Name: Aislamiento y caracterización de un cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas subpoblaciones Tener madre Características de las células (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Aprenda a aislar células madre cancerosas de líneas de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello mediante citometría de flujo multiparamétrica. Este método permite identificar poblaciones CD44-altas/ALDH-altas para estudiar resistencia terapéutica.

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Agradecemos a Thibault Andrieu y Sebastien Dussurgey de la Plataforma de Citometría de Flujo de UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) por su asesoramiento y ayuda durante nuestra clasificación. Este trabajo se realizó en el marco científico de ETOILE y Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices locales en el cuidado de animales. Todos los detalles de este estudio fueron aprobados por el CECCAPP, un comité de ética francés. 1. La selección de un lado la población (SP) por el colorante Hoechst Ensayo de eflujo <ol><li> La tinción 50 millones de células con Hoechst 33342. <ol><li> Se preparan dos tubos de 15 ml estériles con un fondo cónico: un tubo etiquetado &quot;Hoechst&quot; y la otra &quot;Hoechst y verapamilo&quot;. Preparar 10 ml de solución de clorhidrato de verapamilo 5 mM en agua estéril. Preparar el medio de cultivo (CM) para las células madre. <ol><li> Para preparar CM para CSC (CM-CSC), se combinan los siguientes: medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM): F12 (1: 3, v: v), 5% de suero de ternera fetal (FCS), 0,04 mg / L de hidrocortisona , 100 U / ml de penicilina, 0,1 g / l de estreptomicina, y 20 g / l de factor de crecimiento epidérmico (EGFR). </li></ol></li><li> Bajo una campana de flujo laminar, trypsinize células. Retirar el medio, lavar con ssolución salina de fosfato tamponada terile (PBS) y se añade 1 ml de tripsina-EDTA (0,5 g / L) para un matraz de 75 cm². Incubar 3 minutos a 37 ° C. Detener la reacción mediante la adición de medio de cultivo utilizado para la línea celular parental. Contar el número de células utilizando un contador de células. <ol><li> Para preparar CM para la línea celular parental (CM-P), complementar DMEM con 10% de FCS, 0,4 mg / L de hidrocortisona, 100 U / ml de penicilina y 0,1 g / l de estreptomicina). </li></ol></li><li> Se diluye la suspensión celular obtenida en la etapa 1.1.2 para obtener 10 7 células / ml en CM-P. Dividir la suspensión de células en los 2 tubos preparados: poner 100 l (10 6 células) en el tubo &quot;Hoechst y verapamilo&quot; y 4 ml (4 x 10 7 células) en el tubo &quot;Hoechst&quot;. </li><li> En la muestra &quot;Hoechst y verapamilo&quot;, añadir 10 l de solución de clorhidrato de verapamilo 5 mM (concentración final: 0,5 mM) y mezclar suavemente. Añadir 5 l de 1 g / L solución de Hoechst (concentración final: 0,1 g / L). En la muestra &amp; #34; Hoechst &quot;, añadir 5 l de 1 g / L de solución por cada 10 6 células (200 totales l) Hoechst A partir de entonces, mantener las muestras protegidas de la exposición a la luz directa utilizando papel de aluminio.. </li><li> Incubar todos los tubos en un baño de agua a 37 ° C durante 1 hora y 30 minutos. Mezclar suavemente cada 15 minutos para evitar que las células se asiente. </li><li> tubos de centrifugación a 250 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender cada pellet con 2 ml de PBS 1x. </li><li> tubos de centrifugación a 250 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante. Resuspender &quot;Hoechst y verapamilo&quot; pellet en 500 l de 5 mg / L de yoduro de propidio (PI) diluido en tampón PBS y pellet &quot;Hoechst&quot; en 4 ml de 5 mg / L PI diluido en tampón PBS. </li><li> Transferencia de las soluciones de muestra a través de un filtro de 70 micras para eliminar los agregados de células y recoger células individuales en tubos para la absorción de la muestra en el citómetro de flujo. Mantener las muestras en hielo y proteger de la exposición a la luz directa utilizando papel de aluminio. </li></ol></li><li> yoconsuelos de la Población lateral Excluyendo colorante Hoechst por clasificación de células. <ol><li> Realizar Hoechst separación de células negativo en un clasificador de citometría de flujo con los siguientes parámetros: láser UV (355 nm), 2 detectores en el camino láser UV con Hoechst azul (450/50 BP) y Hoechst rojo (610/20 BP) filtros y 2 colectores. <ol><li> En primer lugar, analizar la muestra &quot;Hoechst&quot; que sirve como un control positivo para la tinción y citómetro de flujo configuración. </li><li> Usando el software citómetro, en la ventana &quot;Hoja de trabajo global&quot;, haga clic en &quot;Dot Plot&quot; (quinta arriba imagen de la derecha) y crear un gráfico en la hoja de trabajo global. En la ordenada, con un clic derecho, seleccione FSC-A (dispersión hacia adelante) y en abscisas, SSC-A (dispersión lateral) (Figura 1A). De la misma manera, crear un SSC-W frente gráfico de puntos SCC-H. En este segundo gráfico de puntos, para crear una región P1, haga clic en &quot;puerta Polígono&quot; (XIV arriba imagen de la derecha) (Figura 1B) 33. Nota: La región P1abarcar las células individuales y discriminar dobletes. </li><li> Opcional: Excluir PI células positivas mediante la creación de una EVE-A frente PI cerrada en P1. En este gráfico de puntos, seleccione la población negativa PI (P2) para excluir las células muertas de PI positivas. </li><li> Usando el software citómetro, en la ventana &quot;Hoja de trabajo global&quot;, haga clic en &quot;Dot Plot&quot; y crear un gráfico en la hoja de trabajo global. En la ordenada, con un clic derecho, seleccione azul Hoechst-A y el eje de abscisas, rojo Hoechst-A. Con un clic derecho sobre la población, seleccione &quot;Mostrar población&quot; y P1. En esta gráfica de puntos, crear una región (P2) para seleccionar las células Hoechst población lado tinte negativo (SP) que aparece como un brazo lateral de la izquierda de la población principal de las células (Figura 1C). </li></ol></li><li> Analizar la muestra &quot;Hoechst&quot; y recoger 10.000 eventos. Para asegurarse de que la puerta P2, que representa la población SP, está bien posicionado, analizar la muestra &quot;Hoechst y verapamilo&quot; (10.000 eventos)para observar la desaparición de la población SP (Figura 1D). </li><li> Recoger las células negativas de colorante Hoechst SP en un tubo de 15 ml que contiene 1 ml de CM-CSC preparados en 1.1.1.1. </li><li> Al final de la clasificación de células, se centrifuga la suspensión de células a 250 xg durante 5 min, eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet con 1 ml de CM-CSC. Contar el número de células clasificadas utilizando un contador de células y la transferencia del número apropiado de células para un frasco de cultivo (véase la Tabla 1). Añadir CM-CSC y se incuba a 37 ° C y 5% CO 2 atmósfera. </li><li> Mantener células en cultivo en las mismas condiciones para un máximo de 2 pasajes hasta que haya un mínimo de 5 x 10 7 células (véase el paso 3, &quot;método de cultivo celular&quot;). </li></ol></li></ol> 2. Selección de la alta / alta ALDH subpoblación CD44 en el lateral Población Ordenada <ol><li> La tinción de 50 millones de células SP con el kit de detección de ALDH y CD44 anticuerpo. <ol><li> Preparar siete 15 ml tubos estériles etiquetados como sigue: &quot;no teñida&quot; (Tubo a), &quot;CD44-APC&quot; (Tubo b), &quot;IgG1-APC&quot; (Tubo c), &quot;ALDH&quot; (Tubo d), &quot;ALDH y DEAB &quot;(tubo e),&quot; ALDH y CD44-APC &quot;(tubo f),&quot; ALDH, DEAB y CD44-APC &quot;(tubo g). Mantenga todos los tubos y reactivos a 4 ° C durante la tinción. </li><li> Preparar el tampón A con 4,5 ml del tampón 1 (contenido en el kit) y 45 l de CD44-APC (aloficocianina) anticuerpo (dilución 1: 100). Preparar tampón B con 100 l de tampón 1 y 1 l de anticuerpo IgG1-APC (dilución 1: 100). Preparar el tampón C con 4 ml de tampón 1 y 20 l de reactivo del kit. </li><li> Preparar una suspensión celular de las células previamente ordenados (paso 1.2.5) a 10 7 células / ml. Añadir 100 ml (10 6 células) de la suspensión celular a tubos de a, b y c, y 4 ml (4 x 10 7 células) a f tubo. Por el momento no poner las células en tubos d, e y g. </li><li> Centrifugar los tubos que contienen las células a 250 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender los gránulos en tubos A, B y C en 100 l de tampón 1. Añadir 5 l de diethylaminobenzaldehyde (DEAB), un inhibidor de ALDH de tubos e y g. <ol><li> Resuspender las células en tubo de f con 4 ml de reactivo C e inmediatamente se transfieren 100 l en tubos d, e y g. Incubar todos los tubos en un baño de agua a 37 ° C durante 30 min y proteger de la exposición a la luz directa utilizando papel de aluminio. Mezclar la suspensión de células suavemente mediante agitación con vórtex después de 15 min a evitar que las células de sedimentación. </li></ol></li><li> A partir de este momento, mantener los tubos en hielo y protegido de la luz directa utilizando papel de aluminio. Centrifugar los tubos a 250 xg durante 5 min a 4 ° C y se elimina el sobrenadante. </li><li> f tubo de volver a suspender en 4 ml y tubos by g con 100 l de tampón A. Se resuspenden tubo C con 100 l de tampón B. Para los otros tubos, añadir 100 l de tampón 1. Incubar 10 min a 4 °;DO. </li><li> Centrifugar los tubos a 250 xg durante 5 min a 4 ° C y se elimina el sobrenadante. Enjuagar una vez con 1 ml de tampón 1 (4 ml para tubo f) y centrifugar de nuevo a 250 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender tubo f sedimento en 4 ml y todos los otros tubos en 1 ml de tampón 1. </li><li> La transferencia de las soluciones de muestra a través de 70 coladores celulares micras para eliminar los agregados y recoger las células individuales en tubos apropiados para la absorción de la muestra en el citómetro de flujo. </li></ol></li><li> El aislamiento de la CD44 alta ALDH alta célula Población / fluorescencia por clasificación de células activadas. <ol><li> Realizar CD44 de alta / ALDH alta clasificación de células en un clasificador de citometría de flujo con los siguientes parámetros: láser azul (488 nm) y el láser rojo (633 nm), 1 detector en la trayectoria de láser azul con un filtro FITC (530/30), 1 detector en la trayectoria del láser rojo con un filtro de APC (660/20) y 2 colectores. </li><li> Usando el software citómetro, haga clic en &quot;Dot Plot &quot;(la quinta imagen superior derecha) para crear una FSC-A frente a SSC-Un gráfico de puntos como se describe en la sección 1.2.1.2, para comprobar la morfología celular y seleccionar una población compuesta de células individuales con un SSC-W frente a SSC-H Gráfica de puntos. </li><li> Usando el software citómetro, en la ventana &quot;Hoja de trabajo global&quot;, haga clic en &quot;Dot Plot&quot; y crear un gráfico en la hoja de trabajo global. En la ordenada, con un clic derecho, seleccione APC-A y el eje de abscisas, FITC-A con el fin de seleccionar la población doble de colores. Crear una puerta utilizando tubos D y E para seleccionar pilas de gran ALDH (Figura 2A). Nota: Las células positivas desaparecen en el tubo e tratado con DEAB (Figura 2B). <ol><li> En el mismo gráfico, crear una segunda puerta utilizando tubos B y C en el fin de seleccionar las células CD44 altas (Figura 2C y 2D). Las células positivas desaparecen en el tubo que contiene IgG1-APC. Analizar tubos F y G y crear una tercera puerta que incluye CD44 alta / ALDH &lt;sup&gt; pilas de gran (Figura 2e y 2F). Nota: Si las células positivas están presentes en el tubo que contiene IgG1-APC (Figura 2D), la interacción entre las células y el anticuerpo teñido con APC no es específico. </li></ol></li><li> Recoger CD44 de alta / ALDH pilas de gran en un tubo de 15 ml que contiene 1 ml de CM-CSC. Recoge también CD44 baja / ALDH baja en un tubo de 15 ml que contenía 1 ml de CM 19. Nota: Preparar CM-CSC como se describe en el paso 1.1.1.1. </li><li> Centrifugar la suspensión celular a 250 xg durante 5 min, eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet con 1 ml de CM-CSC. Contar el número de células clasificadas. </li></ol></li></ol> 3. Método de Cultivo Celular <ol><li> Después de la doble clasificación de las células como se describió anteriormente, la placa de las células clasificadas en un matraz de cultivo apropiado (Tabla 1) con CM-CSC a 37 ° C con 5% de CO 2. Después de 18-24 horas,comprobar si se han adherido las células y cambiar el medio de cultivo. Cambiar el medio de cultivo cada 3 días hasta que las colonias en expansión son mayores que 50% de confluencia. </li><li> Usa el volumen apropiado de tripsina 0,5 g / L - EDTA (Tabla 1) para trypsinize células del matraz de cultivo. Se incuban las células 3-5 min a 37 ° C. Añadir el volumen apropiado de CM-CSC (Tabla 1) para detener la acción de la tripsina. </li><li> Contar el número de células obtenidas y la placa 4 x 10 5 células en un frasco de cultivo de 175 cm² con CM-CSC. Se incuba a 37 ° C y 5% de CO2. A esta concentración, las células con un tiempo de duplicación de 24 horas será el 70% de confluencia en 7 días. </li><li> Utilice los CAC como in vitro o in vivo los experimentos antes de que hayan sido sometidos a 3 pasajes. </li></ol> 4. La confirmación del potencial y las características del tumor CSC <ol><li> Esfera Formación de tumores para confirmar el potencial del tumor de la alta CD44 / ALDHaltos células. <ol><li> Trypsinize células como se describe en 3.2. Añadir 1 x 10 6 células a un tubo de 15 ml y centrifugar a 250 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en un DMEM: F12 (3: 1) FCS medio libre, 20 ng / ml de EGFhr, 4 mg / l de heparina y 1x B27. Se incuban las células en un matraz de cultivo de 6 pocillos bajo placas de anclaje a 37 ° C y 5% de CO 2. Nota: El uso DMEM: F12 (3: 1) medio que contiene 5% de FCS, 20 ng / ml de EGFhr, 4 mg / L de heparina y 1x B27 si la celda no crecen sin FCS. </li><li> Observar la formación esfera tumor con un microscopio óptico de 4 a 10 días después de la siembra (Figura 3A). Nota: El tumor diámetro de la esfera debe ser mayor de 35 micras. Las células CD44 altas / ALDH altos mostrarán una formación de esferas tumoral más rápido y más mejorada en términos de número y tamaño en comparación con CD44 baja baja / ALDH. </li></ol></li><li> Evaluación de la tumorigenicidad in vivo DespuésLa inyección subcutánea de CD44 altas altas células / ALDH en ratones NOD-SCID. <ol><li> Después de la clasificación, las células re-suspender en PBS a tres concentraciones diferentes (10 4 células / ml, 10 5 células / ml, y 10 6 células / ml). Inyectar por vía subcutánea 100 l de 10 4 células / ml (10 3 células) en la región del flanco derecho de 6 ratones. Haga lo mismo con 10 5 células / ml (10 4 células), y 10 6 células / ml (10 5 células). Nota: Bajo la dilución de 10 3 células pueden ser probados. </li><li> Se inyecta la misma concentración de células CD44 / ALDH bajas bajas en la región del flanco izquierdo. Seguir los ratones inyectados por hasta 10 semanas para ver la progresión del tumor 19. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe un método fiable para el aislamiento con éxito de células madre cancerosas de una línea celular específica que es aplicable a otras líneas celulares HNSCC. Aislado CSC cabeza y cuello son entonces adecuado para la caracterización molecular más in vitro y validación funcional de trasplante en ratones inmunodeficientes 19. Sin embargo, algunas modificaciones pueden ser probados en función de la población lado o los de alta / ALDH altos porcentajes de CD44 p...

Cabeza y cuello carcinoma de células escamosas (HNSCC) es una enfermedad común en todo el mundo ya pesar de los avances en los tratamientos actuales, los pacientes con enfermedad avanzada tienen un mal pronóstico. La tasa de supervivencia 5 años general del paciente es de alrededor de 30% a pesar de la combinación de enfoques terapéuticos que incluyen la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia-terapias dirigidas. Estudios recientes atribuyen recurrencia local y metástasis a distancia para la supervivencia de las células madre, como el cáncer (CSC) siguiendo las terapias contra el cáncer 1. Hay evidencia acumulada apoya la existencia de células que presentan propiedades de células madre (capacidades de estado indiferenciado, auto-renovación y la diferenciación, y la actividad telomerasa) en diversos tumores sólidos incluyendo cáncer de mama, cerebro, próstata, pulmón, colon, páncreas, hígado y piel 2- 10. Sin embargo, el origen de los CAC no está claro 11,12. Ellos pueden ser el resultado de la transformación maligna de las células madre normales o 3,13 dedifferenciación de las células tumorales que adquieren características CSC-como 14,15. Por lo tanto, la comprensión de las vías de distintivos relacionados con CSC proporcionará información sobre el diagnóstico y el tratamiento de HNSCC resistente temprano. Se ha propuesto que los CAC también poseen fenotipos resistentes que evaden la quimioterapia y la radioterapia estándar, lo que resulta en la recaída del tumor en comparación con la mayor parte de las células tumorales 16-19 y se localizan en hipóxica nichos 20. Se han propuesto numerosos factores para explicar estas resistencias de células madre cancerosas, tales como propensión a la inactividad, mejorado de reparación del ADN, hasta reguladas mecanismos de control del ciclo celular, y la eliminación de radicales libres 21. Por otra parte, varias vías moleculares oncogénicas pueden activarse específicamente en los CAC 17. Con el fin de mejorar el conocimiento de los CAC para terapias selectivas, necesitamos métodos fiables para la identificación y aislamiento de células madre cancerosas, debido a la heterogeneidad de los marcadores relacionados con las células madre envarios tipos de cánceres. 22 En CECC, tallo-como las células iniciadoras de tumores han sido aislados de tumores de pacientes primaria clasificar células que expresan diferentes biomarcadores CSC (tales como transportadores de eflujo de fármaco expresión 23, CD44 alta, baja CD24 CD133 alta, c-Met + 10,24 fenotipo, 25, o una alta actividad de ALDH 26) o el cultivo de tumor primario del paciente para formar squamospheres que tienen propiedades CSC. Sin embargo, el número de squamospheres disminuye drásticamente después de dos pasos, dando así un tamaño pequeño de la muestra para una caracterización adicional estudia 27. Por lo tanto, los ensayos in vitro a partir de líneas celulares bien establecidas es una solución más fácil de diseñar experimentos con el fin de mejorar el conocimiento de los CAC. El objetivo de este artículo es proponer un método para aislar células madre cancerosas a partir de líneas celulares HNSCC utilizando el análisis de citometría de flujo multiparamétrica unand clasificación de células. La expresión de CD44 en correlación con varias propiedades CSC incluyendo la actividad de ALDH, Side Población (SP) fenotipo, la capacidad y la formación de esferoides tumorigenicidad se utilizan para aislar y caracterizar esta subpoblación de células madre cancerosas. CD44, una glicoproteína de superficie celular, está implicada en la adhesión celular y la migración. CD44 se expresa altamente en muchos tumores sólidos los CAC 28, incluso en modelos de cáncer de cabeza y cuello 29-31. Por otra parte, las células CD44 altas pueden generar in vivo un tumor heterogéneo mientras que las células CD44 bajas no pueden 10. El ensayo SP se basa en el potencial diferencial de las células para flujo de salida el colorante Hoechst 22 a través de la familia de casete de unión a ATP (ABC) de proteínas transportadoras sobreexpresados ​​dentro de la membrana CSC. Este ensayo incluye el uso de inhibidores del transportador ABC como verapamilo en muestras de control. Aldehído deshidrogenasa (ALDH) es una enzima intracelular que está implicada en la conversión de retinol a retácido inoic durante la diferenciación de células madre al comienzo 25,26. Las células que presentan actividad muestran el comportamiento de células madre similares a alta ALDH en HNSCC 26 y un número muy limitado de células de alta ALDH son capaces de generar tumores in vivo 26,32. La combinación de estos marcadores y propiedades se utilizó con éxito por Bertrand e t al. Para estudiar la resistencia in vitro e in vivo de estas células madre cancerosas a la radiación de fotones y 19 de iones de carbono. Sus resultados mostraron claramente que la combinación de varios marcadores de células y las propiedades son más selectivos para los estudios útiles en poblaciones CECC CSC que los enfoques de un solo marcador.

<table><tbody><tr><td>Suero de becerro fetal Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona soluble en agua</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina 100x</td><td>Dominique Dutscher</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>F12 Mezcla de nueces (1x) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td>La solución debe prepararse justo antes de usarla porque es muy inestable</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>StemcellTM Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50x), menos vitamina A</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>Corrosivo, toxicidad aguda (oral, dérmica, inhalación) categoría 4</td></tr><tr><td>Clorhidrato de</td> <td>verapamiloSigma-Aldrich</td><td>V-4629</td><td>Toxicidad aguda (oral, dérmica, inhalación) categoría 3</td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Toxicidad aguda (oral, dérmica, inhalación) categoría 4</td></tr><tr><td>ALDEFLUOR Kit</td><td>Stem Cell</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>CD44-APC, anticuerpo humano</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-095-177</td><td></td></tr><tr><td>IgG1-APC, anticuerpo humano</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-189</td><td></td></tr><tr><td>Z1 coulter partícula</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio óptico</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>Línea celular CKX31</td><td></td></tr><tr><td>SQ20B</td><td>Regalo de John Little' s</td> <td>Laboratorio-Línea</td><td></td></tr> <tr><td>celular FaDu</td><td>ATCC</td><td>HTB-43</td><td></td></tr><tr><td>Placas de bajo anclaje</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>145383</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva software v8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y caracterización de un cabeza y cuello carcinoma de células escamosas subpoblaciones tener madre características de las células

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

A pesar de los avances en la comprensión de la cabeza y el cuello carcinomas de células escamosas (HNSCC) la progresión, la tasa de supervivencia de cinco años sigue siendo baja debido a la recurrencia local y metástasis a distancia. Una hipótesis para explicar esta recurrencia es la presencia de células madre, como el cáncer (CSC) que presentan la quimio y la radio inherente resistencia. Con el fin de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas, es necesario disponer de modelos experimentales que validan la eficacia de los tratamientos específicos y, por tanto, disponer de métodos fiables para la identificación y aislamiento de células madre cancerosas. Con este fin, se presenta un protocolo para el aislamiento de células madre cancerosas de las líneas celulares HNSCC humanos que se basa en la combinación de dos granulometrías sucesivas de células realizadas por células activadas por fluorescencia (FACS). El primero de ellos se basa en la propiedad de los CAC a sobreexpresan ATP vinculante cassette (ABC) transportador de proteínas y por lo tanto excluye, entre otros, los tintes de ADN vitales tales como Hoechst 33342. Las células clasificadas con THSe método se identifica como una &quot;población lado&quot; (SP). A medida que las células SP representan un porcentaje bajo (&lt;5%) de las células parentales, es necesario una fase de crecimiento con el fin de aumentar su número antes de la segunda clasificación de células. El siguiente paso permite la selección de células que poseen otras dos características de células madre HNSCC, es decir, alto nivel de expresión del marcador de superficie celular CD44 (CD44 alta) y la sobreexpresión de aldehído deshidrogenasa (ALDH alto). Dado que el uso de un único marcador tiene numerosas limitaciones y dificultades para el aislamiento de células madre cancerosas, la combinación de SP, CD44 y marcadores ALDH proporcionarán una herramienta útil para aislar células madre cancerosas para más ensayos analíticos y funcionales que requieren células viables. Las características madre-como de los CAC fue finalmente validadas in vitro mediante la formación de tumorispheres y la expresión de β-catenina.

El aislamiento de células madre cancerosas a partir de líneas celulares HNSCC requiere dos ordenación sucesiva debido a la muy bajo porcentaje de células madre cancerosas en la línea celular de sus padres. La primera clasificación se basa en la capacidad de CSC para excluir el colorante Hoechst debido a transportadores de eflujo de fármacos. Esto dio como resultado la adquisición de 1-5% de la población celular total ordenado (Figura 1). Durante el colorante Hoechst clas...

Comprender el papel de las células madre cancerosas en la recurrencia tumoral y la resistencia a las terapias se ha convertido en un tema de gran interés en la última década. Este artículo describe el aislamiento y caracterización de la subpoblación de células madre cancerosas de líneas celulares de carcinoma escamoso de cabeza y cuello (HNSCC).

Aislamiento y caracterización de un cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas subpoblaciones Tener madre Características de las células

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar células madre cancerosas del carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello o líneas celulares de CCECC. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del tratamiento del cáncer sobre cómo utilizar la quimioterapia para superar la radiorresistencia tumoral. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza una combinación de marcadores para lograr una alta especificidad en las células madre cancerosas provenientes de líneas celulares de CCECC.El procedimiento será demostrado por Prescillia Battiston-Montagne, nuestra técnica, y Marion Gilormini, doctoranda de mi laboratorio. Para seleccionar una población lateral de células con características de células madre cancerosas mediante el ensayo de expulsión del colorante Hoechst, primero etiquete un tubo cónico como Hoechst y otro como Hoechst y Verapamilo. A continuación, lave un cultivo celular de CHCNC con PBS estéril, seguido por la adición de un mililitro de tripsina-EDTA.Después de tres minutos a 37 grados Celsius, detenga la reacción con medio fresco de cultivo celular y cuente las células. Diluya el cultivo hasta una concentración de un por diez elevado a la séptima células por mililitro y complete con medio de la línea celular parental. A continuación, agregue 100 microlitros al tubo de Hoechst y Verapamilo y cuatro mililitros de células al tubo de Hoechst.A continuación, mezcle suavemente 10 microlitros de una solución de clorhidrato de verapamilo cinco milimolar en la muestra de Hoechst y verapamilo, seguido de cinco microlitros de Hoechst por una vez 10 a la sexta células en ambos tubos. Luego, cubra las muestras con papel de aluminio y colóquelas a 37 grados Celsius. Después de 90 minutos, con mezcla suave cada 15 minutos, centrifugue los tubos y resuspenda los pellets en dos mililitros de PBS.Después de una centrifugación centrífuga, reponer el sedimento de Hoechst y Verapamilo en 500 microlitros de yoduro de propidio en PBS y el sedimento de Hoechst en cuatro mililitros del mismo. A continuación, filtrar las muestras a través de filtros celulares de 70 micrones hacia tubos FACS para eliminar cualquier agregado y colocar las muestras en hielo protegidas de la luz. Luego, cargar la muestra de Hoechst en el citómetro de flujo y abrir la ventana Hoja de trabajo global en el software del citómetro de flujo.Haga clic en Gráfico de puntos para crear un gráfico en la Hoja de trabajo global y haga clic con el botón derecho para seleccionar los parámetros de dispersión directa y lateral. Cree un gráfico de puntos de dispersión lateral amplia frente a altura de dispersión lateral de la misma manera, luego haga clic en la herramienta de puerta poligonal para crear una región P1 en el segundo gráfico con el fin de seleccionar las células individuales y discriminar los dobletes. A continuación, cree un gráfico de puntos de área de Hoechst rojo frente a área de Hoechst azul y haga clic con el botón derecho en las células para resaltar la población P1.Luego, cree una región P2 para seleccionar la población lateral negativa para el colorante Hoechst, que aparece como un brazo lateral a la izquierda de la población principal de células, y recolecte 10.000 eventos de la muestra con Hoechst. Para confirmar que la compuerta P2 que representa la población lateral está posicionada correctamente, recolecte también 10.000 eventos de la muestra con Hoechst y Verapamilo. La población lateral debería desaparecer.Luego, separe la población lateral de células negativas para el colorante Hoechst en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga un mililitro de medio completo para células semejantes a células madre cancerosas. Al finalizar la separación, centrifugue las células y re suspenda el botón de la población lateral en un mililitro de medio completo fresco para células semejantes a células madre cancerosas. A continuación, cuente las células y siembre la cantidad adecuada en un nuevo frasco de cultivo celular.Para seleccionar el subconjunto CD44-alto/ALDH-alto a partir de las células de la población lateral ordenadas, primero etiquete siete tubos cónicos estériles de 15 mililitros según se indica. A continuación, diluya las células ordenadas hasta una concentración de uno por diez a la siete células por mililitro en medio para células madre y alícuota 100 microlitros de células en los tubos CD44-APC sin tinción y IGG1-APC, y cuatro mililitros de células en el tubo ALDH y CD44-APC, todo sobre hielo. Centrifugue las células y re suspenda los precipitados de los tubos CD44-APC sin tinción e IGG1-APC en 100 microlitros del tampón uno del kit ALDEFLUOR.Luego, agregue cinco microlitros del inhibidor de ALDH DEAB a los tubos de ALDH y DEAB, ALDH DEAB y CD44-APC. Resuspenda las células del tubo de ALDH y CD44-APC en cuatro mililitros del reactivo C que contiene cuatro mililitros del tampón uno y 20 microlitros del reactivo del kit, y transfiera inmediatamente 100 microlitros de estas células a los tubos de ALDH, ALDH y DEAB, y ALDH DEAB y CD44-APC. A continuación, coloque todos los tubos en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 30 minutos, protegidos de la luz, mezclando las muestras a los 15 minutos mediante vortex suave.Al finalizar la incubación, centrifugar todas las muestras y desechar los sobrenadantes. Luego colocar todos los tubos en hielo y resuspender el sedimento de ALDH y CD44-APC en cuatro mililitros de tampón A, y los sedimentos de CD44-APC y ALDH DEAB y CD44-APC en 100 microlitros del mismo. Resuspender el sedimento de IGG1-APC en 100 microlitros de tampón B y los tubos sin teñir de ALDH y ALDH y DEAB en 100 microlitros del tampón uno.Después de 10 minutos, centrifugar nuevamente todas las muestras seguido de un lavado con 1 mililitro de tampón uno para todas las muestras excepto la muestra de ALDH y CD44-APC, la cual se lava con 4 mililitros de tampón uno. Después de la segunda centrifugación, resuspender todos los precipitados en 1 mililitro de tampón uno fresco, excepto la muestra de ALDH y CD44-APC, que se resuspende en 4 mililitros de tampón uno. Ahora cargar el tubo de ALDH y CD44-APC en el citómetro de flujo y crear un gráfico de puntos de APC frente a fitsy para visualizar la población doblemente marcada.A continuación, cargue el tubo de ALDH para crear una compuerta para células con alta expresión de ALDH. Las células positivas deben desaparecer al cargar el tubo de ALDH y DEAB. En el mismo gráfico, cree una segunda compuerta utilizando los tubos CD44-APC e IGG1-APC para seleccionar las células con alta expresión de CD44.Las células positivas desaparecerán cuando se cargue el tubo IGG1-APC. A continuación, cargue los tubos ALDH y CD44-APC, y ALDH DEAB y CD44-APC para crear una tercera compuerta que incluya las células CD44-alta/ALDH-alta. Utilice el tubo de doble tinción ALDH-CD44 para colocar la última compuerta sobre las células doble positivas.Luego, separen las células CD44-alta/ALDH-alta en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga un mililitro de medio completo para células semejantes a células madre cancerosas, recolectando las células CD44-baja/ALDH-baja en un mililitro de medio completo para cultivo celular según se desee. Después de la segunda separación, siemen las células CD44-alta/ALDH-alta en un frasco de cultivo celular adecuado con medio completo para células semejantes a células madre cancerosas en el incubador de cultivo celular durante 18 a 24 horas. Cuando las células se hayan adherido al fondo del frasco, cambien el medio de cultivo y devuelvan el frasco al incubador.Para confirmar el potencial tumoral de las células CD44-alto/ALDH-alto, realice la tripsinización de la monocapa de células semejantes a células madre cancerosas según se ha demostrado para obtener una suspensión unicelular y transfiera un vez 10 a la seis células a un tubo cónico de 15 mililitros. Después de centrifugar las células, re suspenda el sedimento en medio con bajo contenido de suero suplementado con factor de crecimiento epidérmico recombinante humano, heparina y B27, e incube las células en una placa de Petri de baja adhesión dentro del incubador de cultivo celular hasta que se observen esferas tumorales mediante microscopía óptica. Cuando la clasificación se realiza por primera vez en una nueva línea celular, es necesario confirmar el potencial tumoral de la línea celular, evidenciado por su capacidad para formar esferas tumorales en medio libre de suero in vitro.Además, la PCR cuantitativa debe demostrar una alta expresión de beta-catenina y otros marcadores de células con características de células madre en las células CD44-alta/ALDH-alta. Las células CD44-alta/ALDH-alta también deben ser capaces de formar tumores in situ cuando se inyectan en cantidades bajas en comparación con las células CD44-baja/ALDH-baja. Una vez dominado el procedimiento, cada ordenación celular debe poder completarse en cinco horas si se realiza adecuadamente.Al realizar este procedimiento, es importante recordar proteger las muestras marcadas con fluorocromo de la exposición directa a la luz. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como ensayos de invasión y migración, para responder preguntas adicionales sobre la participación de las células madre cancerosas en el proceso metastásico. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del cáncer exploraran los mecanismos de escape tumoral en el cáncer de Cabeza y Cuello (HNSCC).Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células madre cancerosas de líneas celulares de CCHN mediante análisis citométrico de flujo multiparamétrico y clasificación celular. No olvide que trabajar con células tumorales y agentes intercalantes del ADN puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como usar bata de laboratorio y guantes, al realizar este procedimiento.

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Las células madre de cáncer de páncreas (CSC) pueden expandirse in vitro utilizando la técnica de cultivo de esfera independiente del anclaje, que representa una poderosa herramienta para estudiar la biología de las CSC y puede servir como primer paso para desarrollar nuevas terapias dirigidas a las CSC. Aquí se proporciona la metodología para expandir, analizar y dirigirse a las CSC pancreáticas.

El estudio de cáncer de páncreas Tallo Características de las células para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento

La presencia de células madre del cáncer (CSC) en sarcomas óseos se ha vinculado recientemente a su patogénesis. En este artículo, presentamos el aislamiento de células madre cancerosas a partir de cultivos celulares primarios obtenidos de biopsias humanas de osteosarcoma convencional (OS) utilizando la capacidad de las células madre cancerosas de crecer bajo condiciones no adherentes.

Establecimiento de Cultivos Celulares del Cáncer Humano de osteosarcoma convencional Tallo

Describimos un protocolo detallado para el aislamiento de células que inician tumores de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma humano mediante la clasificación celular activada por fluorescencia, utilizando el antígeno leucocito humano-1 (HLA-1) como marcador negativo, y para la validación y caracterización de estas células que inician tumores HLA-1 negativos.

Aislamiento y caracterización de células que inician tumores a partir de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma

Aquí presentamos un método reproducible para el desarrollo de un modelo Murino ortotópico de cabeza y cuello de células escamosas. Tumores demuestran clínicamente relevantes características histopatológicas de la enfermedad, como necrosis, pobre diferenciación, metástasis ganglios, infiltración inmune. Ratones con tumores síntomas clínicamente relevantes incluyendo disfagia, desplazamiento de la mandíbula y pérdida de peso.

Intramucosal inoculación de células escamosas células en ratones para perfilar inmune del Tumor y tratamiento evaluación de respuesta

Utilizando células epiteliales de próstata primarias humanas, informamos de un nuevo método libre de biomarcadores de caracterización funcional de células similares a tallos mediante un ensayo de retención de etiquetas basado en esferoides. Se describe un protocolo paso a paso para el etiquetado de celdas 2D BrdU, CFSE o Far Red; formación de esferoides tridimensionales; identificación celular similar a un tallo que retiene la etiqueta por inmunocitoquímica; y aislamiento por FACS.

Aislamiento de células similares a tallos de cultivos esferoides tridimensionales

Este protocolo experimental describe el aislamiento de BCSC a partir de muestras de células y tejidos de cáncer de mama, así como los ensayos in vitro e in vivo que se pueden utilizar para evaluar el fenotipo y la función de BCSC.

Aislamiento y evaluación funcional de células madre de cáncer de mama humano a partir de muestras de células y tejidos

Aprenda a aislar células madre cancerosas de líneas de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello mediante citometría de flujo multiparamétrica. Este método permite identificar poblaciones CD44-altas/ALDH-altas para estudiar resistencia terapéutica.

Aislamiento y caracterización de un cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas subpoblaciones Tener madre Características de las células (Video) | JoVE Journal

Aislamiento y caracterización de un cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas subpoblaciones Tener madre Características de las células

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