Un Tejido Combinada 3D Diseñado In Vitro / In silico Modelo de tumor de pulmón para la predicción de la eficacia de drogas en Fondos Específicos mutacional

Los objetivos generales de este modelo combinado de cáncer de pulmón in vitro/in silico son estudiar la sensibilidad de las terapias dirigidas al cáncer de pulmón de células no pequeñas y predecir la eficacia de nuevas sustancias. Este sistema de modelos 3D permite el seguimiento de las respuestas específicas de las células a tratamientos dirigidos o combinaciones directas. La principal ventaja de esta técnica es que las predicciones in silico pueden facilitar las pruebas preclínicas de fármacos en un entorno más fisiológico relevante.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de diferentes entidades tumorales, ya que se puede utilizar para optimizar las predicciones de respuesta a fármacos en función de antecedentes mutacionales específicos. La demostración del procedimiento estará a cargo de Franziska Schmitt, asistente de investigación, de nuestro laboratorio. Para establecer un cultivo dinámico, comience por cultivar el modelo tumoral en condiciones de cultivo estático, en una corona celular a 37 grados Celsius y 5% de CO2, en una incubadora convencional.

Después de tres días, ensamble un biorreactor esterilizado en autoclave e inserte un andamio biológico de intestino delgado más mucosa sembrado en el sistema. A continuación, agregue 45 mililitros de RPMI, complementados con la cantidad adecuada de FCS a un matraz y conecte el dispositivo de muestreo sin aguja al sistema de tubos entre el biorreactor y el matraz de medio. Coloque el biorreactor en la incubadora y conéctelo a la bomba para cultivar el modelo tumoral, durante 14 días adicionales, con un flujo medio constante de tres mililitros por minuto.

Para tratar un modelo de tumor estático con Gefitinib, en el día 11 de cultivo en la incubadora convencional, primero se utiliza una pipeta pasteur para eliminar el medio antiguo de los pocillos. A continuación, añada un mililitro de RPMI recién preparado, suplementado con FCS y Gefitinib, en el interior de cada corona celular y 1,5 mililitros en el fondo de cada pocillo. Para recolectar las muestras de Elisa de un cultivo dinámico, en los días 11 a 14 de cultivo, conecte la jeringa al dispositivo de muestreo y retire un mililitro de medio del sistema de biorreactor.

A continuación, almacene las muestras a menos 80 grados centígrados hasta que se realice la Elisa. Para determinar el número de núcleos positivos para Ki67, primero use un microscopio invertido para obtener cinco imágenes fluorescentes de tinción DAPI y cinco Ki67 de cultivos 2D con un aumento de 20 veces de cada condición, a partir de secciones no superpuestas de la muestra. Para contar manualmente los núcleos positivos de Ki67, abra la imagen emergida en Fiji y seleccione, Complementos y Contador de celdas, luego, haga clic en inicializar, seleccione un tipo de contador y haga clic en cada núcleo positivo de Ki67.

El número de celdas en las que se ha hecho clic aparecerá junto al tipo de contador seleccionado. Para el recuento automático de células del número total de núcleos en las imágenes 2D, inicie la grabadora de macros, abra una imagen DAPI y haga clic en imagen, escriba y 8 bits, luego haga clic en mejorar contraste y establezca el parámetro saturado en uno y normalice. Para enfocar la imagen, defina la máscara de enfoque, utilizando un radio de uno y una máscara de 60.

Para vincular la imagen, haga clic en umbral automático y elija el método Reny/Entropy con objetos blancos sobre fondo negro. A continuación, haga clic en Plugins, seguido de BioVoxxel, y en la característica irregular de la cuenca hidrográfica, con un radio de erosión de cinco para separar las celdas. Haga clic en analizar, analizar partículas y establecer el tamaño en 02 infinito y comprobar resumir.

El número de celdas se mostrará en la tabla de resumen como recuentos. A continuación, haga clic en crear para guardar la macro y permitir el recuento automático de núcleos, en otras imágenes de cultivo celular en 2D. Después de usar las bases de datos conocidas para generar una red de tumores, abra el software de análisis de redes adecuado, haga clic en archivo y nuevo, e ingrese los modelos de tumores de Jove.

Haga clic en ok, para generar una nueva red, luego haga clic en primer plano cuadrado norte y ok, para visualizar el receptor en una membrana doble. Para visualizar los nodos como rectángulos, haga clic en proteína genérica, luego en EGFR y, Ok.To luego en etiquetar los nodos en la red, haga clic con el botón derecho para cambiar el color y la forma, y establezca los códigos de color de los nodos como se indica. Para visualizar los parámetros de lectura como hexágonos, seleccione, fenotipo, escriba proliferación y haga clic en Aceptar.

A continuación, haga clic con el botón derecho y seleccione cambiar color y forma de nuevo para establecer el código de color en 255, 204, 204. Para visualizar los bordes de las interacciones de los nodos, haga clic en Transición de estado para las flechas de activación e Inhibición para las flechas de inhibición embotadas. A continuación, haga clic en archivo y guardar como, y guarde la red de señalización generada, como jove tumor models.xml.

Para el análisis en estado estacionario del equilibrio del sistema, abra el software SQUAD, haga clic en cargar red y cargue el archivo de models. xml de jove tumor. Haga clic y ejecute el análisis.

Para escribir un protocolo de simulación, haga clic en avanzado y pertubador y, a continuación, haga clic en editar protocolo para simular la resistencia anit-EGFR. A continuación, haga clic en pertubación y seleccione el estado inicial estándar igual al estado estacionario cuatro. Haga clic en Agregar para agregar el nuevo pulso constante y, a continuación, seleccione el parámetro de estado y establezca el objetivo en VOLTEAR, el tiempo en cero y el valor en 4.

Haga clic en Aceptar y establezca los estados para c-MET y Gefitinib, de la misma manera. Para establecer un valor de estado en el nodo EGFR activo, haga clic en nodo activo y, a continuación, haga clic en editar. Establezca el estado en 8 y haga clic en Aceptar.

Haga clic en Aceptar para guardar el protocolo. Para mostrar las curvas específicas, en el panel de opciones, seleccione EGF-EGFR, estrella EGF-EGFR, estrella Mek, caspasas, PI3K, Gegitinib, apoptosis, proliferación, inhibidor de MEk e inhibidor de PI3K. A continuación, haga clic en inicializar y ejecutar para iniciar una simulación completa de la respuesta del sistema.

Para simular un tratamiento combinado con inhibidores de PI3K y Mek, haga clic en editar protocolo. A continuación, utilizando el mismo parámetro de nodo que se acaba de demostrar, haga clic en pertubación, seguido de agregar, para agregar un nuevo pulso constante. A continuación, seleccione un parámetro de estado y establezca el destino en el inhibidor PI3K, el tiempo en cero y el valor en uno, y haga clic en Aceptar.

Haga clic en agregar, nuevamente, para agregar otro nuevo pulso constante y, en el parámetro state, establezca el objetivo en Inhibidor de Mek, establezca el tiempo en cero y el valor en uno, y haga clic en Aceptar, seguido de Ok nuevamente, para guardar el protocolo. En el panel de opciones, utilizando los mismos nodos para la representación gráfica que se acaban de demostrar, haga clic en inicializar y ejecute para iniciar una simulación completa de la respuesta del sistema. A continuación, para finalizar la simulación, haga clic en restablecer.

Este sistema de prueba de tumores en 3D, facilita la determinación del índice de proliferación. Y la cuantificación de la apoptosis mediante M30 Elisa. En este experimento representativo, por ejemplo, solo las células tumorales HCC827 mutadas en EGFR, incubadas en condiciones de cultivo estáticas, respondieron a la inhibición del factor de crecimiento epidérmico.

Por el inhibidor de la tirosina cinasa, Gefitinib, como lo demuestra el aumento de la apoptosis observado en el sistema modelo tumoral HCC827. Aquí se muestran imágenes representativas de modelos tumorales estáticos en 3D, con o sin inductor de transición epitelio-mesenquimatoso, simulación de TGF-beta-1. Obsérvese el aumento de la expresión de vimentina en los cultivos de células tumorales tratadas.

En condiciones dinámicas, Gefitinib ejerce un efecto robusto sobre las células HCC827 mutadas en EGFR, como lo demuestra la disminución de las estructuras similares a los tejidos, en presencia del inhibidor de la tirosina quinasa, en comparación con el cultivo controlado no tratado. En este gráfico, se observa la simulación de la unidad conocida en la mutación, la coactivación de EGFR y c-MET, y el aumento de la tasa de proliferación, y una disminución de la tasa de apoptosis en las células HCC827, a lo largo del tiempo, lo que refleja una resistencia inducida por Gefitinib que se correlaciona con la activación de MEK y PI3K. De hecho, el modelado de los inhibidores combinados de PI3K y MEK da como resultado una reversión del efecto de resistencia anti-EGFR, una reducción de la proliferación y la inducción de la apoptosis.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como Western Blot o para investigar las vías de señalización posteriores. Además, los sistemas de cocultivo con diferentes tipos de células también se pueden utilizar para analizar la diafonía entre varias células en el microambiente tumoral. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo del desarrollo de fármacos exploren la eficacia de los fármacos in Silico.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo predecir la eficacia del medicamento en grupos de pacientes estratificados, simulando cambios en la señalización y analizando las respuestas del sistema resultantes en diferentes mutaciones y antecedentes.