Un Paso a Paso Protocolo para la cirugía subretiniana en conejos

El objetivo general de esta intervención quirúrgica es reemplazar el epitelio pigmentario disfuncional de la retina, o EPR, para encontrar una posible cura para las enfermedades relacionadas con el EPR, como la degeneración macular relacionada con la edad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la optometría sobre la terapia basada en células y la degeneración macular relacionada con la edad. La principal ventaja de esta técnica es que puede proporcionar una modalidad de transporte para sustratos de reemplazo celular o dispositivos de administración de fármacos al espacio subretiniano.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la vitrectomía y la cirugía subretiniana en conejos, también se puede utilizar en otros organismos modelo, como cerdos, monos o humanos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, ya que no solo la cirugía intraocular es compleja, sino que también el personal, la organización y la tecnología para este procedimiento deben estar bien sincronizados. Fabian Thieltges, un postdoctorado, y Ralf Brinken, un enfermero quirúrgico, ambos de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento de carga de instrumentos.

Antes de comenzar la cirugía, confirme el nivel adecuado de anestesia y aplique ungüento ocular en el otro ojo no operado del animal. Luego, coloque al conejo bajo un microscopio quirúrgico en su lado izquierdo, con el ojo derecho hacia arriba y la nariz ligeramente elevada por un pliegue de manta. Desinfectar el ojo durante un minuto con unas gotas de povidona yodada.

Luego, enjuague el ojo con BSS estéril y cubra la cabeza del animal con una cortina estéril con una abertura ocular precortada. Coloque un trozo de incisión quirúrgica pegajosa de 12 por 17 centímetros sobre el ojo y use unas tijeras para exponer el ojo con una incisión horizontal en la línea media. Usando pinzas invertidas, desplace el ojo a la posición proptosada y asegure el tejido con una sutura de seda 3-0.

Luego, use un par de tijeras Vannas para incidir la conjuntiva cerca del limbo, aproximadamente a un milímetro de los vasos sanguíneos adyacentes, y agrandar la peritomía paralela al limbo. Separe sin rodeos la conjuntiva, seguido de una incisión vertical perpendicular de seis a siete milímetros para hacer una "T" en la conjuntiva. Haga otra peritomía pequeña alrededor de la posición de las 2 en punto.

A continuación, inserte con cuidado la punta de una cuchilla microvitreorretiniana de calibre 23 a través de la esclerótica, apuntando hacia el polo posterior del ojo a 3,5 milímetros del limbo en la posición de las 8 en punto. Para evitar agrandar la incisión, retraiga lentamente la cuchilla en la misma dirección y coloque previamente una sutura Vicryl 7-0. Luego, inserte la cánula de infusión de puerto lateral personalizada en la abertura escleral y use la sutura precolocada para asegurar la cánula.

Ajuste la presión intraocular de 20 a 24 milímetros de mercurio. Luego, use un trocar de cabeza plana de calibre 25 para perforar la esclerótica en la posición de las 2 en punto e inserte una luz de araña de calibre 25 en el puerto. Asegure la luz con cinta adhesiva y ajústela a aproximadamente el 30% de potencia, luego ajústela individualmente.

Utilice un bisturí de 20 para eliminar el epitelio corneal edematoso para facilitar una mejor visualización intraocular. Ahora, realice otra esclerotomía con la cuchilla microvitreorretiniana de calibre 23 a las 10 en punto y coloque una sutura de Vicryl 7-0 en forma de U alrededor de la esclerótica incisa sin hacer un nudo completo. Inserte la punta de un vitrector de alta velocidad en la incisión y comience la vitrectomía alrededor del puerto de entrada.

Cortar el humor vítreo en pedazos pequeños a un máximo de 2.000 a 3.000 cortes por minuto, continuando la vitrectomía sobre el disco óptico y las fibras medulares, y aspirando hasta un máximo de 200 milímetros de mercurio. Para separar suavemente el humor vítreo de la retina, sostenga el vitrector sobre el polo posterior e inferior del disco y continúe aspirando sin cortar. Cuando se completa el desprendimiento del vítreo posterior, se inyectan por vía intravítrea aproximadamente 50 microlitros del compuesto de interés para visualizar el vítreo flotante durante su eliminación casi total.

Una vez preparado el ojo, enjuague el cultivo celular de implantación tres veces con BSS de grado oftálmico no suplementado. A continuación, llene una placa de cultivo celular de 100 por 20 milímetros con 10 mililitros de BSS de grado oftálmico y agregue el inserto de cultivo celular a la placa. Centre el plato bajo un microscopio óptico y use una aguja hueca ovalada afilada hecha a medida para perforar un sustrato plano en forma de frijol de 2,4 por 1,1 milímetros con dos bordes largos y dos bordes redondos fuera del cultivo celular.

Enjuague suavemente la aguja a través del segundo puerto con BSS para enjuagar el implante en la placa de cultivo celular llena de BSS. Para obtener un tercer borde, haga una incisión de 0,5 mililitros en uno de los extremos redondos del implante y utilice pinzas de peeling de membrana de calibre 23 para transferir el implante a la estación de carga hecha a medida. Asegúrese de que el implante esté en posición vertical, luego use las pinzas para empujar suavemente el implante completamente dentro del instrumento de disparo hasta que todo el tejido esté asegurado dentro de la punta y coloque la punta de disparo en la estación de carga debajo de BSS hasta que se implanten las células.

Para permitir la implantación de las células debajo de la retina, se aborda la retina neural con una aguja de inyección subretiniana extensible de calibre 41 conectada a una jeringa hermética al gas e inyecte BSS por vía subretiniana para crear un desprendimiento de retina ampollado. Cuando la ampolla tiene un diámetro de disco de aproximadamente 2 a 3 pulgadas, use tijeras VR verticales de calibre 23 para agrandar la retinotomía a 1.5 milímetros y use un bisturí de incisión de 1.4 milímetros para extender con precisión la esclerotomía de las 10 en punto a un enfoque de calibre 20. A continuación, intente pasar un maniquí de tirador de calibre 20 a través de la esclerotomía, agrandando la incisión según sea necesario para garantizar una transición suave pero ajustada del tirador cargado.

Luego, pase el tirador cargado a través de la incisión escleral a 20 a 24 milímetros de mercurio hasta el borde de la retinotomía e inyecte el implante subretinianamente desde una posición epirretiniana. El tirador debe hacer una transición a través de la esclerótica rápidamente en el primer intento, así que asegúrese de una esclerotomía de tamaño óptimo. A continuación, las células del EPR deben implantarse subretinianamente en un ángulo poco profundo para evitar el atrapamiento del borde de ataque del implante en la membrana de Bruch.

Ajuste el implante de modo que se coloque debajo de la retina razonablemente lejos de la retinotomía. Luego, retire el puerto de la esclerotomía e inyecte 25 microlitros de triamcinolona a través del puerto del candelabro. Con suturas 7-0, cierre las esclerotomías de las 2 y las 10 en punto y verifique si hay fugas.

Retire la cánula de infusión y cierre inmediatamente la última esclerotomía con la sutura 7-0 Vicryl precolocada. Con una aguja de calibre 30, inyecte BSS para ajustar la presión intraocular según sea necesario, mientras palpa. Por último, suturar la conjuntiva con Vicryl 7-0 y retirar la seda proptonante, teniendo cuidado de evitar el plexo venoso orbitario profundo.

El injerto debajo de la retina tiene una tasa de éxito quirúrgico de aproximadamente el 60% cuando se realiza una vitrectomía central, que aumenta a más del 75% cuando se induce un desprendimiento de vítreo posterior. Aquí, se muestra una imagen de reflectancia infrarroja del oftalmoscopio láser de barrido de epitelios de pigmento de retina cultivados xenotrasplantados en una membrana de poliéster después de un procedimiento sin complicaciones, con la atrofia de los fotorreceptores resultante de la reacción inmunitaria que aparece como un halo alrededor del implante. En esta imagen de tomografía de coherencia óptica de dominio espectral correspondiente, se puede observar el adelgazamiento de la capa nuclear externa como respuesta al xenotrasplante de EPR, principalmente en la retina con una banda hiperreflectante visible por encima del implante.

Sin embargo, la retina neural adyacente al implante exhibe bandas de reflexión casi normales, lo que sugiere un parto atraumático del implante. Como se observa en la tinción de H/E, la cicatrización subretiniana y la atrofia de la capa nuclear externa ocurren en conejos xenotrasplantados no inmunodeprimidos. La membrana de Bruch debajo del implante también parece ser contigua, con el coriocapilar que contiene algunos eritrocitos dispersos, lo que confirma aún más la ausencia de trauma incurrido durante la entrega del implante.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en una hora si no se encuentran complicaciones. Al intentar este procedimiento, es importante recordar crear una ampolla de retina y una retinotomía lo suficientemente grandes como para caber en el implante. Además, una intervención quirúrgica más rápida suele producir mejores resultados.

Después de este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como la tomografía de coherencia óptica o la histología, para responder a preguntas adicionales, como el éxito del trasplante, la biocompatibilidad subretiniana y la supervivencia de las células trasplantadas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en los campos de la biología de células madre y los biomateriales exploraran la administración subretiniana de derivados de células madre y/o sustratos portadores biofuncionalizados para la enfermedad de la retina, particularmente el EPR. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la cirugía de vitrectomía e implantación subretiniana en conejos.

No olvide que trabajar con la lente, el vítreo retiniano y la interfaz subretiniana puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como la posición adecuada de la mano, una buena visualización, una presión intraocular estable al realizar este procedimiento.