Name: Asistida por láser microdisección (LAM) como herramienta para la transcripción de perfiles de distintos tipos de células (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprende microdisección asistida por láser para aislar células germinales femeninas de Boechera y obtener ARN de alta integridad. Este método permite analizar perfiles transcripcionales específicos de tipos celulares raros en plantas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos a Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) por proporcionar semillas de Boechera divaricarpa y a Sharon Kessler (Universidad de Oklahoma) por la lectura crítica y la corrección. El trabajo en el análisis de transcriptomas específicos de tipo celular para estudiar el desarrollo de gametofitos y apomixis en el laboratorio de UG cuenta con el apoyo de la Universidad de Zúrich, una beca de la "Deutsche Forschungsgemeinschaft" y el proyecto Marie Curie IDEAGENA a AS, subvenciones de la "Staatssekretariat für Bildung und Forschung" en el marco de la acción COST FA0903 (a UG y AS) y la Fundación Nacional Suiza (a UG).

<ol><li>Maheshwari, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaheshwari%2C+P+%22An+Introduction+to+the+Embryology+of+Angiosperms%22">An Introduction to the Embryology of Angiosperms</a>. , McGraw-Hill. New York. (1950).</li>
<li>Willemse, M. T. M., Van Went, J. L. The female gametophyte. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWillemse%2C+MTM+%22Embryology+of+Angiosperms%22">Embryology of Angiosperms</a>. Johri, B. M. , Springer-Verlag. Berlin. 159-196 (1984).</li>
<li>Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apomixis%3A+Molecular+strategies+for+the+generation+of+genetically+identical+seeds+without+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization.</a> Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).</li>
<li>Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apomixis+-+the+asexual+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Apomixis - the asexual revolution.</a> Science. 274, 1322-1323 (1996).</li>
<li>Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+future+for+apomixis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A bright future for apomixis.</a> Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).</li>
<li>Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+germline+formation%3A+molecular+insights+define+common+concepts+and+illustrate+developmental+flexibility+in+apomictic+and+sexual+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction.</a> Development. 142, 229-241 (2015).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apomictic+and+sexual+germline+development+differ+with+respect+to+cell+cycle%2C+transcriptional%2C+hormonal+and+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+GENET%22%5BJournal%5D)">Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation.</a> PLOS GENET. 10, e1004476(2014).</li>
<li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarging+cells+initiating+apomixis+in+Hieractium+praealtum+transition+to+an+embryo+sac+program+prior+to+entering+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis.</a> Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).</li>
<li>Wuest, S. E., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+microdissection+applied+to+floral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted microdissection applied to floral tissues.</a> Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).</li>
<li>Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+expression+profiling+of+rare+cell+types+as+exemplified+by+its+impact+on+our+understanding+of+female+gametophyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development.</a> Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).</li>
<li>Wuest, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+female+gametophyte+gene+expression+map+reveals+similarities+between+plant+and+animal+gametes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes.</a> Curr Biol. 20, 1-7 (2010).</li>
<li>Cai, S., Lashbrook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+plant+cells+from+tape-transferred+paraffin+sections+promotes+recovery+of+structurally+intact+RNA+for+global+gene+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling.</a> Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).</li>
<li>Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germ+line+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+BIOL%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development.</a> PLOS BIOL. 9, e1001155(2011).</li>
<li>Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes%3A+laser-assisted+microdissection+and+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing.</a> PLOS ONE. 7, e29685(2012).</li>
<li>Mau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+apomicts+trapped+in+the+ecological+niches+of+their+sexual+ancestors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci.U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors.</a> Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).</li>
<li>Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variation+in+transcriptionally+active+regions+of+sexual+and+apomictic+Boechera.+demonstrates+independently+derived+apomictic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages.</a> Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).</li>
<li>Corral, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+apomixis-specific+polymorphism+is+correlated+with+exclusive+exonuclease+expression+in+premeiotic+ovules+of+apomictic+boechera+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species.</a> Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).</li>
<li>Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Arabidopsis+thaliana.+phloem+RNAs+provides+a+search+criterion+for+phloem-based+transcripts+hidden+in+complex+datasets+of+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments.</a> Plant J. 55, 746-775 (2008).</li>
<li>Schmid, M. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Genome+Scale+Quantitative+Biology+in+Arabidopsis+thaliana%22">Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana</a>. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El Protocolo es adecuado para diferentes tipos de células y de tejidos LAM combinado con análisis del transcriptoma mediante microarrays o ARN-Sec es una valiosa herramienta para obtener información sobre los patrones específicos de actividad de los genes que regulan los procesos de desarrollo o fisiológicas 7-11,13,14. Sin embargo, la idoneidad de este método para cualquier tipo de célula dada depende críticamente de las cuestiones estructurales. La célula tiene ...

En transcripcional estudios realizados a nivel tisular, la transcriptomes de tipos de células altamente especializadas, pero raras son a menudo enmascarados por las células circundantes más abundantes. Un ejemplo de tales tipos de células altamente especializadas son las células del linaje reproductivo femenino (línea germinal) en las plantas. La línea germinal femenina se especifica dentro de óvulos en desarrollo, los precursores de las semillas en el interior del gineceo del 1,2 flor. La célula madre megaspora (MMC) es la primera célula de la línea germinal femenina. Se somete a la meiosis para formar una tétrada de megaesporas reducidos. Típicamente, sólo uno de estos megasporas sobrevive y divide mitóticamente sin citocinesis, es decir, en un sincitio. Estos son seguidos por mitosis cellularization para formar el gametofito maduro, que normalmente consiste en cuatro tipos de células: tres antípodas, dos células synergid, el huevo, y la célula central. Los óvulos y centrales son los gametos femeninos que consiguen fertilizados por dos espermatozoides durante Doula fertilización ble para dar lugar al embrión y el endospermo de la semilla en desarrollo 1,2. En el sistema modelo Arabidopsis thaliana sexual, sólo ~ 50 semillas se desarrollan por flor, mientras que alrededor de 50 - 80 semillas por flor se desarrollan en el género estrechamente relacionado Boechera. Por lo tanto, la línea germinal femenina consta de sólo unos pocos tipos de células altamente especializadas, por lo que es un excelente modelo para estudiar los procesos de desarrollo, tales como la especificación y diferenciación celular. Por otra parte, una visión de los procesos de regulación de genes que regulan la reproducción de plantas pueden ser de valor aplicada. En las plantas, puede ocurrir tanto en la reproducción sexual y asexual a través de semillas (apomixis). Mientras que la reproducción sexual genera diversidad genética en una población, la apomixis conduce a la formación de la progenie clonal que es genéticamente idéntico a la planta madre. Por lo tanto, la apomixis tiene un gran potencial para aplicaciones en la agricultura y la producción de semillas, como los genotipos maternos incluso complejos puedenmantenerse inalterada durante varias generaciones 3,4,5. Debido a que la apomixis no se produce de forma natural en cualquier especie vegetal importante, la ingeniería de la apomixis en los cultivos es de gran interés 3,4,5. Sin embargo, este objetivo a largo plazo es difícil de lograr debido a que la base genética y molecular subyacente de la apomixis no se entiende con el suficiente detalle 6. Para hacerse una idea de la base de la transcripción que regulan la reproducción apomictic, específica del tipo celular transcripcional de perfiles mediante microdisección asistida por láser (LAM) y la secuenciación de próxima generación (NGS) representa un enfoque muy potente 7,8. LAM primera se ha establecido para los animales y la investigación biomédica. En los últimos años LAM también se ha aplicado a la biología vegetal 6,9,10. En contraste con otros métodos que permiten perfiles de tipos de células y tejidos individuales, LAM no requiere la generación de líneas de marcador 6,9,10. Por lo tanto, puede ser la aplicaciónmentido a cualquier tipo de célula o tejido sin conocimiento previo molecular. Otra ventaja de LAM es que se puede aplicar a cualquier tipo de célula, siempre que la célula se puede reconocer en las secciones secas basada en la posición y / o características estructurales. LAM tiene la ventaja adicional de que se utilizan tejidos fijados, lo que impide cambios del perfil transcripcional durante el procesamiento. El tejido de interés, por ejemplo, tejido floral, se fija en un fijador no reticulante antes de la incrustación en cera de parafina. Incrustación en cera de parafina se puede hacer manualmente, siguiendo los protocolos establecidos 9,11. Sin embargo, el uso de un procesador de tejido automatizado para la deshidratación y la infiltración con la cera generalmente da como resultado una mayor reproducibilidad en términos de la conservación de la calidad del ARN y la morfología del tejido. La estrategia alternativa de la incrustación de tejidos en resina también se ha utilizado con éxito para el análisis de tipos específicos de células por LAM 8. Sin embargo, el uso de un automprocesador de tejidos ado para incrustar en cera es muy eficiente en el tiempo, ya que muchas muestras se pueden procesar a la vez que requiere un mínimo de manos a tiempo. Aunque normalmente no hay pérdida significativa de la calidad del ARN se produce durante la fijación y la incrustación, la preparación de secciones delgadas con el microtomo y, en particular, el montaje en los frameslides utilizados para LAM sigue siendo un paso crítico para la conservación de la calidad del ARN. Esta ha sido previamente señalado y el uso de un sistema de transferencia de la cinta se ha descrito para dar lugar a una mejor calidad de RNA en este paso 12. Sin embargo, esto añade una etapa que consume tiempo adicional durante la preparación de los portaobjetos y también requiere un equipo especial. El protocolo optimizado se describe a continuación de forma reproducible produce ARN que es de calidad suficiente para el perfil transcripcional con GeneChips y Next Generation Sequencing (NGS) se acerca 7,11,13,14. Además, con el microscopio de microdisección láser utilizado, una alta pureza de los tipos de células aisladas es goleadainely produjo 7,11,13,14. El género Boechera es un excelente sistema modelo para el estudio de los pasos clave de la reproducción apomictic. En Boechera, una variedad de diferentes adhesiones sexuales y apomícticas han sido identificados y se puede utilizar para los análisis comparativos 15,16,17. En una comparación de transcriptomes tipo de células específicas de las células de la línea germinal femenina de Arabidopsis sexual y apomictic Boechera, hemos identificado los genes y las vías que son expresados ​​diferencialmente, identificando de este modo nuevos aspectos de los procesos de regulación que rige la apomixis 7. Además, este estudio verificó la idoneidad de LAM para la célula de la transcripción de tipo análisis específicos de tipos de células pequeñas y raras. Ya hemos utilizado este protocolo para el análisis de los diferentes tipos de células en una variedad de especies de plantas, pero en las especies y las modificaciones específicas de tejido en el protocolo pueden ser necesarios en algunos casos.

<table><tbody><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>1.009.861.000</td><td>absoluto EMPROVE Ph Eur,BP,USP</td></tr><tr><td>15 ml tubos de centrífuga falcon</td><td>VWR</td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalizador</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100% Grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Ambion Tecnologías de vida de agua libre de nucleasa</td><td></td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr>Procesador de tejidos <td>ASP200 S</td><td>Leica</td><td>14048043624</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>el cartón</td><td></td><td></td> negro <td>se puede comprar en papelerías especiales</td></tr><tr><td>Portaobjetos de marco sin ADN y ARNasa</td><td>Micro Dissect GmbH</td><td></td><td>1, 4 y micro; m Membrana PET; también se puede comprar en Leica</td></tr><tr><td>Dumond Forceps</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr>, <tr><td>lámpara</td><td></td><td></td><td></td>de etanol</tr><tr><td>exsiccator</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>Z354074-1EA,</td><td>Nalgene Vaccuum Dessicator o equipos similares</td></tr><tr><td>, puntas de filtro 10&nbsp; y micro; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60010</td><td>puede ser reemplazado por puntas de filtro similares</td></tr><tr><td>1,000&nbsp; y micro; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60010</td><td>puede ser reemplazado por puntas de</td></tr><tr><td>filtro similares 20&nbsp; y micro; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60020</td><td>puede ser reemplazado por puntas de filtro similares</td></tr><tr><td>200&nbsp; y micro; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60200</td><td>puede ser reemplazado por puntas similares</td></tr><tr><td>pinzas de precisión</td><td>VWE</td><td>232-1221</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos</td><td>de vidrio Huber & Co.AG</td><td>10.0540.01</td><td>F&auml; rbek&auml; sten nach Hellendahl</td></tr><tr><td>vidriera a través de</td><td>Huber & Co.AG</td><td>10.0570.01</td><td>F&auml; rbekasten</td></tr><tr><td>Módulo de incrustación de parafina calentada Leica Leica</td><td>Leica</td><td>EG 1150</td><td>H estación de bloqueo, dispositivos similares son adecuados</td></tr><tr><td>Mesa de calentamiento y secado</td><td>Medax</td><td>15501</td><td>otros modelos y/o proveedores son adecuados</td></tr><tr><td>cubitera</td><td>cubo de hielo VWR con tapa&nbsp;</td><td>10146-184</td><td>cubos similares igualmente adecuados mesa de</td></tr><tr><td>luz</td><td>UVP An Analytical Jena Company</td><td>TW-26&nbsp;</td><td>Transluminador de luz blanca</td></tr><tr><td>portaobjetos para microscopio</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td><td>Bordes cortados</td></tr><tr><td>cuchilla de micrótomo</td><td>Thermo Scientific</td><td>FEAHS35</td><td>S35 hoja de micrótomo desechable</td></tr><tr><td>Instrumento MMI Cell Cut Plus MMI</td><td>(Molecular Machines and Industries)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiadherente, sin ARNasa Tubos de microfuga, 2 ml</td><td>Life Technologies</td><td>AM12475</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast X-TRA</td><td>Roth</td><td>X882.2</td><td>para histología</td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de ARN PicoPure</td><td>tecnologías de la vida</td><td>KIT0204</td><td>Arcturus Kit de aislamiento de ARN PicoPure</td></tr><tr><td>bandejas de equilibrado de plástico</td><td>Semadeni AG</td><td>2513</td><td></td></tr><tr><td>caja de plástico</td><td>Semadeni AG</td><td>2971</td><td>Plastikdose PS</td></tr><tr><td>tapa de plástico para placa</td><td></td><td></td> calefactora <td></td></tr><tr><td>aguja de preparación</td> casera <td>VWR</td><td>631-7159</td><td></td></tr><tr><td>ARN 6000 Pico Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microfuga libres de ARNasa tecnologías</td> de <td>vida</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Solución de descontaminación de ARNasa ZAP tecnologías</td><td>de vida</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo rotativo semiautomatizado&nbsp;</td>Los dispositivos similares <td>Leica</td><td>RM2245</td><td>son igualmente adecuados</td></tr><tr><td>Tissue Loc Histo Screen Cassettes</td><td>Thermo Scientific</td><td>C-1000_AQ</td><td>casetes similares de otros proveedores son adecuados</td></tr><tr><td>Tubos con tapa adhesiva, sin difusor 500 &; l&nbsp;</td><td>MMI (Máquinas e Industrias Moleculares)</td><td>50204</td><td></td></tr><tr><td>Xilol (Isomere) ROTIPURAN</td><td>VWR</td><td>4436.2</td><td>min. 99%, p.a., ACS, ISO SP</td></tr><tr><td>proceso de incrustación de casetes</td><td>Leica 14039440000</td><td></td><td>Leica Jet Cassette I sin tapa</td></tr><tr><td>Horno universal</td><td>Memmert</td><td>UF55</td><td>otros modelos y/o proveedores son adecuados</td></tr></tbody></table>

asistida por láser microdisección (lam) como herramienta para la transcripción de perfiles de distintos tipos de células

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

La comprensión de los procesos de desarrollo a nivel molecular requiere conocimientos sobre la regulación transcripcional y, por lo tanto, el transcriptoma, a nivel de los tipos de células individuales. Si bien los métodos descritos aquí son generalmente aplicables a una amplia gama de especies y tipos de células, nuestra investigación se centra en la reproducción de plantas. El cultivo de plantas y la producción de semillas son de crucial importancia para la nutrición humana y animal. Una comprensión detallada de las redes reguladoras que gobiernan la formación del linaje reproductivo (línea germinal) y, en última instancia, de las semillas es una condición previa para la manipulación dirigida de la reproducción de las plantas. En particular, la ingeniería de la apomixis (reproducción asexual a través de semillas) en plantas de cultivo promete grandes mejoras, ya que conduce a la formación de semillas clonales que son genéticamente idénticas a la planta madre. En consecuencia, los tipos de células de la línea germinal femenina son de gran importancia para la comprensión y la ingeniería de la apomixis. Sin embargo, como las células correspondientes están profundamente incrustadas dentro de los tejidos florales, es muy difícil acceder a ellas para los análisis experimentales, incluida la transcriptómica específica del tipo de célula. Para superar esta limitación, se pueden aislar secciones de células individuales mediante microdisección asistida por láser (LAM). Si bien la LAM en combinación con el perfil transcripcional permite la identificación de genes y vías activas en cualquier tipo de célula con alta especificidad, establecer un protocolo adecuado puede ser un desafío. Específicamente, la calidad del ARN obtenido después de LAM puede verse comprometida, especialmente cuando se dirigen a células pequeñas y únicas. Para eludir este problema, hemos establecido un flujo de trabajo para LAM que da como resultado de manera reproducible una alta calidad de ARN que es muy adecuada para la transcriptómica, como se ejemplifica aquí con el aislamiento de células de la línea germinal femenina en Boechera apomíctica. En este protocolo, se describen los procedimientos para la preparación de tejidos y LAM, también en lo que respecta a la extracción de ARN y el control de calidad.

Preparación de la muestra y LAM se realizan en pasos consecutivos Es necesaria una serie de pasos consecutivos para preparar ARN para el análisis de la transcripción de determinados tipos de células por LAM (Figura 1). Esto comienza con la recolección de las flores y fijación inmediata para asegurar que la población de ARN se mantiene sin cambios después de la cosecha. El tejido está incrustad...

Aquí presentamos un protocolo para la microdisección asistida por láser de tipos específicos de células vegetales para el perfil transcripcional. Si bien el protocolo es adecuado para diferentes especies y tipos de células, la atención se centra en células altamente inaccesibles de la línea germinal femenina importantes para la reproducción sexual y apomíctica en el género de crucíferas Boechera.

Asistida por láser microdisección (LAM) como herramienta para la transcripción de perfiles de distintos tipos de células

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

El objetivo general de este protocolo para LAM es aislar células vegetales específicas para la obtención de ARN de alta integridad destinado al análisis transcripcional. Se centra en células de difícil acceso, como las células ovulares, en especies sexuales y apomícticas de Boechera. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genética del desarrollo vegetal, tales como la base transcripcional que subyace a la reproducción sexual y asexual de las plantas mediante semillas.La principal ventaja de esta técnica es que se pueden realizar ciertos estilos específicos. Superando el efecto de enmascaramiento de las transcripciones de tipos celulares raros en el análisis de tejidos de aterogénesis. Para comenzar este procedimiento, utilizando la estación de bloqueo, llene una bandeja plástica de equilibrio precalentada y nueva con parafina fundida a 56 grados Celsius.Levante la tapa del baño de parafina y tome un casete a la vez. Transfiera una muestra a la parafina líquida a 56 grados Celsius en una bandeja de equilibrio. Proceda rápidamente para evitar que la parafina se endurezca alrededor de la muestra mientras manipula el casete.A continuación, coloque la mue

laser-assisted-microdissection-lam-as-tool-for-transcriptional

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Láser microdisección de captura de tejidos de mamíferos

Microdisección láser se aplicó para analizar perfiles de expresión génica en compartimentos específicos de Drosophila disco ala sometida a localizado...

Microdisección láser aplicada a perfiles de expresión génica de subconjunto de las células de la Drosophila Ala Disco

Se describe cómo utilizar la microdisección de captura por láser (LCM) para obtener poblaciones enriquecidas de las neuronas del hipocampo o neuronas individuales de las secciones congeladas del cerebro de rata lesionado para el posterior análisis de expresión génica usando PCR en tiempo real cuantitativa y / o microarrays de todo el genoma.

Captura de microdisección láser poblaciones enriquecidas de neuronas o neuronas individuales para análisis de expresión génica después de una lesión cerebral traumática

El aislamiento de las neuronas de dopamina individuales o el área tegmental ventral con inmunohistoquímica directa o indirecta se demuestra utilizando láser captura microdissection. Se discuten los parámetros para el aislamiento de tejido de un portaobjetos de vidrio usando un láser de infrarrojos y a partir de diapositivas membrana utilizando la combinación de un láser infrarrojo y ultravioleta.

Microdisección de captura por láser - Una demostración del aislamiento individual de dopamina neuronas y el Área ventral tegmental completo

El objetivo de este protocolo es utilizar la microdisección de captura láser como un método eficaz para aislar poblaciones puras de tipos celulares de tejidos prostáticos heterogéneos para el análisis de ARN posterior.

Laser-captura microdisección de Human Prostática epitelio de Análisis de ARN

Muchos genes importantes para el desarrollo tienen patrones de expresión específicos de células o tejidos. En este artículo se describen experimentos de LM RNA-seq para identificar genes que se expresan diferencialmente en el límite de la hoja y la vaina del maíz y en mutantes lg1-R en comparación con el tipo salvaje. Las consideraciones experimentales discutidas aquí se aplican a los análisis transcriptómicos de otros fenómenos del desarrollo.

Diseño experimental para microdisección láser RNA-Seq: Lecciones de un análisis del desarrollo de la hoja de maíz

La microdisección láser (LMD) es una técnica sensible y altamente reproducible que se puede utilizar para descubrir vías que median la heterogeneidad e invasión del glioma. Aquí, describimos un protocolo optimizado para aislar áreas discretas del tejido glioma usando LMD láser seguido de análisis transcriptomático.

Microdisección de captura láser de las subregiones de Glioma para la caracterización espacial y molecular de la heterogeneidad intratumoral, los oncostreams y la invasión

Aquí se presenta un protocolo para la microdisección de captura láser (LCM) de tejidos vegetales. LCM es una técnica microscópica para aislar áreas de tejido de una manera libre de contaminación. El procedimiento incluye fijación de tejido, incrustación de parafina, seccionamiento, LCM y extracción de ARN. El ARN se utiliza en el análisis de transcriptomas de transcriptomas específicos del tejido aguas abajo y resueltos temporalmente.

Secuenciación de ARN-Secuenciación de ARN-Captura láser para Análisis de Expresión Genética Espacial y Temporal Específica de Tejidos en Plantas

Se describe un protocolo que utiliza la microdisección láser para aislar tejidos de nematodos individuales para la secuenciación de ARN. El protocolo no requiere kits de herramientas genéticas específicas de la especie, lo que permite comparar los perfiles de expresión génica entre diferentes especies a nivel de muestras de un solo tejido.

Microdisección láser para aplicaciones de un solo tejido independientes de la especie

La microdisección por captura láser de tejidos de fibrosis submucosa oral permite la extracción precisa de células de regiones histológicas de interés para el análisis de datos multiómicos con información morfológica y espacial.

Aislamiento de Células con Información Morfológica y Espacial a partir de Muestras de Fibrosis Submucosa Oral mediante Microdisección por Captura Láser

Este protocolo describe un método para aislar ARN de regiones histológicas definidas de tejido hepático de ratón incrustado en compuesto de paraformaldehído y compuesto de Temperatura Óptima de Corte mediante microdissección por captura láser, permitiendo un análisis dirigido de expresión génica posterior.

Microdisección por captura láser de tejido hepático de ratón fijado con paraformaldehído para análisis de ARN

Aprende microdisección asistida por láser para aislar células germinales femeninas de Boechera y obtener ARN de alta integridad. Este método permite analizar perfiles transcripcionales específicos de tipos celulares raros en plantas.

Asistida por láser microdisección (LAM) como herramienta para la transcripción de perfiles de distintos tipos de células

Explorar más videos