Name: Análisis clínico-patológica de los genes miARN expresión en el cáncer de mama mediante el uso de tejidos miARN In Situ La hibridación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Aprenda a detectar la expresión de miARN en tejidos de cáncer de mama mediante hibridación in situ. Este protocolo permite localizar microRNAs específicos y comprender su papel en la patología tumoral.

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Este trabajo fue apoyado por la beca NIH (5R01 CA178386-03) y la subvención USC ASPIRE-1 a HC. Nos gustaría agradecer a Vrushab Gowda por su ayuda con el manuscrito.

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de la Universidad Nacional de Chonnam Hwasun y la Universidad de Carolina del Sur. TMA muestras compuestas de cáncer de mama y tejidos de mama normales adyacentes emparejados fueron proporcionados por el Biobanco del Hospital Hwasun Chonnam Universidad Nacional, un miembro de la Red de Biobancos Corea. 1. Preparación de la solución <ol><li> Preparar 1 l de DNasa y RNasa libre de agua. Realiza todas las soluciones químicas mediante el uso de dietilo (DEPC) de agua tratada. Tratar 1 L de agua con 500 l de DEPC y se incuba durante 3 horas a temperatura ambiente. Autoclave el agua para inactivar DEPC. Precaución: No se requieren medidas DEPC ya que es conocido carcinógeno. </li><li> Preparar 1x PBS 10x de PBS utilizando agua tratada con DEPC. </li><li> Preparar 20x SSC (disolver 175,3 g de NaCl y 88,2 g de citrato de sodio en 800 ml de agua, ajustar el pH a 7,0 con unas pocas gota de 14 N solución de HCl y ajustar el volumen a 1 L con water), 4% de paraformaldehído, 95% de etanol, 80% de etanol con agua tratada con DEPC. </li><li> Añadir 8 ml de trietanolamina y 1,05 ml de HCl en 590 ml de agua tratada con DEPC y añadir 1,5 ml de anhídrido acético para la acetilación. </li><li> Preparar 50 g / l de proteinasa K en tampón (50 mM Tris-HCl, pH 8,0 en DEPC agua tratada). </li><li> Preparar tampón de hibridación compuesto por 500 l de formamida, 250 l de 20x SSC, 100 l de 50x solución de Denhardt, 12,5 l de t-RNA, 2.5 l de ADN de esperma de arenque, 30 l de RVC, 0,02 g de reactivo de bloqueo y 50 l de agua DEPC. Preparar fresco. </li></ol> 2. Las secciones de tejido de mama <ol><li> Cortar 5 micras secciones incluidas en parafina fijadas con formalina con microtomo y aplicar la sección 14 para cargar diapositivas. Nota: El tejido mamario se utiliza aquí se preparó previamente de la Red de Biobancos Corea. </li></ol> 3. Preparación del tejido <ol><li> Retire la parafina lado a otrom el tejido mediante la inmersión de diapositivas en 2x jarra Coplin en xileno fresco durante 10 minutos cada uno y rehidratar la sección de tejido por incubaciones de 5 min en concentraciones decrecientes de etanol (100%, 95% y 80%) en ddH 2 O. Realice este paso en una campana de humos. </li><li> Sumergir el tejido en DEPC agua tratada durante 5 min. En este punto completar límites en torno sección de tejido con la pluma barrera hidrofóbica. </li><li> Fijar el tejido con 4% PFA durante 15 min seguido de un lavado con PBS. </li><li> Sumergir el tejido en 0,3% de Triton X-100 / PBS durante 10 min seguido de un lavado con PBS. </li><li> Incubar la muestra con una solución / l de proteinasa K 50 mg durante 15 minutos a 37 ° C. A continuación incubar las secciones de tejido con trietanolamina y anhídrido acético durante 5 min a temperatura ambiente, seguido de un lavado con PBS. No se requiere un lavado con PBS entre el tratamiento con proteinasa K y / anhídrido acético tratamiento trietanolamina. </li></ol> 4. La hibridación <ol><li> Lavar el tejido a fondo y incubate la sección de tejido con tampón de hibridación para 2-3 horas a temperatura ambiente. Típicamente 120 l de tampón de hibridación es suficiente para cubrir la sección de tejido. </li><li> Diluir 5&#39;-DIG sonda marcada LNA a la concentración final de 3 horas, en la solución de hibridación 120 l. A medida que la concentración de reserva por lo general es de 40 ng / l, añadir 3 l de tampón de hibridación de valores para 120 l e incubar la mezcla a 95 ° C durante 5 min. </li><li> Incubar sección de tejido durante la noche con la sonda a 54 ° C (Tm) en una cámara húmeda. Típicamente 120 l es suficiente para cubrir una sección. Crear humedad mediante el uso de dos toallas de papel húmedo. El tamaño ideal de la cámara es de 10 pulgadas por 8 pulgadas. </li><li> Nota: Tm puede ser diferente para diferentes miARN. 54 ° C es la mención de miR-489. </li></ol> 5. rigurosidad de lavado <ol><li> Lavar el tejido con 5 x SSC durante 7 minutos (después de la etapa de hibridación, RNasa condiciones libres ya no son necesarios). </li><li> Lavar la sección de tejido ingenioh 1x SSC durante 7 minutos dos veces a 57 ° C. </li><li> Lavar la sección de tejido con 0,2 x SSC durante 7 minutos a 57 ° C. </li><li> Lavar la sección de tejido con 0,2 x SSC durante 7 minutos a temperatura ambiente. </li><li> sección de tejido en PBS en incubación durante 10 min. </li></ol> 6. Bloqueo <ol><li> Incubar la sección de tejido con tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 hr en una cámara húmeda (Para hacer el amortiguador de bloqueo añadir 2 ml de FBS, 10 l de Tween-20 y 3 l de BSA en 18 m de PBS. Tienda tampón de bloqueo a 4 DO). </li></ol> 7. Anticuerpo primario Incubación y Desarrollo <ol><li> Diluir 1: 300 de anticuerpo anti-DIG-AP en tampón de bloqueo y se incuba la sección de tejido con el anticuerpo a 4 ° C durante la noche. </li><li> Se lavan las secciones con tampón de lavado 3 veces, durante 5 minutos cada uno (tampón proporcionado por el kit de desarrollo). </li><li> Desarrollar la sección de tejido con un kit comercial para la fosfatasa alcalina que produce CY-3 luz fluorescente. </li> &lt;li&gt; Lavar la sección con tampón de lavado durante 5 min. sección de la mancha con 100 l de 2,5 ng l de colorante / Hoechst durante 5 min seguido de un lavado de 5 min con tampón de lavado. </li><li> Montar la sección con tampón de montaje de acuerdo con el protocolo del fabricante. Utilice 15 l por sección de tejido y limpie solución de montaje con el tejido excesivo limpie. Sellar la diapositiva con esmalte de uñas transparente para evitar fugas. </li><li> Observar al microscopio fluorescente usando la sección con un aumento de 10X lente de modo total es de 100X. </li></ol>

<ol><li>Shah, N. R., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+pathogenesis+of+breast+cancer%3A+Implications+in+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment.</a> World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).</li>
<li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-185+suppresses+tumor+proliferation+by+directly+targeting+E2F6+and+DNMT1+and+indirectly+upregulating+BRCA1+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer.</a> Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).</li>
<li>Ye, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+miR-375+induces+trastuzumab+resistance+in+HER2-positive+breast+cancer+by+targeting+IGF1R%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R.</a> BMC Cancer. 14, 134(2014).</li>
<li>Oneyama, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-mediated+downregulation+of+mTOR%2FFGFR3+controls+tumor+growth+induced+by+Src-related+oncogenic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways.</a> Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).</li>
<li>McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+breast+cancer%3A+the+potential+of+miRNA+for+diagnosis+and+treatment+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring.</a> Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).</li>
<li>Quesne, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+prognostic+associations+of+miR-205+and+let-7b+in+breast+cancer+revealed+by+in+situ+hybridization+analysis+of+micro-RNA+expression+in+arrays+of+archival+tumour+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue.</a> J Pathol. 227, 306-314 (2012).</li>
<li>Fernandez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-340+inhibits+tumor+cell+proliferation+and+induces+apoptosis+by+targeting+multiple+negative+regulators+of+p27+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer.</a> Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).</li>
<li>Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-224+upregulation+and+AKT+activation+synergistically+predict+poor+prognosis+in+patients+with+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-146+up-regulation+predicts+the+prognosis+of+non-small+cell+lung+cancer+by+miRNA+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization.</a> Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).</li>
<li>Kriegel, A. J., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+in+situ+hybridization+for+formalin+fixed+kidney+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues.</a> J Vis Exp. , e50785(2013).</li>
<li>Ucar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-212+and+miR-132+are+required+for+epithelial+stromal+interactions+necessary+for+mouse+mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development.</a> Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).</li>
<li>Nuovo, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+microRNAs+in+paraffin+embedded%2C+formalin+fixed+tissues+and+the+co-localization+of+their+putative+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets.</a> Methods. 52, 307-315 (2010).</li>
<li>Kierzek, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+locked+nucleic+acid+residues+on+the+thermodynamic+properties+of+2%27-O-methyl+RNA%2FRNA+heteroduplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes.</a> Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+expression+of+miR-182+and+miR-503+cooperatively+targets+FBXW7%2C+contributing+to+the+malignant+transformation+of+colon+adenoma+to+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma.</a> J Pathol. 234, 488-501 (2014).</li>
</ol>

No hay nada que revelar.

El objetivo de este estudio fue determinar el nivel de expresión de los genes miARN en los tejidos de cáncer de mama utilizando miARN hibridación in situ. Hay que señalar que en este experimento, todas las condiciones se optimizaron para el tejido de cáncer de mama. Una optimización adicional puede ser necesario para otros tipos de tejidos. Todas las soluciones deben hacerse con agua DEPC y todos los contenedores que se utilicen deben ser enjuagados con agua tratada con DEPC y posteriormente en autoclave. Inclu...

El cáncer de mama es una de las neoplasias más comunes que afectan a la población femenina en todo el mundo. Más de 1,3 millones de casos de cáncer de mama cada año se registran en todo el mundo 1,2. Aunque las células tumorales han sido tradicionalmente considerado como biológicamente homogénea y altamente proliferativas, se ha hecho evidente que el cáncer de mama es genéticamente y clínicamente heterogéneos. La resistencia a medicamentos contra el cáncer prevalentes es una característica de los cánceres de mama avanzados, que conduce a la mortalidad en la mayoría de los pacientes a través de su facilitación de la progresión del cáncer y la metástasis a distancia 3. MicroARNs (miRNAs) son una clase de moléculas de ARN pequeñas de aproximadamente 22 nucleótidos de longitud que regulan la expresión génica mediante el bloqueo de la traducción del ARNm o la mediación de la degradación del ARNm 4. Más de 2.000 diferentes miRNAs Hasta ahora se han identificado en humanos, que están vinculados a enfermedades humanas 5. Un creciente gama de estudios VHAe demostró que los miRNAs pueden funcionar como oncogenes y supresores tumorales y son a menudo mal regulada en tumores 6. miRNAs afecta fuertemente la totalidad de la tumorigénesis primaria mediante el control de los principales reguladores de la progresión del ciclo celular, la senescencia, la apoptosis y la autofagia, junto con los de la motilidad de células tumorales, invasión y metástasis 7. La expresión aberrante de los genes miARN se ha asociado también con implicaciones clínicas como la etapa, la diferenciación, el pronóstico y respuesta al tratamiento adyuvante 8. En particular, el aumento de expresión de miR-146 se correlaciona con mal pronóstico en pacientes con cáncer de pulmón 9. Otro estudio ha demostrado que la expresión perdida de miARN-let7b está vinculada a fenotipos malignos y, en consecuencia, una baja supervivencia 6. La comprensión de los tipos de células y estructuras que expresan miRNAs es una parte importante de la comprensión de los mecanismos a través del cual las alteraciones en la célula de influir en la expresión de los genes miARN ytejido fenotipos 10. Ciertos miRNAs encontrado para ser secretada en las células del estroma se toman en por las células epiteliales y actúan específicamente sobre sus objetivos. En la misma línea, el miR-212 y miR-132 son secretadas por estroma y regulan las interacciones epitelio-estroma necesarios para derivación ductal durante el desarrollo de la glándula mamaria 11. El objetivo general de este trabajo es explicar un protocolo detallado para detectar la expresión de los genes miARN en tejidos de cáncer de mama a través de miRNA hibridación in situ. Hemos optimizado todas las condiciones para someter a ensayo los niveles de expresión de los genes miARN-489 en muestras de pacientes con cáncer de mama. Con este fin, se utilizó una DIG marcado bloqueado sonda de ácido nucleico (LNA) en nuestro experimento. Algunos de sus nucleótidos tenían una modificación LNA, es decir, un puente de metileno que conecta &#39;átomo de oxígeno y 4&#39; de la 2 átomo de carbono del esqueleto de ribosa que fija el nucleótido de tal manera que permanece &quot;bloqueado en su lugar&quot; después de la hibridación. Como resultado, es mucho más difícilpara el complejo hibridado para desnaturalizar 12,13.

<table><tbody><tr><td>Tecnología de vida ELF-97</td><td>&nbsp;</td><td>E6604</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhard't&nbsp;</td><td>Tecnología de la vida&nbsp;</td><td></td><td></td>750018</tr><tr><td>ARNt</td><td>Roche</td><td>109541</td><td>Reconstituir en agua DEPC</td></tr><tr><td>Arenque Esperma ADN</td><td>Promega&nbsp;</td><td>D1815</td><td></td></tr><tr><td>Roche Bloqueo&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>RVC</td><td>Fisher</td><td>50-812-650</td><td>Antes de usarlo, gírelo a 16.1 RCF y tome sobrenadante&nbsp;</td></tr><tr><td>Sonda miR-489&nbsp;</td><td>Exiqon</td><td>38599-01</td><td></td></tr><tr><td>Libre de nucleasa BSA</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>711454</tr><tr><td>Anticuerpo primario-anti DIG</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11093274910</tr><tr><td>Pirocarbonato de dietilo&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>1609478</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis clínico-patológica de los genes miarn expresión en el cáncer de mama mediante el uso de tejidos miarn<em&gt; in situ</em&gt; la hibridación

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

En este artículo, describimos un protocolo detallado para la detección de miRNA en tejido de cáncer de mama utilizando hibridación in situ con una sonda de LNA (ácido nucleico bloqueado) marcada con digoxigenina. La sonda fue reconocida por anticuerpos anti-DIG contra la fosfatasa alcalina y posteriormente se desarrolló utilizando sustrato de fosfatasa alcalina que produce señales de fluorescencia. Aquí utilizamos la técnica de hibridación in situ (MISH) de miRNA para analizar la expresión de miR-489 en tejidos de pacientes con cáncer de mama. Esta técnica puede detectar la localización de miRNA de interés en muestras individuales de tejido. Esta técnica se puede utilizar para comparar la expresión del miRNA deseado en el tejido tumoral con la del tejido normal adyacente y para identificar las estructuras específicas responsables de expresar este miRNA. Esta técnica puede ser muy útil para responder a ciertas preguntas clínicas, como el papel de un miRNA específico en el desarrollo del cáncer. Nuestros resultados indican que las células epiteliales mamarias expresan niveles significativamente más altos de miR-489 que las células tumorales adyacentes.

Se utilizó el tejido de cáncer de mama humano para determinar la expresión de miRNA-489. Se encontraron conducto de la glándula mamaria y las células epiteliales de expresar significativamente más altos miARN-489 niveles que el tejido adyacente tumor en dos pacientes (Figura 1A y 1B). Esto demuestra claramente que la expresión de miRNA-489 se ha perdido en el tejido tumoral, lo que sugiere una actividad supresora de tumores de miARN-489. Para confirmar a...

Aquí presentamos un protocolo para detectar la expresión de miRNA en muestras de pacientes con cáncer de mama utilizando hibridación in situ de miRNA.

Análisis clínico-patológica de los genes miARN expresión en el cáncer de mama mediante el uso de tejidos miARN<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA ...

El objetivo general de esta hibridación in situ de microARN es detectar la localización del microARN de interés en tejido de cáncer de mama, de modo que el resultado pueda responder la pregunta clave en el campo del cáncer de mama, como por ejemplo si el microARN de interés actúa como oncogén o como supresor tumoral.La principal ventaja de esta técnica es que puede detectar la nuclearización celular de interés en tejido de cáncer de mama. Comience la preparación del tejido retirando la parafina de cortes de tejido mamario previamente preparados. Sumerja las laminillas en un frasco de Coplin con xileno fresco dos veces durante diez minutos cada vez.Rehidrate la sección de tejido mediante incubaciones en concentraciones decrecientes de etanol en agua doblemente destilada durante cinco minutos cada una. A continuación, sumerja el tejido en agua tratada con pirocarbonato de dietilo o DEPC durante cinco minutos. Mientras el tejido está sumergido, trace límites alrededor de la sección de tejido con un rotulador de barrera hidrofóbica.Después de la inmersión en DEPC, fije el tejido con PFA al 4 % durante 15 minutos. Lave el tejido con PBS después de la fijación. A continuación, sumerja el tejido en Triton X-100 al 0,3 % en PBS durante diez minutos.Incube la muestra con 50 microgramos por microlitro de solución de Proteinasa K durante 15 minutos a 37 grados Celsius. Luego, incube las secciones de tejido con trietanolamina y anhídrido acético durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, realice un lavado con PBS.Lave el tejido minuciosamente. E incube la sección de tejido con 120 microlitros de tampón de hibridación durante dos horas a temperatura ambiente. A continuación, diluya la sonda NLA marcada con DIG en el extremo cinco prime a una concentración final de 3 picomolares en 120 microlitros de solución de hibridación.Luego, agregue tres microlitros de la solución stock de 40 nanogramos por microlitro al tampón de hibridación de 120 microlitros. Incube la mezcla a 95 grados Celsius durante cinco minutos. Introduzca la sección de tejido en un recipiente de diez por ocho pulgadas y cubra el tejido con 120 microlitros de la sonda, de modo que quede completamente cubierto.Humedezca dos toallas de papel y cúbrala el recipiente para crear una cámara de humedad. Incube la sección de tejido durante la noche a 54 grados Celsius. Después de la hibridación, lave el tejido con tampón de citrato sódico salino 5X o SSC durante siete minutos a 57 grados Celsius.A continuación, lave la sección de tejido con SSC 1 X dos veces. Y lave la sección de tejido con SSC 0,2 X. Luego, lave la sección de tejido con SSC 0,2 X durante siete minutos a temperatura ambiente.Incube la sección de tejido en PBS durante diez minutos. Incube la sección de tejido con el tampón bloqueador a temperatura ambiente durante una hora en una cámara húmeda. Diluya el anticuerpo anti-DIG AP uno a 300 en el tampón bloqueador.Y incubar el corte de tejido con el anticuerpo a 4 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, lavar los cortes con tampón de lavado tres veces durante cinco minutos cada vez. Seguir las instrucciones del kit comercial ELF 97 para revelar el corte de tejido con fosfatasa alcalina que produce una señal fluorescente de tamaño tres.A continuación, lave la sección con tampón de lavado durante cinco minutos. Tiña la sección con 100 microlitros de colorante Hoeshct a 2,5 nanogramos por microlitro durante cinco minutos. A continuación, realice un lavado de cinco minutos con tampón de lavado.Utilice 15 microlitros de tampón de montaje por sección de tejido. Y limpie el exceso de solución de montaje con una toallita. A continuación, selle el portaobjetos con esmalte de uñas transparente para evitar fugas.Finalmente, observe la sección con un microscopio fluorescente a un aumento total de 100 X. Se utilizaron muestras de tejido de cáncer de mama humano de dos pacientes para determinar la expresión de Micro RNA 489. Se encontró que los conductos de la glándula mamaria y las células epiteliales expresan niveles significativamente más altos de Micro RNA 489 que el tejido tumoral adyacente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la hibridación in situ de Micro RNA utilizando muestras de pacientes con cáncer de mama.

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En este artículo se describe un protocolo de hibridación in situ optimizado para la detección colorimétrica de expresión de microARN en secciones de riñón fijas con formalina.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de los tejidos del riñón y fijados con formalina

Molecular señalización a través de estrógeno y microRNAs son fundamentales en el desarrollo y el crecimiento del cáncer de mama. El estrógeno activa los receptores de estrógeno, que son factores de transcripción. Muchos factores de transcripción pueden regular la expresión de microRNAs, y microARN regulados por estrógenos se puede perfilar el uso de diferentes técnicas a gran escala.

Perfiles de microARN regulados por estrógeno en las células del cáncer de mama

Aquí describimos un protocolo simplificado para análisis de expresión de microARN (miARN) en tejidos clínicos archivados de cáncer de próstata (PCa) fijados en formol, incluidos en parafina (FFPE) o congelados frescos que emplean PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR) e hibridación in situ (ISH).

Los análisis de expresión de miRNA en tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata

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Multimodal de imágenes de la angiogénesis en un modelo de rata desnuda de las metástasis óseas del cáncer de pecho utilizando imágenes de resonancia magnética, tomografía computarizada y la ecografía volumétrica

Aprenda a detectar la expresión de miARN en tejidos de cáncer de mama mediante hibridación in situ. Este protocolo permite localizar microRNAs específicos y comprender su papel en la patología tumoral.

Análisis clínico-patológica de los genes miARN expresión en el cáncer de mama mediante el uso de tejidos miARN In Situ La hibridación (Video) | JoVE Journal

Análisis clínico-patológica de los genes miARN expresión en el cáncer de mama mediante el uso de tejidos miARN

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