Usando una técnica de laminación para realizar la microscopía confocal de la esclerótica humana

El objetivo general de esta metodología es realizar microscopía confocal de la esclerótica humana. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo oftalmológico. Como la distribución de las células inmunitarias y el estado vascular en los sanos, y las condiciones patológicas en la esclerótica.

La principal ventaja de esta técnica es que permite la obtención de imágenes confocales de tejido conectivo denso. La demostración del procedimiento estará a cargo de Stefan Kremers, un estudiante graduado de nuestro laboratorio. Para comenzar, prepare etanol al 96 por ciento y PBS en tubos individuales.

A continuación, prepare 100 microlitros por muestra de los anticuerpos primarios en la dilución recomendada de PBS que contenga un dos por ciento de BSA, y mantenga todas las soluciones en hielo. Coloque instrumentos limpios, incluyendo una o dos pinzas Colibrí, tijeras rectas de microdisección, tijeras curvas, un bisturí número 10 o una micropluma de bisturí oftálmico, cuatro agujas de calibre 26 y un hisopo. Envuelve papel de aluminio alrededor de una placa de poliestireno o prepara una placa de corcho para fijar el pañuelo.

Después de producir un bulbo abierto anteriormente de acuerdo con el protocolo de texto, coloque la esclerótica en un hisopo con la parte abierta hacia arriba. A continuación, utilice pinzas de colibri para extraer la retina y las capas uveales pigmentadas de la esclerótica interna hasta que la esclerótica quede libre de estas capas. A continuación, utilice unas tijeras curvas si es necesario para extraer la retina y la úvea de la papila.

A continuación, retire la conjuntiva restante, los músculos extraovulares y la cápsula de espigas de la esclerótica superficial. Ahora, utilizando pinzas colibri para sujetar suavemente el tejido, con tijeras rectas corte muestras esclerales de aproximadamente dos centímetros cuadrados de diferentes lugares del tejido, evitando agarrar repetidamente con las pinzas, lo que hará que el área no sea adecuada para la microscopía confocal. Coloque las muestras en tubos de 1,5 mililitros, agregue 1,5 mililitros de etanol al 96 por ciento e incube durante 15 minutos para fijar el tejido.

Luego, después de quitar el etanol, use 1,5 mililitros de PBS para lavar las muestras tres veces durante cinco minutos cada una mientras agita. A continuación, transfiera las muestras a 1,5 mililitros de PBS con un cinco por ciento de BSA e incube a temperatura ambiente durante dos horas, lo que inducirá la hinchazón de las muestras, para ayudar con la laminación y evitar la unión inespecífica. Cuando las muestras se hayan hinchado, bajo un microscopio estereobinocular use agujas de calibre 26 que se hayan doblado en los bordes para fijar las muestras esclerales posteriores a la membrana de poliestireno envuelta en papel de aluminio o placa de corcho.

Luego, para laminar las muestras de espesor completo, use pinzas colibri para sujetar horizontalmente el borde anterior del tejido escleral. Con un bisturí número 10, corte con cuidado una capa lo más delgada posible de la esclerótica superficial, de la capa subyacente. Para evitar que el tejido se seque, pipetee 50 microlitros de PBS en las capas.

Luego, después de que se hayan cortado las capas, colóquelas en 100 microlitros de PBS en una placa de 96 pocillos y use un marcador impermeable para etiquetar tanto la orientación como la capa. Continúe aislando las capas y transfiéralas a la placa de 96 pocillos hasta que el tejido esté completamente laminado. Para llevar a cabo la inmunohistoquímica, retire el medio de la placa de 96 pocillos sosteniendo la pipeta contra la pared de cada pocillo y aspirando el fluido.

A continuación, añada 100 microlitros de los anticuerpos primarios diluidos de uno a 100 en PBS con un dos por ciento de BSA a los pocillos adecuados, e incube a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, use de 200 a 300 microlitros de PBS para lavar las muestras en un agitador tres veces durante cinco minutos cada una. Si es necesario, use otro anticuerpo primario y vuelva a incubar durante la noche a cuatro grados centígrados.

A continuación, añada 100 microlitros de los anticuerpos secundarios correspondientes, diluidos de uno a 300 en PBS con un dos por ciento de suero de cabra, e incube en la oscuridad a temperatura ambiente durante una o dos horas. Después de la incubación, use de 200 a 300 microlitros de PBS para enjuagar las muestras nuevamente en el agitador tres veces durante cinco minutos cada una. A continuación, añada 100 microlitros de una dilución de uno a 2000 de DAPI a cada pocillo e incube en la oscuridad a temperatura ambiente.

Antes de usar de 200 a 300 microlitros de PBS para lavar las muestras dos veces. Transfiera las muestras a portaobjetos de microscopio bajo el microscopio estereobinocular para asegurarse de que la muestra esté plana sobre el portaobjetos, y agregue una o dos gotas de medio de montaje fluorescente. A continuación, coloca un cubreobjetos encima y utiliza un esmalte de uñas transparente para sellar los bordes.

Almacenar en la oscuridad a cuatro grados centígrados para su uso posterior o examinar directamente por microscopía confocal. Para verificar el espesor de las muestras, tome pilas z, ya que el espesor difiere ecuatorial y posteriormente dependiendo de la ubicación escleral. Estas imágenes muestran la diversa red del plexo de los vasos sanguíneos en la esclerótica humana laminada derivada de la episclera anterior y posterior.

Los vasos sanguíneos son positivos para CD31 como se muestra en verde. En esta figura, se ilustran las células inmunitarias LYVE1 positivas de la epiesclerótica y su relación con los vasos sanguíneos CD31 positivos. La serie z-stack se tomó con un aumento de 10x para examinar las relaciones tridimensionales de los vasos sanguíneos y las células inmunitarias.

Como se muestra aquí, los músculos extraoculares encerrados dentro de la esclerótica también se pueden analizar para detectar la presencia de vasos sanguíneos o células inmunitarias, utilizando los marcadores CD31 y LYVE1 respectivamente. Una vez dominada, la técnica de laminación se puede realizar en menos de una hora si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe evitar que el tejido se seque.

No hay que olvidar que trabajar con tejido humano puede ser potencialmente infeccioso y siempre se deben tomar precauciones como los diagnósticos microbiológicos y virológicos de antemano.