Aislamiento y caracterización de un cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas subpoblaciones Tener madre Características de las células

El objetivo general de este procedimiento es aislar las células madre cancerosas de las líneas celulares de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello o HNSCC. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del tratamiento del cáncer sobre cómo usar la quimioterapia para superar la radiorresistencia tumoral. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza una combinación de marcadores para lograr una alta especificidad en células madre cancerosas de líneas celulares HNSCC.

La demostración del procedimiento correrá a cargo de Prescillia Battiston-Montagne, nuestra técnica, y Marion Gilormini, doctora de mi laboratorio. Para seleccionar una población secundaria de células madre cancerosas mediante el ensayo de eflujo de colorante de Hoechst, primero etiquete un tubo cónico de Hoechst y un Hoechst y Verapamilo. A continuación, lavar un cultivo celular HNSCC con PBS estéril seguido de la adición de un mililitro de Tripsyn EDTA.

Después de tres minutos a 37 grados centígrados, detenga la reacción con medio de cultivo celular fresco y cuente las células. Diluir el cultivo a una vez 10 a la séptima celdas por mililitro y completar el medio de la línea celular parental. A continuación, añada 100 microlitros al tubo de Hoechst y verapamilo y cuatro mililitros de células al tubo de Hoechst.

A continuación, mezcle suavemente 10 microlitros de solución de clorhidrato de verapamilo de cinco milimolares en la muestra de Hoechst y Verapamilo, seguido de cinco microlitros de Hoechst por una vez 10 en las sextas celdas de ambos tubos. Luego cubra las muestras con papel de aluminio y colóquelas a 37 grados centígrados. Después de 90 minutos, con una mezcla suave, cada 15 minutos, centrifugar los tubos y volver a suspender los pellets en dos mililitros de PBS.

Después de una centrifugación central, resuspender el pellet de Hoechst y Verapamilo en 500 microlitros de yoduro de propidio en PBS y el pellet de Hoechst en cuatro mililitros del mismo. Ahora filtre las muestras a través de filtros de células de 70 micras en tubos FACS para eliminar cualquier agregado y coloque las muestras en hielo protegido de la luz. A continuación, cargue la muestra de Hoechst en el citómetro de flujo y abra la ventana Hoja de cálculo global en el software del citómetro de flujo.

Haga clic en Diagrama de puntos para crear un gráfico en la hoja de cálculo global y haga clic con el botón derecho para seleccionar los parámetros de dispersión hacia adelante y hacia los lados. Cree un diagrama de puntos de dispersión lateral de ancho por un diagrama de puntos de altura de dispersión lateral de la misma manera y, a continuación, haga clic en la puerta del polígono para crear una región P1 en el segundo gráfico para seleccionar las celdas individuales y discriminar los dobletes. A continuación, cree un área roja de Hoechst con un diagrama de puntos de área de Hoechst azul y haga clic con el botón derecho en las celdas para resaltar la población P1.

A continuación, cree una región P2 para seleccionar la población lateral negativa de células del colorante de Hoechst que aparece como un brazo lateral a la izquierda de la población principal de células y recopile 10.000 de los eventos de muestra de Hoechst. Para confirmar que la puerta P2 que representa la población lateral está colocada correctamente, recopile también 10.000 eventos de muestra de Hoechst y Verapamilo. La población lateral debería desaparecer.

A continuación, clasifique la población lateral de células negativas con colorante de Hoechst en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga un mililitro de medio completo de células madre cancerosas. Al final de la clasificación, gire las células hacia abajo y vuelva a suspender la bolita de población lateral en un mililitro de medio fresco de células madre cancerosas completas. A continuación, cuente las células y siembrójelas en el número adecuado en un nuevo matraz de cultivo celular.

Para seleccionar el subconjunto CD44-high/ALDH-high de las células de población lateral ordenadas, primero etiquete siete tubos cónicos estériles de 15 mililitros como se indica. A continuación, diluya las células clasificadas a una vez 10 por siete células por mililitro en medio de células madre y alícuotas 100 microlitros de células en los tubos CD44-APC e IGG1-APC sin teñir y cuatro mililitros de células en el tubo ALDH y CD44-APC, todo en hielo. Gire las células y vuelva a suspender los gránulos CD44-APC e IGG1-APC sin teñir en 100 microlitros de tampón uno del kit ALDEFLUOR.

A continuación, añada cinco microlitros del inhibidor de ALDH DEAB a los tubos de ALDH y DEAB y ALDH DEAB y CD44-APC. Vuelva a suspender las células del tubo de ALDH y CD44-APC en cuatro mililitros de reactivo C que contengan cuatro mililitros de tampón uno y 20 microlitros del reactivo del kit y transfiera inmediatamente 100 microlitros de estas células a los tubos ALDH, ALDH y DEAB, y ALDH DEAB y CD44-APC. A continuación, coloque todos los tubos en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 30 minutos, protegidos de la luz, mezclando las muestras después de 15 minutos mediante un suave vórtice.

Al final de la incubación, centrifugar todas las muestras y desechar los sobrenadantes. A continuación, coloque todos los tubos en hielo y vuelva a suspender el pellet de ALDH y CD44-APC en cuatro mililitros de tampón A, un pellet de CD44-APC y ALDH DEAB y CD44-APC en 100 microlitros del mismo. Vuelva a suspender el pellet de IGG1-APC en 100 microlitros de tampón B y los tubos de ALDH y ALDH y DEAB sin teñir en 100 microlitros de tampón uno.

Después de 10 minutos, vuelva a centrifugar todas las muestras y luego lavar con 1 mililitro de tampón uno para todas las muestras, excepto la muestra de ALDH y CD44-APC, que se lava con cuatro mililitros de tampón uno. Después de la segunda centrifugación, vuelva a suspender todos los gránulos en un mililitro de tampón uno fresco, excepto la muestra de ALDH y CD44-APC, que se resuspende en cuatro mililitros de tampón uno. Ahora cargue el tubo ALDH y CD44-APC en el citómetro de flujo y cree un diagrama de puntos APC por fitsy para visualizar la población doblemente teñida.

A continuación, cargue el tubo ALDH para crear una puerta para celdas altas de ALDH. Las células positivas deben desaparecer cuando se carga el tubo de ALDH y DEAB. En el mismo gráfico, cree una segunda puerta utilizando los tubos CD44-APC e IGG1-APC para seleccionar las celdas de CD44 de altura.

Las celdas positivas desaparecerán cuando se cargue el tubo IGG1-APC. A continuación, cargue los tubos ALDH y CD44-APC y ALDH DEAB y CD44-APC para crear una tercera puerta que incluya las celdas CD44 altas/ALDH altas. Utilice un tubo ALDH-CD44 de doble tinción para colocar la última puerta en las células dobles positivas.

A continuación, clasifique las células CD44-high/ALDH-high en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga un mililitro de medio completo de células madre cancerosas, recogiendo las células CD44-low/ALDH-low en un mililitro de medio de cultivo celular completo, según se desee. Después de la segunda clasificación, coloque las células CD44 altas/ALDH altas en un matraz de cultivo celular apropiado con medio completo de células madre cancerosas en la incubadora de cultivos celulares durante 18 a 24 horas. Cuando las células se hayan adherido al fondo del matraz, cambie el medio de cultivo y devuelva el matraz a la incubadora.

Para confirmar el potencial tumoral de las células CD44-high/ALDH-high, se tripsiniza la monocapa similar a un tallo canceroso como se ha demostrado para obtener una suspensión de una sola célula y transferir una vez 10 a las seis células a un tubo cónico de 15 mililitros. Después de centrifugar las células, vuelva a suspender el pellet en un medio sérico bajo suplementado con heparina y B27 del factor de crecimiento epidérmico humano recombinante e incube las células en una placa de Petri de anclaje bajo en la incubadora de cultivo celular hasta que se observen las esferas tumorales mediante microscopía óptica. Cuando la clasificación se realiza por primera vez en una nueva línea celular, es necesario confirmar el potencial tumoral de la línea celular, como lo demuestra su capacidad para formar esferas tumorales en un medio libre de suero in vitro.

Además, la QPCR debe demostrar una alta expresión de beta-catenina y otros marcadores de células madre por parte de las células CD44-high/ALDH-high. Las células CD44 altas/ALDH altas también deberían ser capaces de formar tumores in situ cuando se inyectan en cantidades bajas en comparación con las células CD44 bajas/ALDH bajas. Una vez dominado, cada clasificación de celdas debería poder completarse en cinco horas si se realizan correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar proteger las muestras marcadas con fluorocromo de la exposición directa a la luz. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los ensayos de migración por invasión, para responder preguntas adicionales sobre la participación de las células madre cancerosas en el proceso metastásico. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del cáncer exploraran los mecanismos de escape tumoral en el cáncer HNSCC.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células madre cancerosas de líneas celulares HNSCC mediante análisis multiparamétrico, citométrico de flujo y clasificación de células. No olvide que trabajar con células tumorales y agentes de ADN intercalados puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de una bata de laboratorio y guantes al realizar este procedimiento.