Asistida por láser microdisección (LAM) como herramienta para la transcripción de perfiles de distintos tipos de células

El objetivo general de este protocolo para LAM es aislar células vegetales específicas para la obtención de ARN de alta integridad destinado al análisis transcripcional. Se centra en células de difícil acceso, como las células ovulares, en especies sexuales y apomícticas de Boechera. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genética del desarrollo vegetal, tales como la base transcripcional que subyace a la reproducción sexual y asexual de las plantas mediante semillas.

La principal ventaja de esta técnica es que se pueden realizar ciertos estilos específicos. Superando el efecto de enmascaramiento de las transcripciones de tipos celulares raros en el análisis de tejidos de aterogénesis. Para comenzar este procedimiento, utilizando la estación de bloqueo, llene una bandeja plástica de equilibrio precalentada y nueva con parafina fundida a 56 grados Celsius.

Levante la tapa del baño de parafina y tome un casete a la vez. Transfiera una muestra a la parafina líquida a 56 grados Celsius en una bandeja de equilibrio. Proceda rápidamente para evitar que la parafina se endurezca alrededor de la muestra mientras manipula el casete.

A continuación, coloque la muestra según el diseño experimental utilizando una aguja de preparación. Repita el procedimiento hasta que todas las muestras hayan sido transferidas. Para preparar secciones delgadas para LAM, sobre una mesa iluminada, retire la parafina con la muestra de la bandeja de plástico.

Extraiga un bloque de cera que contenga la muestra, como un botón o una flor, utilizando una cuchilla libre de RNasas. A continuación, derrita una pequeña gota de cera de parafina en la punta de una espátula. Y utilice la cera caliente para fijar el bloque con la muestra incrustada sobre el soporte.

Retire la cera adicional que rodea la muestra con una hoja de bisturí y asegúrese de que el bloque tenga una superficie cuadrada con bordes paralelos. Luego, ajuste la placa calefactora a 42 grados Celsius. Monte la muestra de forma segura en el microtomo.

Prepare secciones de siete micrómetros de grosor para las células del gametofito maduro de Boechera. Posteriormente, transfiera los ribones de parafina de 10 a 15 centímetros de longitud a una caja de plástico con cartón negro en la base antes de colocarlos sobre las laminillas LAM. Para preparar las laminillas para LAM, coloque de cinco a diez laminillas con marco metálico sobre la placa calefactora con las superficies planas hacia arriba.

Pipetee uno a dos mililitros de agua libre de RNasa sobre la parte plástica de las laminillas. Con una hoja de bisturí, corte las cintas de parafina en trozos cortos de aproximadamente cuatro a cinco centímetros. Lo suficientemente largos como para cubrir las ventanas plásticas de las laminillas.

Luego, utilice un par de pinzas y una aguja de preparación para colocar las tiras de parafina paralelas entre sí sobre la ventana de plástico de los portaobjetos. Levante cuidadosamente los portaobjetos por un extremo para eliminar el agua y colóquelos de nuevo. Cubra la placa calefactora con una tapa de plástico sin tocar los portaobjetos, y asegúrese de que la tapa de plástico permita el intercambio de aire.

Deje secar las laminillas a 42 grados Celsius durante la noche. Bajo una campana química, desparafine las laminillas en xilol dos veces durante 10 minutos cada vez. Asegúrese de sumergir solo la parte de plástico de las laminillas y mantenga seco el extremo más ancho del marco metálico de cada laminilla para facilitar su retiro.

Deje secar las laminillas durante 10 minutos en la campana química antes de la LAM. En este procedimiento, encienda la computadora y el microscopio para la LAM. Luego, inicie el programa que controla el microscopio y el láser.

Encienda la caja de control del láser y active el láser presionando el botón correspondiente en la caja de control. A continuación, coloque un casquete en el portacasquetes. Coloque el portaobjetos LAM sobre un portaobjetos de vidrio para microscopía y asegúrese de que la superficie plana del portaobjetos con los tejidos adheridos quede mirando hacia el portaobjetos de vidrio.

Luego, coloque la portaobjetos en el instrumento con la lámina de vidrio por debajo. Finalmente, coloque el portatapas con la cubierta en el instrumento. Seleccione el objetivo 4x.

En el programa, mueva la tapa a la posición superior. Posteriormente, realice un escaneo del portaobjetos. Examine el portaobjetos e identifique las estructuras de interés.

Localice y guarde sus posiciones en la lámina para poder regresar a la posición exacta durante el paso de corte. Luego, seleccione un objetivo adecuado. Verifique la posición del láser presionando una vez el botón de disparo del láser.

Idealmente, en una parte de la membrana sin tejido. Con la tapa en posición hacia abajo, utilice la herramienta de lápiz manual para marcar los bordes del tipo celular o del tejido de interés. Por ejemplo, la célula del huevo.

Diséquelo con el láser presionando Cortar. Con el fin de aislar células individuales, es fundamental identificarlas claramente en las secciones adecuadas. Además, las células deben tener un diámetro de al menos ocho micrómetros para que sea factible un análisis de transcripción específico por tipo celular.

Tenga en cuenta que es necesario repetir el corte si el borde alrededor de la célula no se ha disecado por completo, lo cual generalmente puede observarse en la pantalla. En este caso, se recomienda configurar el software para que ejecute automáticamente dos repeticiones del corte como procedimiento estándar. Después de eso, levante la tapa y muévase a la siguiente posición guardada con una estructura de interés y diseque la siguiente sección celular hasta que se hayan recolectado todas las células de interés de una portaobjetos.

Asegúrese de que la tapa esté colocada de manera que la nueva sección se adhiera a una posición vacía en la tapa. Después de haber aislado los tipos celulares de interés de todos los portaobjetos, retire el portaobjetos del instrumento. Coloque el soporte de la tapa en la posición inferior e inspeccione visualmente la superficie de la tapa.

Y utilice el objetivo 4x para excluir contaminaciones inespecíficas de la muestra. Luego cierre la tapa y congele las secciones secas a menos 80 grados Celsius hasta su uso posterior.

Aquí se muestra el dibujo esquemático del gametofito femenino maduro. Estas son secciones delgadas de óvulos que albergan gametofitos femeninos en boechera divaricarpa, en las cuales las células ovulares son claramente identificables debido a la morfología característica del gametofito femenino. Se obtuvo una calidad de ARN similar, según el análisis realizado en las secciones de células ovulares en comparación con las áreas de tejido más grandes recolectadas de las mismas láminas como controles.

La calidad del ARN obtenida fue adecuada para la secuenciación de ARN específica por tipo celular, lo que permitió la identificación de 236 genes expresados en la célula ovular apomíctica, pero no en la célula central apomíctica, la célula sinérgida ni la célula inicial apomíctica, ni tampoco en las células del gametofito sexual maduro de Arabidopsis thaliana. Otros tipos celulares y de tejidos de diferentes especies pueden analizarse para responder a preguntas adicionales en genética del desarrollo.

Como la base molecular de la impronta genética en el endospermo y los embriones de semillas de plantas. Tras su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la genética del desarrollo y la reproducción vegetal exploren la base transcripcional de la reproducción apomíctica en el género Boechera. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener ARN de alta calidad para análisis transcripcionales específicos de tipo celular utilizando microdisección asistida por láser.