td><td></td><td>puede ser reemplazado por otros analgésicos</td></tr><tr><td>Bepanthen ungüento para los ojos</td><td>Bayer, Alemania</td><td>0191</td><td>puede ser reemplazado por otros ungüentos para los ojos</td></tr><tr><td>Taladro NM3000 (SNKG1341 y SNIH1681)</td><td>Nouvag, Suiza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox Aguja de sutura</td><td>Herramientas de ciencia fina, Alemania</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de seda trenzada</td><td>Herramientas de ciencia fina, Alemania</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte></td></tr><tr><td><fuerte>Preparación de tejidos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído grado EM</td><td>Agar Scientific Ltd., Reino Unido</td><td>AGR1018</td><td></td></tr><tr><td>Solución saturada de ácido pícrico</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU</td>. <td>P6744-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4-2H20</td><td>Merck Millipore, Alemania</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4-2H2O&nbsp;</td><td>Merck Millipore, Alemania</td><td>1063451000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore, Alemania</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>4N NaOH</td><td>Carl Roth, Alemania</td><td>T198.1</td><td></td></tr><tr><td>Tiopental</td><td>Sandoz, Austria</td><td>5.133</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de agua ultrapura GenPure</td><td>Thermo Fisher Scientific, EE. UU.</td><td></td><td></td>50131235</tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>ISMATEC, Alemania</td><td>ISM 930C</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>MACHEREY-NAGEL, Alemania</td><td>MN 615 1/4</td><td></td></tr><tr><td>Vibroslicer, VT1000S</td><td>Leica Microsystems, Austria</td> Bisturí oftálmico Alcon Laboratories, EE<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>. UU.</td><td></td><td>puede ser reemplazado por otros bisturíes oftálmicos</td></tr><tr><td>Cánula de perfusión</td><td>Vieweg, Alemania</td><td>F560088-1</td><td>puede ser reemplazado por artículos similares de otras compañías</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>High-pressure&nbsp; Portadores </cobre fuerte> por congelación Oficina de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ingeniería M. Wohlwend, CH</td><td>528</td><td></td></tr><tr><td>Sidol Polish</td><td>Henkel, Alemania</td><td></td><td>puede ser reemplazado por el mismo artículo de otras empresas</td></tr><tr><td>Piel de gamuza</td> Tienda <td></td><td></td>de <td>suministros para el hogar</td></tr><tr><td>Perforadora, 1,5 mm</td><td>Stubai, Austria</td><td></td><td>puede ser reemplazado por el mismo artículo de otras empresas</td></tr><tr><td>Etanol desnaturalizado</td><td>Donauchem, Austria</td><td></td><td>puede ser reemplazado por el mismo artículo de otras compañías</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Roth, Alemania</td><td>9372.5</td><td>¡ATENCIÓN!</td></tr><tr><td>Máquina de congelación a alta presión HPM 010</td><td>BalTec, CH; ahora Leica Microsystems</td><td>HPM010</td><td>ya no se produce, sustituida por LeicaEM HPM100</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Olympus, Japón</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno</td><td></td><td></td> líquido <td>¡ATENCIÓN!</td></tr><tr><td>Los viales criogénicos</td><td>Roth, Alemania</td><td>E309.1</td><td>pueden ser reemplazados por el mismo artículo de otras compañías</td></tr><tr><td>CryoCane</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5015-0001</td><td>pueden ser reemplazados por el mismo artículo de otras compañías</td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5016-0001</td><td>pueden ser reemplazados por el mismo artículo de otras compañías</td></tr><tr><td>Recipiente de almacenamiento de nitrógeno líquido</td><td>Cryopal, Francia</td><td>GT38</td><td>puede ser reemplazado por el mismo artículo de otras empresas</td></tr><tr><td>Detergente no iónico (Lavocid)</td><td>Werner & Mertz Professional, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Freeze-fracture and Replication</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sandblaster, Mikromat 200-1</td><td>JOKE Joisten & Kettenbaum, Alemania</td><td>SANDURET 2-K</td><td>puede ser reemplazado por el mismo artículo de otras empresas</td></tr><tr><td>Siliciumcarbid SIC 360, tamaño de grano 25 - 21&micro;</td><td>BROMA Joisten & Kettenbaum, Alemania</td><td>955932 sistema de</td><td></td></tr><tr><td>fractura por congelación BAF 060</td><td>BalTec, CH; ahora Leica Microsystems</td><td>BAF060</td><td></td></tr><tr><td>Placa cerámica de 12 pocillos</td><td>Gr&ouml; pel, Austria</td><td>14511</td><td>puede ser reemplazado por el mismo artículo de otras compañías</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>SIGMA, USA</td><td>T1503</td><td>puede ser reemplazado por el mismo artículo de otras compañías</td></tr><tr><td>Trizma clorhidrato</td><td>SIGMA, USA</td><td>T3253</td><td>puede ser reemplazado por el mismo artículo de otras compañías</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Merck, Alemania</td><td>1,064,041,000</td><td>puede ser reemplazado por el mismo artículo de otras compañías</td></tr><tr><td>SDS, Lauril sulfato de sodio</td><td>Roth, Alemania</td><td>5136.1</td><td>¡ATENCIÓN! ; &nbsp; puede ser reemplazado por el mismo artículo de otras compañías</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Merck, Alemania</td><td>1,076,871,000</td><td>puede ser reemplazado por el mismo artículo de otras compañías</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Roth, Alemania</td><td>5429.3</td><td>puede ser reemplazado por el mismo artículo de otras compañías</td></tr><tr><td>Universal Hybridization</td><td>Oven Binder, Alemania</td><td>7001-0050</td><td>puede ser reemplazado por el mismo artículo de otras compañías</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Immunolabelling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA, EE. UU</td>. <td>A9647</td><td>puede ser reemplazado por el mismo artículo de otras empresas</td></tr><tr>Sondas moleculares de<td>anticuerpos anti-GFP</td><td>, EE. UU</td>. <td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-pan-AMPAR</td><td>Anticuerpo Frontier Institute, Japón</td><td>Pan AMPAR-GP-Af580-1</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-NMDAR1, clon 54.1</td><td>Merck Millipore, Alemania</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Opioid Receptor-Mu (MOR)</td><td>ImmunoStar, EE. UU</td>. <td>24216</td><td></td></tr><tr><td>EM cabra anti-conejillo de indias, 5 nm; anticuerpo secundario</td><td>BBInternational, Reino Unido</td><td>EM. GAG5</td><td></td></tr><tr><td>EM anti-conejo de cabra, 15 nm; anticuerpo secundario</td><td>BBInternacional, EM del Reino Unido</td><td>. GAR15</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-conejo, 10 nm, anticuerpo secundario</td><td>AURION, Países Bajos</td><td>DAR 10 nm</td><td></td></tr><tr><td>Rejillas de cobre, 100 barras paralelas</td><td>; Agar scientific, Reino Unido</td><td>G2012C</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Major Science, EE. UU</td>. <td>MO-RC</td><td>puede ser reemplazado por el mismo artículo de otras empresas</td></tr><tr><td>Pioloform Powder</td> <td>&nbsp; Agar scientific, Reino Unido</td><td>R1275</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Roth, Alemania</td><td>3313.1</td><td>¡ATENCIÓN! ; &nbsp; puede ser reemplazado por el mismo artículo de otras compañías</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>EM análisis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM120 TEM</td><td>Philips/FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Morada Cámara CCD</td><td>Sistemas de imágenes blandas, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTEM Ver. 5.2, software de imagen</td><td>Soft Imaging Systems, Alemania</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combinados optogenética y congelación-fractura réplica immunolabeling para analizar arreglo-entrada específica de glutamato receptores en el ratón amígdala

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

microscopía electrónica de congelación-fractura ha sido una técnica importante en la investigación ultraestructural por más de 40 años. Sin embargo, la falta de medios eficaces para estudiar la composición molecular de las membranas produjo una disminución significativa en su uso. Recientemente, ha habido un renacimiento importante en congelación-fractura de microscopía electrónica gracias al desarrollo de medios eficaces para revelar las proteínas integrales de membrana, mediante el etiquetado inmunoelectrónica. Uno de estos métodos es conocido como detergente solubilizadas Freeze-fractura Replica Immunolabeling (FRIL). La combinación de la técnica de FRIL con optogenética permite un análisis de correlación de las propiedades estructurales y funcionales de las sinapsis centrales. Con este enfoque es posible identificar y caracterizar las neuronas tanto pre- y postsinápticos por su respectiva expresión de un canalrodopsina etiquetado y marcadores moleculares específicos. El aspecto distintivo de la especialización de la membrana postsináptica glutamatérgico sinapsis permite además, al etiquetado de los receptores de glutamato ionotrópicos, para cuantificar y analizar la distribución intrasynaptic de estos receptores. A continuación, se da una descripción paso a paso de los procedimientos necesarios para preparar réplicas pareadas y cómo inmunomarcador ellos. También discutiremos las salvedades y limitaciones de la técnica FRIL, en particular los relacionados con los posibles sesgos de muestreo. La alta reproducibilidad y la versatilidad de la técnica FRIL, cuando se combina con la optogenética, ofrece un enfoque muy importante en la caracterización de los diferentes aspectos de la transmisión sináptica en microcircuitos neuronales identificados en el cerebro. Aquí, proporcionamos un ejemplo de cómo se utilizó este método para obtener información sobre las relaciones estructura-función de las sinapsis excitadoras en las neuronas de las masas de células intercalares de la amígdala ratón. En particular, hemos investigado la expresión de los receptores de glutamato ionotrópicos en las entradas identificadas oiginated del intralaminar posterior del tálamo y el núcleo geniculado medial. Estas sinapsis, se mostró a transmitir información sensorial relevante para el aprendizaje y el miedo a sufrir cambios de plástico sobre el condicionamiento del miedo.

La técnica de FRIL, cuando se combina con la expresión de los actuadores optogenética de origen microbiano 21, es decir, canales integrados en la membrana plasmática y eficazmente transportados anterogradely a lo largo de los axones, permite examinar cuantitativamente la expresión postsináptica de AMPA-R y de NMDA-R en un subgrupo definido de las sinapsis. Esto se muestra aquí por los axones procedentes de los núcleos del tálamo distinta (por ejemplo, el PIN / MGn) sobre las neuronas ITC en la amígdala. Este enfoque permite un análisis molecular de las sinapsis de entrada sensoriales individuales en neuronas ITC, un grupo de células que han sido refractarios a una caracterización anatómica y molecular detallada hasta el momento. Cuatro semanas después de la inyección estereotáctica del rAAV-YFP-ChR2 en el PIN / MGn, los axones ChR2-YFP-positivas densamente inervadas la LA, la zona de transición amygdalostriatal (Astria) y el paracapsular I medial<html> Clúster de TC en la amígdala, un patrón totalmente coherente con el trazado anterior estudia 16, 22. También se detectó una intensa oro immunolabeling para la ChR2-YFP en el P-cara de los axones y terminales en réplica de congelación-fractura de rAAV-ChR2-YFP- ratones inyectados (figura 5A), pero no en las réplicas de los ratones no inyectados. La especialización de la membrana postsináptica de las sinapsis glutamatérgicas en una réplica se puede observar como un grupo de partículas intramembrane (PIM) en el E-cara de la membrana plasmática 2, 23, y con frecuencia se acompaña de la P-cara de su membrana plasmática presináptica 7 (Figura 5B-C). Permitieron identificar la especialización post-sináptica de las sinapsis glutamatérgicas formados por terminales de los axones PIN / MGN Estas características (Figura 5 y 6). Hemos marcado AMPA-R con un anticuerpo que reconoce todas las cuatro subunidades (GluA1-4), mientras que de NMDA-R se detectaron utilizando un anticuerpo contra la subunidad NR1 esencial. ntent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Debido a la falta de herramientas para detectar en la misma réplica si estas sinapsis se hicieron con las espinas dendríticas o ejes de las neuronas del ITC, que marcó la cara réplica correspondiente para μ los receptores de opioides, como las neuronas ITC expresan postsináptico altos niveles de estos receptores 24. Esto requiere la identificación de los mismos perfiles postsinápticos en las dos réplicas (Figura 5C-F y la Figura 6A-D) usando una estrategia que emplea puntos de referencia (Figura 4E) . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig5.jpg" /> Figura 5. Detección de ChR2-YFP y glutamato ionotrópicos receptores en la reproducción por Inmunoelectrónica partículas. (A) Un terminal del axón-transversal fracturada (azul claro) y pequeñas porciones de su P-cara marcada con 15 nm de partículas de oro que detectan ChR2-YFP. Dentro de la terminal, la membrana of numerosas vesículas sinápticas se pueden observar (sv). Tenga en cuenta la especificidad de la inmunomarcación en gran parte restringidos a la membrana plasmática. Las etiquetas de los ChR2 identifica el terminal como originarios del PIN / GNM. El terminal forma una sinapsis asimétrica con una columna vertebral. La especialización membrana postsináptica (PSD) en el E-rostro muestra un racimo característico de partículas intramembrane y se etiqueta con 5 nm de partículas de oro que revelan AMPA-R. (B) El P-cara de un axón ChR2 que expresan (marcado con 15 partículas de oro nm) se muestra que bordea dos dendritas, uno de ellos posee dos PSDs marcadas con 5 nm partículas de oro que revelan NMDA-R. (CD) las caras opuestas de las membranas pre y postsinápticos de una sinapsis PIN / MGN-ITC. (C) El P-cara del terminal expresa ChR2 (marcado con partículas de oro 15 nm) y se extiende sobre el E-cara de dos ejes dendríticas, uno de ellos contiene dos PSDs etiquetados para AMPA-R (5 partículas nm de oro). ( <strong&gt; D) El correspondiente P-cara de los dos dendritas está etiquetado para los receptores opioides μ-partículas (10 nm de oro). (EF) vistas ampliadas de las áreas señaladas por las líneas punteadas. Las barras de escala:. 500 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Se encontraron inmunopartículas para AMPA-R en las sinapsis PIN / MGN-ITC en todo el clúster IMP, lo que sugiere una distribución homogénea dentro de la especialización post-sináptica (Figura 5E). A significativamente mayor (prueba t no pareada p &lt;0,018) densidad de etiquetado AMPA-R se observó en PIN / MGn sinapsis en espinas ITC (715 ± 38 partículas de oro / micras 2, n = 32) en comparación con las sinapsis Onto dendritas ITC (590 ± 44 partículas de oro / micras 2, n = 32). En general, la densidad del AMPA-R en las sinapsis PIN / MGN-ITC mostró una relativamente bajavarianza (coeficiente de variación, CV = 0,37) de acuerdo con una distribución homogénea. Inmunopartículas de NMDA-R en las sinapsis PIN / MGN-ITC se observa a menudo distribuidos de manera desigual dentro de las agrupaciones IMP postsinápticos (Figura 5B). La densidad de etiquetado NMDA-R fue similar (no pareada t-test p = 0,39) entre el PIN / MGn sinapsis en las espinas del ITC (1070 ± 153 partículas de oro / micras 2, n = 8) y las dendritas ITC (812 ± 183 partículas de oro / m 2, n = 9). A diferencia de lo observado para AMPA-R, la densidad de NMDA-R en las sinapsis PIN / MGN-ITC fue muy variable (CV = 0,54). <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig6.jpg" /> Figura 6. AMPA y NMDA-R-Rs Immunolabeling en Identificadas Las sinapsis PIN / MGN-ITC. (AB) caras opuestas de las membranas pre y postsinápticos de un NIP / MGN-ITCsinapsis hecho en una espina dendrítica en el que el P-cara del terminal expresa ChR2 (marcado con partículas de oro de 15 nm) y el PSD en una espina dendrítica está etiquetado para AMPA-R (5 nm partículas de oro). (CD) vistas ampliadas de las áreas descritas por la línea discontinua. Estas áreas han sido girado aproximadamente 45 ° en sentido antihorario para permitir una mejor vista de la PSD. (E) Diagramas de dispersión del número de partículas AMPA-R frente a la zona sináptica en las espinas y las dendritas ITC. En ambas estructuras, se ha observado una correlación positiva. (F) Diagramas de dispersión del número de partículas de NMDA-R contra la zona sináptica en las espinas y las dendritas ITC. Una correlación positiva significativa se detectó sólo en las espinas dendríticas. Las barras de escala:. 500 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Porqueel P-cara de la membrana plasmática presináptica menudo superpuestos, en parte, la agrupación IMP postsináptica, podríamos estimar el área sináptica de sólo el 30% de las sinapsis (espinas: significan área de 0.032 m 2, rango: 0,007 a ​​0,063 m 2, n = 8; dendritas: 0,047 m 2, rango: 0,024 a 0,166 m 2, n = 11). Estos fueron en un rango similar como se ha analizado anteriormente glutamatérgica telencephalic sinapsis 25. En ambas espinas y las dendritas, el número de oro para inmunopartículas AMPA-R en las sinapsis individuales se correlacionó positivamente con el área sináptica (Spearman, espinas: r = 0,88, dendritas: r = 0,60, p &lt;0,0001) (Figura 6E). Por el contrario, se encontró el número de inmunopartículas oro para NMDA-R que se correlaciona con la zona sináptica en las espinas (Spearman, espinas dorsales: r = 0,90, p &lt;0,002), pero no en las dendritas (r = 0,21, p = 0,29) (Figura 6F ).

Este artículo ilustra cómo se puede cuantificar la expresión de receptores de neurotransmisores y analizar el patrón en sinapsis con elementos pre y postsinápticos identificados utilizando una combinación de transducción viral de herramientas optogenéticas y la técnica de inmunomarcaje de réplica de congelación-fractura.

Combinados Optogenética y congelación-fractura Réplica Immunolabeling para Analizar Arreglo-entrada específica de glutamato receptores en el ratón amígdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

El objetivo de este procedimiento, que combina la optogenética con la técnica de inmunomarcado en réplicas de fractura congelada, es analizar la densidad de receptores ionotrópicos de glutamato en sinapsis de la amígdala del ratón con elementos pre y postsinápticos identificados. La alta reproducibilidad y versatilidad de la técnica de inmunomarcado en réplicas de fractura congelada, cuando se combina con la optogenética, ofrece un enfoque muy potente para el análisis correlacionado de las propiedades estructurales y funcionales de las sinapsis. Las principales ventajas de este procedimiento son: la vista en plano de los elementos presinápticos y postsinápticos, y el análisis cuantitativo de proteínas en estos microdominios especializados.Pueden adaptarse diferentes técnicas a una variedad de tejidos para estudiar la distribución y organización de proteínas integrales de membrana. En general, este enfoque combinado de FRIL optogenético es un reto para principiantes debido al amplio conjunto de aparatos y máquinas necesarios. Es fundamental comenzar la modulación con un método diferente, ya que otros pasos son difíciles de aprender.Por ejemplo, fracturar y replicar especímenes congelados. Para comenzar este procedimiento, pegue un bloque coronal del cerebro de ratón sobre el soporte de la cortadora vibrante. Oriente el bloque de tejido de manera que la neocorteza quede frente a la cuchilla vibrante. A continuación, corte secciones coronales que contengan la amígdala con un grosor de 140 micrómetros en tampón fosfato 0,1 M, frío. Y recójalas en una placa de seis pocillos con el mismo tampón.Bajo un microscopio estereoscópico, recorte la región de interés de las secciones en una placa de Petri recubierta con elastómero de silicona y llenada con PB de cero punto uno molar. Luego, transfiera el bloque recortado a la solución de crioprotección y déjelo toda la noche a seis grados Celsius. En este paso, prepare los portadores de cobre para su uso en las etapas sucesivas del procedimiento FRIL, puliéndolos con una gamuza como removedor de manchas. Bajo el microscopio, fije un anillo de cinta adhesiva doble faz al portador de cobre, que servirá como pozo de sujeción para el bloque recortado.Luego, coloque el bloque recortado en el orificio de la cinta de doble cara utilizando un asa de alambre de platino. Retire la solución de crioprotector en exceso con papel de filtro o un pincel. Posteriormente, cubra el portador de sujeción con otro portador.De modo que el bloque de tejido quede emparedado entre los dos portadores. Para congelar la muestra, inserte el emparedado de portadores en el portaobjetos. Posteriormente, inserte el portaobjetos en la unidad de congelación por alta presión.Inicie el ciclo de congelación presionando el botón jet-auto, retire inmediatamente el portamuestras e introduzca la punta en una caja aislante con nitrógeno líquido. Luego, retire cuidadosamente el sándwich portador del portamuestras y colóquelo en un criotubo previamente enfriado. Almacene los criotubos que contienen los portadores en un criotanque hasta la replicación.Antes de insertar la pistola de haz de electrones, retire el blindaje con la placa deflectora. Coloque la plantilla de ajuste, para centrar el filamento, dentro del portabrocas a través de la tapa inferior del cátodo. A continuación, deslice el nuevo filamento sobre la plantilla hasta que las láminas de presión sujeten los extremos del filamento.A continuación, retire el calibrador de ajuste e inserte la varilla de carbono. Fíjela apretando el portabrocas del soporte de la varilla del evaporador, asegurándose de que la altura del extremo de la varilla se encuentre en la mitad de la segunda bobina contando desde la parte inferior.A continuación, coloque la placa deflectora y inserte la pistola de electrones en la unidad de fractura por congelación. En este procedimiento, ajuste la corriente y el voltaje para la evaporación. Luego, inserte el sándwich del portador congelado en la mesa de doble réplica bajo nitrógeno líquido.Luego, transfiera la mesa de doble réplica al recipiente Dewar y fíjela al receptor de la etapa de muestra en un ángulo de 45 grados. Tome la mesa de doble réplica con un manipulador de mesas. Insértela en la unidad de fractura por congelación sobre la etapa fría y espere aproximadamente 20 minutos para permitir que la temperatura de la mesa de doble réplica se ajuste a menos 115 grados Celsius.Posteriormente, fracture el tejido girando manualmente la rueda en sentido antihorario, la cual está conectada a la cubierta situada encima de la mesa de doble réplica. Cuando la cubierta gira, fuerza a la mesa de doble réplica a abrirse, lo que provoca la fractura del tejido. Se aplica una capa de carbono desde un ángulo de 90 grados sobre las superficies fracturadas.Posteriormente, retire los especímenes replicados de la mesa de doble réplica y transfiéralos a una placa cerámica de 12 pocillos llena con TBS. Utilizando una varilla de alambre de platino, retire el tejido replicado del portador del espécimen. Para la digestión con SDS, transfiera una réplica a un vial de vidrio de cuatro mililitros que contenga un mililitro de tampón de digestión con SDS.Dejar que digiera durante 18 horas a 80 grados Celsius con agitación. Para la inmunomarcación, lavar la réplica durante 10 minutos en tampón fresco de digestión con SDS. Luego, incubarla con anticuerpos primarios y secundarios, diluidos en TBS con 2 % de BSA, en una cámara húmeda a 15 grados Celsius durante 24 a 72 horas.A continuación, monte la réplica sobre una cuadrícula paralela de 100 líneas recubierta con colodión. Observe la réplica con un microscopio electrónico de transmisión a 80 o 100 kilovoltios. Luego, adquiera las imágenes digitales mediante una cámara CCD.Cuando está fuera de línea, localice las regiones correspondientes en la imagen de la réplica, utilizando diferentes puntos de referencia. Cuatro semanas después de la inyección de AAV, para expresar la canalrodopsina-2 en el grupo nuclear tálamico posterior, la canalrodopsina-2 se transporta eficazmente de forma anterógrada a lo largo de los axones talámicos hasta alcanzar las masas celulares intercaladas de la amígdala. La especialización postsináptica de las sinapsis glutamatérgicas puede reconocerse en una réplica como un cúmulo de partículas intramembranales en la cara E de la membrana plasmática, y a menudo va acompañada por la cara P del elemento presináptico correspondiente.Aquí, la canalrodopsina-2 y los receptores de glutamato se visualizaron mediante partículas de oro de diferentes tamaños conjugadas a los anticuerpos secundarios. Debido a la falta de herramientas estructurales o moleculares para detectar en la misma réplica si la membrana postsináptica pertenecía a las neuronas intercaladas, la réplica correspondiente se marcó para los receptores de opioides mu, un marcador de estas neuronas.Como ejemplo del análisis cuantitativo de la densidad de receptores de glutamato en estas sinapsis, aquí se presentan los gráficos de dispersión del número de partículas de oro para los receptores AMPA frente al área sináptica en espinas y dendritas, que revelan una correlación positiva en ambas estructuras. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que los pasos individuales son altamente interdependientes.Por lo tanto, un error en uno de los pasos puede comprometer todo el procedimiento. La visualización de una gran porción de especializaciones de la membrana plasmática sobre una superficie bidimensional de la réplica permite inspeccionar la distribución espacial y la continuidad física de las moléculas de interés sin necesidad de una reconstrucción laboriosa y que consume mucho tiempo de secciones seriadas de artrophin. Este enfoque puede ser utilizado por otros investigadores para obtener información sobre las relaciones entre la estructura y la función de sinapsis específicas en circuitos neuronales.Donde es fundamental, pero problemático, desentrañar el origen de las entradas y la naturaleza de los elementos postsinápticos.

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Investigación

JoVE Journal

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Neurociencia

Este video muestra un procedimiento para analizar la conectividad sináptica entre la corteza prefrontal medial (mPFC) y las neuronas de la amígdala utilizando cortes de cerebro de amígdala aguda de ratones. Las neuronas mPFC de estos ratones expresan canalrodopsina fusionada con una proteína fluorescente. Las canalrodopsinas facilitan la entrada de iones y la generación de potencial de acción en las neuronas mPFC tras la activación de la luz. En consecuencia, las neuronas mPFC liberan...

Visualización y mapeo de vías neuronales en un corte de cerebro de amígdala

Fuente: Schönherr, S., et. al. Inmunomarcaje combinado optogenético y réplica de fractura por congelación para examinar la disposición específica de entrada de los receptores de glutamato en la amígdala de ratón. J. vis. exp. (2016)Este vídeo muestra el inmunomarcaje de réplicas fracturadas por congelación de tejido cerebral de ratón para microscopía electrónica. Las réplicas fracturadas y recubiertas se digieren para exponer los receptores. Se añaden anticuerpos primarios y secundarios...

Inmunomarcaje de proteínas de membrana neuronal en un espécimen de tejido cerebral de ratón fracturado por congelación

Fuente: Maruoka, H., et. al. Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos. J. Vis. Exp.  (2022) Este video muestra un procedimiento de microscopía de dos fotones para obtener imágenes de la actividad neuronal y la dinámica microglial en un ratón despierto durante la estimulación visual, destacando los transitorios de calcio y las interacciones celulares.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en un ratón despierto

Este video muestra el procedimiento de craneotomía que permite obtener imágenes crónicas de neuronas en la corteza retroesplenial de ratón utilizando microscopía in vivo de dos fotones en la línea transgénica Thy1-GFP. Este enfoque se combina con la inyección de virus adenoasociados que expresan mCherry en el hipocampo dorsal. Estas técnicas permiten el seguimiento a largo plazo de la plasticidad estructural dependiente de la experiencia en RSC.

Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

enfoques Optogenética son ampliamente utilizados para manipular la actividad neuronal y evaluar las consecuencias para la función cerebral. Aquí, una técnica que se describe después de la expresión in vivo del activador óptico canalrodopsina, permite el análisis ex vivo de las propiedades sinápticas de largo alcance específico y conexiones neuronales locales en los circuitos relacionados con el miedo.

Ex Vivo Optogenética Disección de circuitos del miedo en rodajas de cerebro

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo sobre cómo combinar artificial microRNA mediada por ARN de interferencia con optogenetics estimular específicamente botones presinápticos con menor expresión de genes selectivos dentro de circuitos neuronales intactos.

Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas

Este trabajo presenta un método para realizar un optogenetic de una sola unidad grabación fiable desde un ratón despierto utilizando un optrode de cristal a medida.

Optogenetics identificación de un tipo Neuronal con un vidrio Optrode en ratones despiertos

Presentamos un protocolo para evaluar el equilibrio entre la liberación de glutamato y el aclaramiento en sinapsis glutamatérgicas corticostriatales en rodajas agudas de ratones adultos. Este protocolo utiliza el sensor fluorescente iGluu para la detección de glutamato, una cámara sCMOS para la adquisición de señal y un dispositivo para la iluminación láser focal.

Indicadores de sinapsis únicas de liberación y aceptación de glutamato en rebanadas cerebrales agudas de ratones normales y Huntington

Con la manipulación optogenética de poblaciones neuronales específicas o regiones cerebrales, el comportamiento se puede modificar con alta resolución temporal y espacial en animales en movimiento libre. Mediante el uso de diferentes herramientas optogenéticas en combinación con fibras ópticas implantadas crónicamente, se puede realizar una variedad de modulaciones neuronales y pruebas de comportamiento.

Manipulación optogenética de la actividad neuronal para modular el comportamiento en ratones que se mueven libremente

La imagen de calcio microendoscópica in vivo es una herramienta invaluable que permite el monitoreo en tiempo real de las actividades neuronales en animales que se comportan libremente. Sin embargo, aplicar esta técnica a la amígdala ha sido difícil. Este protocolo tiene como objetivo proporcionar una guía útil para atacar con éxito las células de amígdala con un microscopio miniaturizado en ratones.

Imágenes de calcio in vivo exitosas con un microscopio miniaturizado head-mount en la amígdala del ratón que se comporta libremente

Aquí presentamos un protocolo que describe la transducción viral de regiones cerebrales discretas con construcciones optogenéticas para permitir la caracterización electrofisiológica específica de la sinapsis en cortes cerebrales agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogación optogenética de la transmisión sináptica de largo alcance y la plasticidad de la corteza prefrontal medial a la corteza entorrinal lateral

Aprende a combinar optogenética con inmunomarcado de réplicas por fractura-congelación para analizar la densidad de receptores de glutamato en sinapsis de la amígdala de ratón. Este método permite el análisis cuantitativo de proteínas en microdominios pre y postsinápticos identificados.

Combinados Optogenética y congelación-fractura Réplica Immunolabeling para Analizar Arreglo-entrada específica de glutamato receptores en el ratón amígdala (Video) | JoVE Journal

Combinados Optogenética y congelación-fractura Réplica Immunolabeling para Analizar Arreglo-entrada específica de glutamato receptores en el ratón amígdala

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