Combinados Optogenética y congelación-fractura Réplica Immunolabeling para Analizar Arreglo-entrada específica de glutamato receptores en el ratón amígdala

El objetivo de este procedimiento, que combina la optogenética con la técnica de inmunomarcaje de réplica por congelación-fractura, es analizar la densidad de receptores ionotrópicos de glutamato en las sinapsis de la amígdala de ratón con elementos pre y postsinápticos identificados. La alta reproducibilidad y versatilidad de esa técnica de inmunomarcaje de réplica de fractura por congelación, cuando se combina con la optogenética, ofrece un enfoque muy poderoso para el análisis correlacionado de las propiedades estructurales y funcionales de las sinapsis. Las principales ventajas de este procedimiento son: la visión plana de los elementos pre y post sinápticos, y el análisis cuantitativo de las proteínas en estos microdominios especializados.

Se pueden adaptar diferentes técnicas a una variedad de tejidos diferentes para estudiar la distribución y organización de las proteínas integrales de membrana. En general, este enfoque optogenético combinado FRIL es un desafío para los principiantes debido a la gran variedad de aparatos y máquinas diferentes que se requieren. Es fundamental comenzar la modulación con un método diferente, ya que algunos otros pasos son difíciles de aprender.

Por ejemplo, fracturar y replicar especímenes congelados: para comenzar este procedimiento, pegue un bloque coronal de cerebro de ratón en el soporte del vibro-cortador. Oriente el bloque de tejido de modo que el neocórtex mire hacia la cuchilla vibratoria. A continuación, corte las secciones coronales que contienen la amígdala con un grosor de 140 micrómetros en PB frío como el hielo de cero coma un molar. Y recógelos en un plato de seis pocillos en el mismo tampón.

Bajo un microscopio estereoscópico, recorte la región de interés de las rodajas, en una placa de Petri recubierta con elastómero de silicona y rellena con PB molar punto cero. Luego, transfiera el bloque recortado a la solución de crioprotección y manténgalo durante la noche a seis grados centígrados. En este paso, prepare los portadores de cobre para su uso en las etapas sucesivas del procedimiento FRIL, puliéndolos con una lámina de piel de shammy como removedor de deslustre. Bajo el microscopio, coloque un anillo de cinta adhesiva de doble cara en el soporte de cobre, que servirá como pozo de sujeción para el bloque recortado.

Luego, coloque el bloque recortado en el orificio de la cinta adhesiva de doble cara con un lazo de alambre de platino. Retire el exceso de solución crioprotectora con un papel de filtro o un cepillo. Después, cubra el transportador de retención con otro transportador.

De modo que el bloque de tejido se intercala entre los dos portadores. Para congelar la muestra, inserte el sándwich portador en el soporte de la muestra. A continuación, inserte el portamuestras en la unidad de congelación a alta presión.

Inicie el ciclo de congelación presionando el botón jet-auto, retire el portamuestras inmediatamente y sumerja la punta en una caja aislada con nitrógeno líquido. A continuación, retire con cuidado el sándwich portador del portamuestras y colóquelo en un criovial preenfriado. Almacene los crioviales que contienen los portadores en un tanque criogénico hasta la replicación.

Antes de insertar el cañón de haz de electrones, retire el escudo con la placa deflectora. Coloque el calibre de ajuste, para centrar el filamento, en el mandril de pinza a través de la cubierta inferior del cátodo. A continuación, deslice el nuevo filamento sobre el manómetro, hasta que las láminas de presión sujeten los extremos del filamento.

Luego, retire el medidor de ajuste e inserte la varilla de carbono. Fíjelo, apretando el mandril de la pinza del soporte de la varilla del evaporador. Asegurándose de que la altura del extremo de la varilla esté en el medio de la segunda bobina desde la parte inferior.

Después de eso, reemplace la placa deflectora e inserte la pistola de haz de electrones en la unidad de fractura por congelación. En este procedimiento, ajuste la corriente y el voltaje para la evaporación. A continuación, inserte el sándwich portador congelado en la mesa de doble réplica en nitrógeno líquido.

A continuación, transfiera la mesa de doble réplica al recipiente Dewar y fíjela al receptor de la etapa de muestra en un ángulo de 45 grados. Tome la tabla de doble réplica con un manipulador de tablas. Insértelo en la unidad de congelación-fractura en la etapa fría y espere aproximadamente 20 minutos para permitir que la temperatura de la mesa de doble réplica se ajuste a menos 115 grados Celsius.

Después, fractura el tejido girando manualmente la rueda en sentido contrario a las agujas del reloj, que está conectada a la cubierta por encima de la mesa de doble réplica. Cuando la cubierta gira, obliga a la mesa de doble réplica a abrirse, lo que resulta en la fractura del tejido. Se aplica una capa de carbono desde un ángulo de 90 grados a las caras fracturadas.

Posteriormente, retire los especímenes replicados de la mesa de doble réplica y transfiéralos a una placa cerámica de 12 pocillos llena de TBS. Con un alambrón de platino, retire el tejido replicado del portamuestras. Para la digestión del SDS, transfiera una réplica a un frasco de vidrio de cuatro mililitros lleno con un mililitro de tampón de digestión SDS.

Deje que se digiera durante 18 horas a 80 grados centígrados agitando. Para el inmunomarcaje, lave la réplica durante 10 minutos con tampón de digestión SDS fresco. Luego, incubarlo con anticuerpos primarios y secundarios, diluidos en 2%BSA-TBS, en una cámara húmeda a 15 grados centígrados durante 24 a 72 horas.

Después de eso, monte la réplica en una cuadrícula de barras paralelas de 100 líneas con recubrimiento de forma lejana. Imagina la réplica con un microscopio electrónico de transmisión a 80 o 100 kilovoltios. Luego, adquiera las imágenes digitales a través de una cámara CCD.

Cuando esté sin conexión, busque las regiones correspondientes en la imagen de la réplica, utilizando diferentes puntos de referencia. Cuatro semanas después de la inyección de AAV, para expresar la canalrodopsina-2 en el grupo nuclear talámico posterior, la canalrodopsina-2 se transporta efectivamente anterógradamente a lo largo de los axones talámicos para llegar a las masas celulares intercaladas de la amígdala. La especialización postsináptica de las sinapsis glutamatérgicas se puede reconocer en una réplica como un grupo de partículas intramembrana en la cara E de la membrana plasmática, y a menudo se acompaña de la cara P de su elemento presináptico.

Aquí, se visualizaron los receptores de canalrodopsina-2 y glutamato utilizando partículas de oro de diferentes tamaños conjugadas con los anticuerpos secundarios. Debido a la falta de herramientas estructurales o moleculares para detectar en una misma réplica si la membrana postsináptica pertenecía a las neuronas intercaladas. La réplica correspondiente fue marcada para receptores opioides mu, un marcador de estas neuronas.

Como ejemplo del análisis cuantitativo de la densidad de receptores de glutamato en estas sinapsis, aquí están los diagramas de dispersión del número de partículas de oro para los receptores ampa frente al área sináptica en las espinas y dendritas. Los cuales revelan una correlación positiva en ambas estructuras. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los pasos individuales son altamente interdependientes.

Por lo tanto, un error en uno de los pasos puede poner en peligro todo el procedimiento. La visualización de una gran parte de las especializaciones de la membrana plasmática en una superficie bidimensional de la réplica permite la inspección de la distribución espacial y la continuidad física de las moléculas de interés sin la laboriosa y lenta reconstrucción de las secciones de artrofinas en serie. Este enfoque puede ser utilizado por otros investigadores para obtener información sobre las relaciones estructura-función de sinapsis específicas en circuitos neuronales.

Donde se está desentrañando el origen de las entradas y la naturaleza de los elementos postsinápticos. Es crucial, pero problemático.